Name: a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk
Uploaded: 2019-11-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

Biz çalışma koordinasyonu ile yardım için Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa ve Retha Geiss teşekkür ederiz. SEM Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirildi. Bu proje NIH hibe R01DK097449 (RWO), R01DK1115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Gaziler İşleri Liyakat Hibe I01CX001811 (RWO), Pilot ve Fizibilite Hibe Michigan Diyabet Araştırma Merkezi (NIH Grant30-DK0205772), RWO (RWO) tarafından desteklenmiştir Gaziler İdaresi VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı Biyomedikal Araştırma Çekirdek Tesisi tarafından gerçekleştirilen taramalı elektron mikroskobu. Bu makalenin Şekil 4'ü ilk olarak Baker et al., J Clin Endo Metab 2017'de yayınlanmıştır; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915 ve Oxford University Press'in izni ile çoğaltıldı [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Bu materyali yeniden kullanmak için lütfen http://global.oup.com/academic/rights ziyaret edin.

Adipose dokuları, kurumsal inceleme kurulu onayı ile elektif bariatrik cerrahi uygulanan insan deneklerinden temin edilmektedir.
1. Preadipocyte izolasyon ve kültür reaktif hazırlama
<ol><li>1x fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) %2 büyükbaş serum albumin (BSA) hazırlayın. Filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Tip II kollajenaz hazırlayın: 1x PBS'de %2 BSA'da 2 mg/mL. Kullanmadan hemen önce hazırlayın.</li>
	<li>Hazırlayın Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lysin...

<ol>
	<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).</li><li>Berrier, A. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesion.">Cell-matrix adhesion.</a> Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).</li><li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity.">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).</li><li>O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+heats+up+adipose+tissue+lymphocytes.">Obesity heats up adipose tissue lymphocytes.</a> Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).</li><li>Engin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pathogenesis+of+Obesity-Associated+Adipose+Tissue+Inflammation.">The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).</li><li>Dankel, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COL6A3+expression+in+adipocytes+associates+with+insulin+resistance+and+depends+on+PPAR&#947;+and+adipocyte+size.">COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPAR&#947; and adipocyte size.</a> Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).</li><li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+in+human+adipose+tissue:+composition,+distribution,+and+link+with+lipid+metabolism+and+fat+mass+loss.">Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss.</a> Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).</li><li>Lackey, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+adipose+tissue+architectural+and+tensile+properties+toward+defining+healthy+and+unhealthy+obesity.">Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).</li><li>Muir, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+fibrosis,+hypertrophy,+and+hyperplasia:+correlations+with+diabetes+in+human+obesity.">Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity.</a> Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).</li><li>Spencer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+macrophages+in+insulin-resistant+subjects+are+associated+with+collagen+VI+and+fibrosis+and+demonstrate+alternative+activation.">Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).</li><li>Baker, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-specific+regulation+of+adipocyte+metabolism+by+the+adipose+tissue+extracellular+matrix.">Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix.</a> Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).</li><li>Pellegrinelli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipocyte+function+is+impacted+by+mechanical+cues.">Human adipocyte function is impacted by mechanical cues.</a> Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).</li><li>Flynn, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+decellularized+adipose+tissue+to+provide+an+inductive+microenvironment+for+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells.">The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Porzionato, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularized+omentum+as+novel+biologic+scaffold+for+reconstructive+surgery+and+regenerative+medicine.">Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine.</a> European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).</li><li>Tebyanian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Rat+Lung+Decellularization+by+Chemical+Detergents+for+Lung+Tissue+Engineering.">A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering.</a> Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).</li><li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes.">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li><li>Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+decellularized+human+adipose+tissue+extracellular+matrix+and+adipose-derived+stem+cells+for+adipose+tissue+engineering.">Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering.</a> Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).</li><li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation.">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop.">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li><li>Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+Metabolic+Interrogation+of+Human+Adipocytes.">Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).</li><li>O'Rourke, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hexosamine+biosynthesis+is+a+possible+mechanism+underlying+hypoxia's+effects+on+lipid+metabolism+in+human+adipocytes.">Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes.</a> PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+characteristics+are+retained+in+strains+derived+from+single+human+preadipocytes.">Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes.</a> Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).</li><li>Tchoukalova, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-+and+depot-dependent+differences+in+adipogenesis+in+normal-weight+humans.">Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).</li></ol>

ECM-adiposit kültür modeli nihai doku fenotip dikte ECM ve hücrelerin bireysel rolleri diseksiyon için değerli bir araç sağlar. ECM izolasyon protokolü oldukça tekrarlanabilir, ancak hücredışılaştırma sürecinde değişkenlik görülebilir. Gün 3 delipidasyon adımı protokolde kritik bir noktadır. Gece çekimi tamamlandığında, matrisin delipidasyonu Polar Solvent Çözeltisi'nin sarıya dönmesiyle kanıtlanmalıdır, matris ise bozulmamış yağ dokusunun sarı-turuncu renk özelliğinden yarı sayd...

Hücre dışı matriks (ECM) sadece dokular için mekanik bir iskele sağlar, ama aynı zamanda içinde bulunan hücreler ile karmaşık bir çapraz meşgul, hücre çoğalması da dahil olmak üzere doku homeostaz için gerekli çeşitli süreçleri düzenleyen, farklılaşma, sinyalizasyon ve metabolizma1. Sağlıklı ECM normal doku fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynarken, işlevsiz ECM birden fazla hastalığa bürünmemiştir2.
Adipoz doku metabolik hastalığın patogenezinde önemli bir rol oynar. Obezite aşırı adiposit hipertrofisi ve hücresel hipoksi ile ilişkilidir, adiposit hücre metabolizmasında defektler, ve yağ dokusu endoplazmik retikulum ve oksidatif stres ve inflamasyon. Yanlış anlaşılmış olsa da, bu karmaşık süreçler yağ dokusu besin tamponlama kapasitesini bozmak için komplo, yağ dokusundan besin taşması yol açan, birden fazla dokutoksisite, ve sistemik metabolik hastalık3,4 ,5. Yağ dokusu yetmezliğinin altında yatan olaylar dizisi ve belirli mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ancak yağ dokusu ECM'deki değişiklikler ecm'ye dahil edilmiştir. ECM bileşimi insan ve mürin obezitesinde yağ dokusu içinde, insan metabolik hastalığı ile ilişkili yağ dokusu ECM nitel biyokimyasal ve yapısal farklılıklar ile birlikte ECM proteininin artmış birikimi ile değiştirilir, dahil olmak üzere tip 2 diyabet ve hiperlipidemi6,7,8,9,10,11.
Bu gözlemlere rağmen, yağ dokusu ECM'nin yağ dokusu disfonksiyonuna aracılık etmedeki rolü iyi tanımlanmamıştır. Bu kısmen nihai yağ dokusu fonksiyonunun düzenlenmesinde ECM ve adipositlerin belirli rollerinin diseksiyonuna izin veren çekilebilir deneysel modellerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. ECM-adiposit kültürü en az iki açıdan yerli yağ dokusunun in vivo ortamını daha iyi simüle eder. İlk olarak, ECM kültürü, standart 2D kültüründe bulunmayan yerli kollajenler, elastinler ve diğer matris proteinleri de dahil olmak üzere yerli yağ dokusuna benzer moleküler bir ortam sağlar. İkinci olarak, 2D plastik kültürü plastik substrat azaltılmış elastikiyeti nedeniyle mekanik etkileri ile adiposit metabolizmasını değiştirmek için gösterilmiştir12, Hangi ECM-kültür ortadan kaldırır.
ECM'nin hücreli yağ ve diğer dokulardan izole edilerek biyolojik iskelelerin tasarlanma yöntemleri rejeneratif ve rekonstrüktif tıp ve doku mühendisliği bağlamında incelenmiştir13,14, 15,16,17,18. Daha önce insan ecm-adiposit kültürünün bir in vitro 3D modeli geliştirmek için bu yöntemleri uyarlanmış metodoloji yayınladık, ECM ve adiposit kök hücreleri kullanarak (preadipocytes) insan visseral yağ dokuları türetilmiştir11. Bu makalede, bu yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz. İnsan yağ dokusu için decellularization prosedürü, türetildiği dokunun özelliklerini koruyan biyolojik bir iskele bırakarak, hücreleri ve lipid kaldırmak için mekanik ve enzimatik tedaviler içeren dört günlük bir süreçtir. Desellülerce ECM insan pizpositlerinin adipojenik farklılaşmasını destekler ve adipositlerle yeniden oluşturulduğunda, mikromimarisi ve biyokimyasal ve hastalığa özgü sağlam yağ dokusu özelliklerini korur ve metabolik yerli yağ dokusunun karakteristik fonksiyonları. Bu matris tek başına çalışılabilir veya hücrelerle yeniden tohumlanabilir, adipoz dokusunun hücresel ve hücre dışı bileşenleri arasındaki etkileşimlerin ve çapraz konuşmaların incelenmesine izin verilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial tube</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#02-682-557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon mesh filter</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY, USA</td>
			<td>Cat#352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 nM 3,3&#8217;-5,Triiodo,L-thyronine sodium salt (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10861-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#79216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciglitizone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#C3974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-</td>
			<td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#NET328A250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP231</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA</td>
			<td>Cat#DSP-MD.43</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#G5882</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisalizane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#440191</td>
			<td>Flammable, caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A415</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#I5627</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S25484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipase from porcine pancreas, type VI-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#L0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4*7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#S233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#A661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td>Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK</td>
			<td>Cat# AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Solution (ORO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#O1391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red-O Stain Kit</td>
			<td>American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA</td>
			<td>Cat#KTORO-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#201030</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#93482</td>
			<td>Caustic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SH3025601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#R5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>Cat#74704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Fluid</td>
			<td>Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#SX18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation Counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, forceps, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorensen&#39;s phosphate buffer</td>
			<td>Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ</td>
			<td>CAS #: 10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-150 culture flask</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10062-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA</td>
			<td>Cat#4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled orbital shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>Cat#D1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#T3309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglyceride Determination Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#TR0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>VWR International LLC., Radnor, PA, USA</td>
			<td>Cat#10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II collagenase</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td>
			<td>Cat#17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA</td>
			<td>Cat#WHA5201150</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a human 3d extracellular matrix-adipocyte culture model for studying matrix-cell metabolic crosstalk

Hücre dışı matriks (ECM) doku homeostazının düzenlenmesinde, hücrelerle çapraz konuşma yapmada ve hücresel fonksiyonun birden fazla yönünü düzenlemede merkezi bir rol oynar. ECM obezite yağ dokusu fonksiyonu özellikle önemli bir rol oynar, ve yağ dokusu ECM birikimi ve bileşimideğişiklikleri fareler ve insanlarda metabolik hastalık ile ilişkilidir. Küresel doku fenotipkatkıda ECM ve hücrelerin rollerinin diseksiyon izin in vitro modeller seyrek. Biz insan ECM-adiposit kültürünün yeni bir 3D in vitro modeli, adipoz doku metabolik fenotip düzenleyen ECM ve adipositlerin belirli rolleri çalışma izin açıklar. İnsan yağ dokusu ECM izole etmek için desellize edilir, daha sonra olgun adipositler içine ECM içinde ayırt edilir preadipocytes ile yeniden doldurulur. Bu yöntem metabolik olarak aktif olan ve türetildiği doku ve hastaların özelliklerini koruyan ECM-adiposit yapıları oluşturur. Bu sistemi, insan yağ dokusunda hastalığa özgü ECM-adiposit çapraz sapı göstermek için kullandık. Bu kültür modeli küresel yağ dokusu metabolik fenotip katkıda ECM ve adipositlerin rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostaz düzenleyen ECM rolünün çalışma izin verir.

Yağ dokusu ECM hazırlanması, preadipocytes ile tohumlama, ve olgun adipositler içine in vitro farklılaşma protokol boyunca ilerleme görsel değerlendirme izin dokuaçık sıralı morfolojik değişiklikler ile sonuçlanır (Şekil 1) . ECM tohumlamak için kullanılan preadipocytes ayrı KDV örneklerinden kollajenaz sindirim kullanılarak izole edilir(Şekil 2). ECM-adiposit yapılarının her aşamasında taramalı elekt...

Watch this Scientific Journal Video about A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk at JoVE.com

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

Biz adipoz doku metabolik fenotip katkıda matris ve adiposit lerin rollerinin diseksiyon sağlayan bir 3D insan ekstrasellüler matriks-adiposit in vitro kültür sistemi açıklar.

Bir İnsan 3D Ekstrasellüler Matrix-Adiposit Kültür Modeli Matrix-Hücre Metabolik Crosstalk Çalışma için

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Protokolümüz, ECM'nin klasik adipojenik arabulucuların yokluğunda adipojenik farklılaşmayı teşvik edebileceğini ve ECM ile hücre metabolizmasının hastalığa özgü düzenlenmesini gösteren ilk protokol olduğunu göstermektedir. Tekniğimiz, ecm ve adipositlerin yağ dokusu metabolizmasındaki rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostazının düzenlenmesinde ECM'nin rolünün incelenmesine izin verir. Standart 2D hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, bizim 3D modeli daha sağlam muayene ve tip 2 diyabet bağlamında adipositler ve yağ dokusu ECM arasında çapraz konuşma diseksiyon sağlar.Hücreselhale ne kadar iyi olduğunu ölçmek için daha küçük örneklerle başlamanızı öneririz. Hücrelerin ne kadar iyi büyüdüğü ve dokunun ne kadar iyi hücreyi yitireceği konusunda hastalar arası değişkenlik olduğunu unutmayın. Dokunun hücreleşmeden emin olmak ve örnekler arasındaki potansiyel farklılıkları anlamak için her adımdan önce ve sonra dokuyu gözlemlemek önemlidir.Ameliyattan visseral yağ dokusu veya KDV aldıktan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpte 15-25 mililitre dondurucu tampon çözeltisine 5-10 gram doku ekleyerek depolamaya hazırlayın. Numuneyi tamamen batırın ve hücreyi decellularization kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Preadipocyte izolasyoniçin, kollajenaz tip II çözeltisi 20 mililitre bozulmamış KDV taze bir örnek iki gram yerleştirin, sonra tüp içine steril makas eklemek ve iyice doku kıyma.Bir kez ince bir bulamaç için kıyılmış, 60 dakika boyunca bir orbital shaker üzerinde 37 santigrat derece kollajenaz çözeltisi içinde kuluçka. Kuluçkadan sonra, 100 mikrometrelik naylon kafesten sindirilen sindirilen suyu 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Sindirilmiş orta viskoziteli sarı-turuncu bir sıvı ve sindirilmemiş doku artık iplikçikleri küçük bir miktar olmalıdır.Numuneyi 270 kez g'de 10 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini bir pipetle 1X RBC lysing çözeltisinin iki mililitresinde yeniden askıya alın. 25 santigrat derece bir dakika için çözüm kuluçka, sonra 10 mililitre ekleyin 15% FBS DMEM F12 ve 10 dakika boyunca 270 kez g santrifüj. ECM'yi hazırlamak için, önceden dondurulmuş KDV örneğini önceden ısıtılmış bir su banyosunda 20 dakika boyunca periyodik olarak hafif manuel ajitasyonla kuluçkaya yatırarak 37 santigrat dereceye kadar dondurun/eritin.Çözüldükten sonra, 20 dakika boyunca eksi 80 santigrat dereceye geri doku aktarın ve erime ile biten üç kez dondurma/ çözülme işlemini tekrarlayın. KDV örneğini 15-25 mililitre enzimatik çözelti 1 içeren yeni bir 50 mililitrekonik tüpe aktarmak için steril forsepsler kullanın ve numunenin tamamen batırDığından emin olun. Sonra 130 RPM sallayarak 37 santigrat derece gecede kuluçka.Ertesi gün, her yıkamadan sonra çözeltiyi dökerek 15-25 mililitre durulama tampon çözeltisi ile numuneyi üç kez yıkayın. Numuneyi 15-25 mililitre enzimatik solüsyon 2 ile yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Durulama tampon çözeltisi ile yıkAyılmaz ve numuneyi 15-25 mililitre polar solvent ekstraksiyon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın.Sallayarak bir gecede örnek kuluçka. Polar solvent çözeltisi ile kuluçkadan sonra lipid giderme numunesinin incelenmesi önemlidir. Lipid çoğu kaldırılmazsa, bu adımı tekrarlamak gerekebilir.Daha kısa kuluçka süresi kullanılabilir. Kuluçkadan sonra, numuneyi 15-25 mililitre durulama tampon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın ve numuneyi üç kez çalkalayıcı üzerinde yıkayın. Daha sonra her yıkamadan sonra etanol dökülen, % 70 etanol çözeltisi ile örnek üç kez yıkayın.Numuneyi depolama solüsyonuyla bir kez yıkayın, ardından 15-25 mililitre depolama çözeltisi içeren taze bir tüpe aktarmak için steril forsepsler kullanın ve tam olarak batırın. Örnek daha sonra bir aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Isopropanol ve etanol yanıcıdır ve oda sıcaklığında olmalı ve yanıcı atıklarda bertaraf edilmelidir.Herhangi bir insan atıkları her zamanki biyolojik tehlike atıklarından ayrı olarak bertaraf edilmelidir. Depolanan ECM parçalarını steril forsepsli 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına aktarın ve planlanan aşağı tahliller için gerektiği kadar parça ekleyerek. Orbital shaker üzerinde% 70 etanol 500 mikrolitre ile üç kez yıkayın, sonra PBS ile üç kez yıkayarak onları rehydrate.ECM'yi 100 miligramlık parçalara dönüştürmek için steril makas kullanın. Her parçayı 24 kuyuluk bir kuyuya yerleştirin ve fazla PBS'nin parçalardan dışarı çıkması için plakayı 15 dakika boyunca 25 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra bir pipet ile kuyulardan kalan PBS'yi dikkatlice çıkarın.Hücreleri doğrudan ECM'ye boruhaline getirerek her parçayı 20 mikrolitre preadipocyit hücre süspansiyonu ile tohumlayın. Pipet ucunu ECM'ye yerleştirin ve yavaşça matrisin ortasına atarak hücre süspansiyonunun taşmayıp kuyunun dibine inmediğinden emin olun. Hücre süspansiyonu ECM'den taşarsa, pipet ucunu o konumdan çıkarın ve ECM'nin başka bir yerine takın.Hücre tohumlama sonra, 37 santigrat derece 40 dakika boyunca ECM kuluçka. Tohumlu ECM parçalarını kapsayacak şekilde her kuyuyu 500 mikrolitre büyüme ortamıyla doldurun. Kültür hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 72 saat.72 saat sonra, ECM parçasını rahatsız etmeden büyüme ortamını dikkatlice aspire edin. Her iki veya üç günde bir medya değişen 14 gün boyunca farklılaşma medya ve kültür hücreleri 500 mikrolitre ekleyin. Işık mikroskobu kullanarak farklılaşma olup olup yok.Hücreler lipidler birikir, renk kahverengi-sarı açmak ve onlar ayırt olarak daha küresel hale gelir. Yağ dokusu ECM'nin hazırlanması, preadipocytes ile tohumlama ve olgun adiposiitlere in vitro farklılaşma, ECM'nin hücredışılaştırılması ve reseeding ve farklılaşma üzerine adiposit içeren lipidin daha sonra recapitülasyonu nu ortaya çıkaran taramalı elektron mikroskobu ile izlendi. Kollajen 1 hücreli ECM spesifik immünohistokimyakolajen mikro mimarisinin bakım gösterdi canlı ve sabit 3D ECM-adiposit yapılar Yağ Red-O boyama adipositler içeren lipid gösterdi.ECM'de farklılaşan adipositler, ecm'de kültürlenen farklılaşmamış preadipocyte'lere göre farklılaşmış hücrelerde bu genlerin upregulated olduğunu gösteren kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak adipojenik genler için tarandı. Transkript düzeylerindeki tam fark gösterilir. Diyabetik ve nondiyabetik deneklerin dört ecm ve adiposit kombinasyonu metabolik fenotitiplemeye tabi tutuldu.Diyabetik dokularda lipolitik fonksiyonda bozulmuş glikoz alımı keşfedildi. Daha da önemlisi, diyabetik adipositlerde insülin uyarılmış glikoz alımı ve lipolitik kapasiteyi diyabetik olmayan ECM'nin kurtardığı bulunmuştur. İzole preadipocytes kontaminasyonu, hücreli doku, ve reseeded ECM nadir değildir.Kısırlık protokol boyunca özenle muhafaza edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Eklem Kondrosit Kültür ve Kıkırdak Üretimi için 3D hidrojel iskeleleri

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

3D dinamik kültür sistemi ile bir çok katmanlı mezenkimal kök hücre levha inşaatı

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Küresel hücresel matriks metalloproteinaz ve 3D Hydrogels metabolik etkinliğini ölçme

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...