Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss pela ajuda na coordenação do estudo. O SEM foi realizado pela Universidade de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este projeto foi apoiado pelo NIH concede R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), Pilot and Viabilidade Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), RWO (RWO), Pilot and Viabilidade Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), (RWO), Pilot and Viasibility Grant do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), Piloto e Bolsa de Viabilidade do Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), RWO (RWO), Pilot Administração de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia eletrônica de varredura realizada pela Universidade de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. A figura 4 deste manuscrito foi originalmente publicada em Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; 1;102 de março (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, e foi reproduzido com permissão da Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obter permissão para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.

Os tecidos adiposos são adquiridos de seres humanos submetidos a cirurgia bariátrica eletiva aprovação do conselho de revisão institucional.
1. Isolamento preadipocito e preparação de reagente cultural
<ol><li>Prepare 2% de albumina séxo bovina (BSA) em solução soro sino-amortecida de fosfato 1x (PBS). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare a colagem tipo II: 2 mg/mL em 2% BSA em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar.</li>
	<li>Prepare o Glóbulo Verme...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

O modelo de cultura ECM-adipócito fornece uma ferramenta valiosa para dissecar os papéis individuais de ECM e células na dictação fenótipo de tecido final. O protocolo de isolamento de ECM é bastante reproduzível, mas a variabilidade no processo de descelularização pode ser observada. A etapa de delipiação do Dia 3 é um ponto crítico no protocolo. Na conclusão da extração durante a noite, a delipiação da matriz deve ser evidenciada pela Solução de Solvente Polar que fica amarela, enquanto a matriz de...

A matriz extracelular (ECM) não só fornece um andaime mecânico para os tecidos, mas também se envolve em crosstalk complexo com células que residem dentro dela, regulando diversos processos necessários para a homeostase de tecidos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, sinalização e metabolismo1. Enquanto ECM saudável desempenha um papel essencial na manutenção da função normal do tecido, ECM disfuncional tem sido implicado em múltiplas doenças2.
O tecido adiposo desempenha um papel importante na patogênese da doença metabólica. A obesidade está associada à hipertrofia adipócito excessiva e hipóxia celular, defeitos no metabolismo celular adipócito e reticulum endoplasmico do tecido adiposco e estresse oxidativo e inflamação. Embora mal compreendidos, esses processos complexos conspiram para prejudicar a capacidade de amortecimento de nutrientes do tecido adiposo, levando ao transbordamento de nutrientes do tecido adiposo, toxicidade em vários tecidos e doença metabólica sistêmica3,4 5. A seqüência de eventos e mecanismos específicos subjacentes à falha do tecido adiposo são mal compreendidas, mas alterações no tecido adipolado foram implicadas. A composição de ECM é alterada dentro do tecido adiposo na obesidade humana e murina, com maior deposição de proteína ECM, juntamente com diferenças bioquímicas qualitativas e estruturais no tecido adipoado associado à doença metabólica humana, incluindo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.
Apesar dessas observações, o papel do tecido adipoto na mediação da disfunção do tecido adiposo não é bem definido. Isto é em parte devido à falta de modelos experimentais tratáveis que permitem a dissecação dos papéis específicos da ECM e adipócitos na regulação da função final do tecido adiposo. A cultura ECM-adipócito simula melhor o ambiente in vivo do tecido adiposo nativo em pelo menos dois aspectos. Em primeiro lugar, a cultura ECM fornece um ambiente molecular semelhante ao tecido adiposo nativo, incluindo collagens nativas, elastinas e outras proteínas matrias ausentes na cultura 2D padrão. Em segundo lugar, a cultura em plástico 2D tem sido mostrado para alterar o metabolismo adipócito através de efeitos mecânicos devido à diminuição da elasticidade do substrato plástico12, que ECM-cultura elimina.
Métodos para engendrar andaimes biológicos por isolamento de ECM de adiposo descelularizado e outros tecidos têm sido estudados no contexto da medicina regenerativa e reconstrutiva e engenharia de tecidos13,14, 15,16,17,18. Publicamos anteriormente uma metodologia na qual adaptamos esses métodos para desenvolver um modelo 3D in vitro da cultura humana de ECM-adipócito, usando células-tronco ecm e adipócitos (preadipócitos) derivadas de tecidos adiposos viscerais humanos11. No presente artigo, descrevemos esses métodos em detalhes. O procedimento de descelularização para o tecido adiposo humano é um processo de quatro dias que envolve tratamentos mecânicos e enzimáticos para remover células e lipídios, deixando um andaime biológico que mantém características do tecido a partir do qual é derivado. O ECM descelularizado suporta a diferenciação adipogênica de preadipócitos humanos, e quando reconstituído com adipócitos, mantém microarquitetura e características bioquímicas e específicas da doença do tecido adiposo intacto e se envolve em funções características do tecido adiposo nativo. Esta matriz pode ser estudada isoladamente ou resemada com células, permitindo o estudo das interações e a transação cruzada entre os componentes celulares e extracelulares do tecido adiposo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel central na regulação da homeostase dos tecidos, envolvendo-se em crosstalk com as células e regulando múltiplos aspectos da função celular. O ECM desempenha um papel particularmente importante na função do tecido adiposo na obesidade, e alterações na deposição e composição de ECM do tecido adipoto estão associadas à doença metabólica em camundongos e humanos. Modelos in vitro tratáveis que permitem a dissecação dos papéis do ECM e células em contribuir para o fenótipo global de tecidos são escassos. Descrevemos um novo modelo 3D in vitro da cultura humana ECM-adipócito que permite o estudo dos papéis específicos do ECM e adipócitos na regulação do fenótipo metabólico do tecido adiposo. O tecido adiposo humano é decelularizado para isolar o ECM, que é posteriormente repovoado com preadipócitos que são então diferenciados dentro do ECM em adipócitos maduros. Este método cria construções de ECM-adipócitoque são metabolicamente ativas e retêm características dos tecidos e pacientes dos quais são derivados. Usamos este sistema para demonstrar o crosstalk ecm-adipócito específico da doença no tecido adiposo humano. Este modelo de cultura fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo global e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase do tecido adiposo.

A preparação do tecido adipolado ECM, a semeade com preadipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros resultam em claras mudanças morfológicas sequenciais no tecido que permitem a avaliação visual do progresso em todo o protocolo (Figura 1) . Preadipocitos usados para semeacar o ECM são isolados usando digestão colagem de amostras separadas de IVA (Figura 2). A microscopia eletrônica de varredura de cons...

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A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Descrevemos um sistema de cultura in vitro de matriz extracelular em 3D que permite a dissecação dos papéis da matriz e dos adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo.

Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Nosso protocolo demonstra que o ECM pode promover a diferenciação adipogênica na ausência de mediadores adipogênicos clássicos e é o primeiro a demonstrar a regulação específica da doença do metabolismo celular pelo ECM. Nossa técnica fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos no metabolismo tecidual adiposo e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase tecidual. Em comparação com a cultura celular 2D padrão, nosso modelo 3D permite um exame mais robusto e dissecção de conversa cruzada entre adipócitos e ECM tecidual no contexto do diabetes tipo 2.Recomendamos começar com amostras menores para medir o quão bem é celularizado. Tenha em mente que há variabilidade interpata em como as células crescem bem e quão bem o tecido se descelulariza. É importante observar o tecido antes e depois de cada passo para garantir que o tecido esteja se descelularizado e entender possíveis diferenças entre as amostras.Após a obtenção de tecido adiposo visceral ou IVA da cirurgia, prepare-o para armazenamento adicionando 5-10 gramas do tecido a 15-25 mililitros de solução tampão congelante em um tubo cônico de 50 mililitros. Mergulhe completamente a amostra e armazene-a a menos 80 graus Celsius até a descelularização. Para o isolamento pré-iadipócito, coloque dois gramas de uma amostra fresca de IVA intacto em 20 mililitros de solução tipo II de colagem, em seguida, insira uma tesoura estéril no tubo e pique completamente o tecido.Uma vez picado a um chorume fino, incuba-o na solução de colagemnase a 37 graus Celsius em um agitador orbital por 60 minutos. Após a incubação, filtre o resultante digerido através de uma malha de nylon de 100 micrômetros em um tubo cônico fresco de 50 mililitros. O digerido deve ser um líquido amarelo-laranja com viscosidade moderada e uma pequena quantidade de fios residuais de tecido não digerido.Centrifugar a amostra a 270 vezes g por 10 minutos, remover o supernasal e resuspensar a pelota celular em dois mililitros de solução 1X RBC com uma pipeta. Incubar a solução por um minuto a 25 graus Celsius, depois adicionar 10 mililitros de 15% FBS DMEM F12 e centrifuá-la a 270 vezes g por 10 minutos. Para preparar o ECM, congele/descongele a amostra de IVA previamente congelada a 37 graus Celsius, incubando-a em um banho de água pré-aquecido por 20 minutos com agitação manual suave periódica.Uma vez descongelado, transfira o tecido de volta para menos 80 graus Celsius por 20 minutos e repita o processo de congelamento/degelo três vezes terminando com o descongelamento. Use fórceps estéreis para transferir a amostra do IVA para um tubo cônico fresco de 50 mililitros contendo 15-25 mililitros de solução enzimática 1 certificando-se de que a amostra está totalmente imersa. Em seguida, incuba-lo durante a noite a 37 graus Celsius enquanto treme a 130 RPM.No dia seguinte, lave a amostra três vezes com 15-25 mililitros de solução tampão de lavagem, derramando a solução após cada lavagem. Transfira a amostra para um tubo fresco de 50 mililitros com 15-25 mililitros de solução enzimática 2 e incuba-a durante a noite. Repita as lavagens com a solução de tampão de lavagem e transfira a amostra para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução de extração de solvente polar.Incubar a amostra durante a noite enquanto treme. Após a incubação com a solução de solvente polar, é importante examinar a amostra para remoção lipídica. Se a maioria do lipídio não for removida, pode ser necessário repetir esta etapa.Pode-se usar um tempo de incubação mais curto. Após a incubação, transfira a amostra para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução tampão de lavagem e lave a amostra três vezes no shaker. Em seguida, lave a amostra três vezes com solução de 70% de etanol, derramando o etanol após cada lavagem.Lave a amostra uma vez com a solução de armazenamento e use fórceps estéreis para transferir para um tubo fresco contendo 15-25 mililitros de solução de armazenamento, certificando-se de imergi-la completamente. A amostra pode então ser armazenada a quatro graus Celsius por até um mês. O isopropanol e o etanol são inflamáveis e devem estar em temperatura ambiente e descartados em resíduos inflamáveis.Qualquer resíduo humano deve ser descartado separadamente dos resíduos de risco biológico usuais. Transfira os fragmentos de ECM armazenados para poços individuais de uma placa de 24 poços com fórceps estéreis adicionando quantos fragmentos necessários para os ensaios planejados a jusante. Lave-os três vezes com 500 microlitadores de 70% de etanol em um agitador orbital, depois reidrate-os lavando-os três vezes com PBS.Use uma tesoura estéril para cortar o ECM em fragmentos de 100 miligramas. Coloque cada fragmento em um poço de uma placa de 24 poços e incubar a placa a 25 graus Celsius por 15 minutos para permitir que o excesso de PBS extrude dos fragmentos. Em seguida, remova cuidadosamente qualquer pbs restante dos poços com uma pipeta.Semente cada fragmento com 20 microliters de suspensão celular pré-apócito, pipetando as células diretamente para o ECM. Coloque a ponta da pipeta no ECM e expulse-a suavemente para o centro da matriz certificando-se de que a suspensão da célula não transborda e acabe na parte inferior do poço. Se a suspensão da célula transbordar do ECM, remova a ponta da pipeta daquele local e insira-a em outro lugar do ECM.Após a semeadura celular, incubar o ECM por 40 minutos a 37 graus Celsius. Encha cada poço com 500 microliters de mídia de crescimento para cobrir os fragmentos de ECM semeados. Cultura as células a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 72 horas.Após 72 horas, aspire cuidadosamente a mídia de crescimento sem perturbar o fragmento ECM. Adicione 500 microliters de mídia de diferenciação e cultura as células por 14 dias mudando a mídia a cada dois ou três dias. Verifique se há diferenciação usando microscopia leve.As células acumularão lipídios, tornarão marrom-amarelo na cor e se tornarão mais esféricas à medida que se diferenciam. A preparação do tecido adiposo ECM, a semeadura com pré-adipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros foram monitoradas com microscopia eletrônica de varredura que revelou a descelularização do ECM e posterior recapitulação de lipídio contendo adipócitos após a ressecação e diferenciação. A imunohistoquímica específica do ECM descelularizado mostrou manutenção da micro arquitetura de colágeno, enquanto a coloração de óleo vermelho-O de construções 3D ECM-adipócitos mostrou lipídio contendo adipócitos.Os adipócitos diferenciados no ECM foram rastreados para genes adipogênicos utilizando PCR quantitativo em tempo real que demonstrou que esses genes são regulados nas células diferenciadas em relação a preadipócitos indiferenciados cultivados em ECM. A diferença total nos níveis de transcrição é mostrada. Quatro combinações de ECM e adipócitos de sujeitos diabéticos e não diabéticos foram submetidas a fenotipagem metabólica.A absorção de glicose prejudicada na função lipolítica foi descoberta em construções a partir de tecidos diabéticos. É importante ressaltar que o ECM não diabético resgata a absorção de glicose estimulada pela insulina e a capacidade lipolítica em adipócitos diabéticos. A contaminação dos preadipócitos isolados, do tecido descelularizado e do ECM reseeded não é incomum.A esterilidade deve ser mantida diligentemente em todo o protocolo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Sistemas Célula de rotação de cultura para cultura de células humanas: células trofoblásticas Humanos como um modelo

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

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A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

Um modelo de cultura 3D Hormone-responsive da Human glândula mamária Epitélio

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Construção de uma folha de células-tronco mesenquimais em várias camadas com um sistema de cultura dinâmica 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Modelo in vitro de cicatrizes hipertróficas cutâneas humanas usando aglomeração macromolecular

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...