Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

نشكر شيلبي أندرسون ، وابي ماكلوف ، ولوريل وودز لمساعدتهم في هذه التقنيات. تم تمويل هذه الدراسة من قبل صناديق بدء التشغيل من جامعه أيوا قسم الميكروبيولوجيا والمناعة لمريم m. ويبر.

1-اعداد وسائط الاعلام والكاشفات
ملاحظه: يجب اعداد لوحات قبل يوم الفحص وهي جيده لمده شهر واحد. يمكن اجراء وسائل الاعلام والكواشف في اي لحظه وهي جيده لمده شهر واحد.
<ol><li>اعداد 1 لتر من محلول الجلوكوز (10 ٪ ث/الخامس) عن طريق تذويب 100 غرام من D-(+)-الجلوكوز في 800 مل من الماء المقطر في 1 ، ...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

يحدد هذا البروتوكول الإجراءات خطوه بخطوه لتحديد المسارات البيولوجية المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية باستخدام سميه الخميرة المعدلة والشاشة المثبطة. سلاله الخميرة المستخدمة ، s. سيريفيسياي W303 ، هو اوكتروفيك لكل من اليوراسيل و ليوسين. يستخدم uracil اوكتروفي من سلاله لتحديد ال...

التقرير الأول من الإجراءات المماثلة لتلك المعروضة هنا تتميز الهوائية الرئوية النوع الرابع sidd ، ديامبيلاسي الذي يعدل Rab11. واستخدمت تقنيات مماثله لتوصيف العديد من القاذفات الهوائية 1،2،3. وقد تم تكييف المقايسة لتميز بروتين المستجيب الرابع من نوع coxiella البورنيتيه 4، ومؤخرا تم توسيع فائده هذه التقنية لتوصيف البروتينات الغشائية لاحتواء الكلاميديا التراميزيه 5 .
يمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى جزاين رئيسيين: 1) شاشه سميه الخميرة ، والتي يتم فيها التعبير عن البروتين البكتيري المستجيب للفائدة في الخميرة ويتم فحص المستنسخين للحصول علي النمط الظاهري السام كما يتضح من عيب في النمو ، و 2) شاشه الخميرة المثبطة ، حيث يتم قمع النمط الظاهري السامة عن طريق التعبير عن مكتبه الخميرة الجينوم في السلالة السامة. التالي ، فان شاشه السمية هي شاشه لأنماط الظاهري السامة التي تظهر كعيوب في النمو عندما يبالغ المستجيب البكتيري للفائدة. يتم اختيار المستنسخات السامة ، التي تم تحويلها بنجاح مع والتعبير عن المستجيب البكتيري ، وحفظها للخطوة التالية. الخطوة الرئيسية الثانية تنطوي علي المبالغة في التعبير عن مكتبه الخميرة الجينوم هضمها جزئيا في استنساخ الخميرة السامة. البلازميدات التي تشكل الخميرة الجينوم المكتبة اقترح للاستخدام في هذا البروتوكول تحمل 5 − 20 ادراج kb ، وعاده ما يقابل 3 − 13 الخميرة المفتوحة إطارات القراءة (ORF) متوسط حجم الجينات من ~ 1.5 كيلوبايت في جميع انحاء البلازميدات ، والتي تمثل الجينوم الخميرة كامله مغطاه تقريبا 10x. ويسمي هذا الجزء من الفحص الشاشة القمعية ، والهدف من ذلك هو قمع سميه البروتين المستجيب البكتيري. يتم عزل البلازميدات المثبطة المحتملة من الخميرة ، متسلسلة ، و ORFs قمع المحددة. الأساس المنطقي الذي تقوم عليه الشاشة القمعية هو ان البروتين المستجيب يربط ، يتفاعل مع ، و/أو مكونات يثقل كاهله للمسار المضيف الذي يستهدفه ، وان توفير تلك البروتينات المضيفة مره أخرى في الزائدة يمكن إنقاذ تاثير سام علي المسار ، التالي ، عيب النمو. التالي ، فان ORFs المحددة التي تقمع السمية غالبا ما تمثل مشاركين متعددين في مسار المضيف. ثم يتم اجراء التجارب المتعامدة للتحقق من ان المستجيب البكتيري يتفاعل بالفعل مع المسار المتورط. وهذا ضروري بشكل خاص إذا تم تحديد شريك ملزم مثل كلميثرين أو الاكتين ، لان هذه البروتينات تشارك في العديد من عمليات المضيف. ويمكن للتجارب الأخرى بعد ذلك توضيح الوظيفة الفسيولوجية للبروتين المستجيب اثناء العدوى. السمية وشاشات المثبطة هي أيضا أدوات قويه لفك رموز الوظيفة الفسيولوجية من البروتينات البكتيرية التي لا تربط جسديا البروتينات المضيف مع التقارب كافيه للكشف عن طريق الايمونوبريسيبيتيشن أو التي تتفاعل مع المضيف في التفاعلات الانزيميه ضرب وتشغيل التي قد لا يتم الكشف عنها من قبل الخميرة-اثنين من الشاشة الهجينة.
علي الرغم من ان الشاشة القمعية يمكن ان تكون وسيله قويه للكشف عن التفاعلات الفسيولوجية المحتملة بين البروتينات البكتيرية المستجيب ومسارات المضيف ، يجب ان يحفز البروتين البكتيري المستجيب خلل في النمو في الخميرة ، والا استخدامه في وسوف تكون الشاشة المثبطة للاستخدام قليلا. وعلاوة علي ذلك ، يجب ان يؤدي النمط الظاهري السامة علي الأقل 2-3 سجل العجز10 في النمو أو انه سيكون من الصعب تحديد المثبطات. إذا تم إنشاء مختبر لثقافة الخلية ، وفحص البروتينات المستجيب للسمية في خطوط الخلايا المشتركة مثل هيلا يمكن ان تعطي في كثير من الأحيان نظره ثاقبه حول ما إذا كان يستحق الجهد للمضي قدما في الشاشة سميه الخميرة. التعبير عن الرحم من البروتين المستجيب في الخلايا هيلا في بعض الأحيان يؤدي إلى السمية التي ترتبط بقوة شديده مع سميه في سلاله الخميرة المستخدمة لهذه الشاشات4. وتشمل السمات الملحوظة للإجهاد في الخلايا هيلا فقدان ألياف الإجهاد ، مفرزه الخلية من لوحه ، والتكثيف النووي يشير إلى المبرمج. اي اشاره بصريه من الإجهاد في الخلايا هيلا جعل البروتين من الفائدة مرشح جيد للحث علي خلل في النمو في الخميرة ، والتي تتكرر بسرعة أكبر بكثير ، التالي أكثر استجابه لاضطراب المسارات الاساسيه.
وتجدر الاشاره إلى ان الشاشة القمعية لا تحدد دائما الشركاء الملزمين المضيفين كمثبطين ، ولكنها لا تزال يمكن ان تورط المكونات الهامه للمسار (المسارات) المضيفة المستهدفة ، مما يعطي نظره شامله للعمليات البيولوجية التي اختطفتها بروتين المستجيب البكتيري. علي السطح ، وهذا يبدو غير بديهي ، لان توفير شريك ملزم من البروتين المستجيب في الزائدة سيكون من المتوقع لإنقاذ عيب النمو. في الجهود الرامية إلى تحديد المسارات التي تستهدفها c. التراميزاتيس البروتين المستجيب CT229 (cpos) ، الذي يربط ما لا يقل عن 10 مختلفه الراب GTPases اثناء العدوى5، أيا من شركاء الراب ملزمه قمعت سميه CT229. ومع ذلك ، تم التعرف علي العديد من القمعيين المتورطين في الاتجار بالحويصلات المغلفة بالكلس ، مما ادي إلى مزيد من العمل الذي يبرهن علي ان CT229 يقوض علي وجه التحديد الاتجار بالأشخاص الذين يعولهم الراب. المثل ، عند التحقيق في c. Cbu0041 البروتين المستجيب (cira) عده رو GTPases التي أنقذت خلل نمو الخميرة تم تحديدها ، وكان في وقت لاحق وجدت ان cira يعمل بمثابه Gtpases تنشيط البروتين (GAP) للروا4.
لا يمكن المبالغة في فائده الشاشة الخميرة المثبطة لتوضيح مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات البكتيرية المستجيب ، والباحثين الآخرين الذين يحاولون توصيف البروتينات البكتيرية داخل الخلايا يمكن ان تستفيد كثيرا من هذه التقنيات. هذه المقايسات هي ذات قيمه إذا فشلت إيمونوبريسيبيتيشنز و/أو الخميرة-اثنين من الشاشات الهجين للعثور علي شريك ملزم ويمكن توضيح المسارات التي تستهدفها البروتين المستجيب البكتيري. هنا ، يتم توفير بروتوكولات مفصله للشاشات السمية والمثبطة لتحديد المسارات البيولوجية المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية داخل الخلايا ، فضلا عن بعض العقبات الشائعة التي شهدتها عند استخدام هذه المقايسات الحلول المقابلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

البكتيريا داخل الخلايا تفرز عوامل الضراوة تسمي البروتينات المستجيب في عصارة المضيف التي تعمل علي تخريب البروتينات المضيفة و/أو المسارات البيولوجية المرتبطة بها لصالح البكتيريا. وقد أصبح تحديد البروتينات المستجيبة البكتيرية المفترضة أكثر قابليه للاداره بسبب التقدم في تسلسل الجينوم البكتيري وظهور الخوارزميات التي تسمح في تحديد سيليكو الجينات ترميز إفراز المرشحين و/أو حقيقية مثل النواة المجالات. ومع ذلك ، فان تحديد هذه العوامل الهامه في الضراوة ليس سوي خطوه أوليه. وبطبيعة الحال ، فان الهدف هو تحديد الوظيفة الجزيئية للبروتينات المستجيب وتوضيح كيفيه تفاعلها مع المضيف. في السنوات الاخيره ، ساعدت تقنيات مثل الخميرة الهجينة الشاشة والإيمونوبريسيبيتيشنز واسعه النطاق إلى جانب الطيف الكتلي في تحديد التفاعلات بروتين البروتين. علي الرغم من ان تحديد شريك ربط المضيف هو الخطوة الاولي الحاسمة نحو توضيح الوظيفة الجزيئية للبروتين المستجيب البكتيري ، وأحيانا يتم العثور علي البروتين المضيف لديها وظائف بيولوجية متعددة (علي سبيل المثال ، actin ، كلميثرين ، الأنابيب) ، أو البروتين البكتيري قد لا يربط جسديا البروتينات المضيفة ، وحرمان الباحث من المعلومات الهامه حول المسار المضيف دقيقه يجري التلاعب بها. تم تعديل شاشه سميه الخميرة المعدلة إلى جانب الشاشة القمعية لتحديد مسارات المضيف المتاثره بالبروتينات البكتيرية المستجيبة. تعتمد شاشه السمية علي تاثير سام في الخميرة التي يسببها البروتين المستجيب الذي يتداخل مع المسارات البيولوجية المضيفة ، والذي غالبا ما يظهر كعيب في النمو. يستخدم التعبير عن مكتبه الخميرة الجينية لتحديد العوامل المضيفة التي تقمع سميه البروتين البكتيري المستجيب التالي تحديد البروتينات في المسار الذي يستهدف البروتين المستجيب. يحتوي هذا البروتوكول علي إرشادات مفصله لكل من الشاشات السمية والمثبطة. ويمكن اجراء هذه التقنيات في اي مختبر قادر علي الاستنساخ الجزيئي وزراعه الخميرة والقولونية.

قبل ان يمكن اجراء الشاشة الفعلية الخميرة المثبطة ، يجب اختبار البروتين المستجيب من الفائدة للسمية في الخميرة. ويتم ذلك عن طريق التعبير عن البروتين من الفائدة في الخميرة تحت سيطرة مروج الصبار المحرض. وينبغي أولا مقارنه النمو علي الجلوكوز (ظروف غير محفزه) لضمان السمية هو علي وجه التحديد بسب?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

تفرز مسببات الامراض البكتيرية البروتينات في المضيف الذي يستهدف العمليات البيولوجية الحاسمة. تحديد مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات البكتيرية هو المفتاح لمعالجه التسبب في الجزيئات. هنا ، يتم وصف طريقه باستخدام المثبطة الخميرة المعدلة والشاشة سميه لتوضيح مسارات المضيف التي تستهدفها البروتينات السمية البكتيرية المستجيب.

تحديد المسارات المضيفة التي تستهدفها البروتينات البكتيرية باستخدام سميه الخميرة والشاشات المثبطة

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

تفرز البكتيريا داخل الخلايا بروتينات التأثير إلى المضيف التي يمكن أن تتلاعب بالمسارات البيولوجية لتعزيز البقاء على قيد الحياة الممرض. الكشف عن الأهداف المضيفة من الآثار أمر ضروري لفهم مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل الكلاميديا trachomatis. يمكن لسمية الخميرة وشاشات القامع توفير رؤية رئيسية فيما يتعلق بالهدف البيولوجي الطبيعي للبروتينات البكتيرية والمفعمة ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص عندما يكون الشريك الملزم غير معروف.نحن نبرهن على سمية الخميرة والفحوصات القامعة هنا للفحص للبروتينات المسببة للتشاليديا تراشوتاتيس ، ولكن هذه التقنية استخدمت أيضًا لتميز الفيلقية pneumophila و Coxiella burnetii effectors. تبدأ من قبل تلقيح خمسة ملليلتر من مرق واحد التسرب مع مستعمرة واحدة من الخميرة تحولت مع البروتين effector التي تحتوي على plasmid. استخدام الخميرة تحول مع ناقلات وحدها كتحكم سلبي واحتضان inoculum بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في حين تهتز.في اليوم التالي، أضف 180 ميكرولترات من المياه المعقمة إلى آبار A2 من خلال A6 من طبق 96 بئرًا. دوامة ثقافة بين عشية وضحاها وإضافة 180 ميكرولترات من الخميرة إلى A1 جيدا. ثم تخفيف تسلسلي الخميرة في الآبار بالماء. استخدام ماصة متعددة القنوات لاكتشاف خمسة ميكروليتر من كل تخفيف على الجلوكوز قطرة واحدة وألواح واحدة من تسرب أغر واحتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.بعد الحضانة، وتقييم بصريا سمية عن طريق مقارنة نمو الخميرة التعبير عن البروتين effector نمت على الوسائط المحتوية على جالاكتوز إلى نمو الخميرة التعبير عن ناقلات وحدها. تلقيح 100 ملليلتر من مرق التسرب واحد مع ملليلتر واحد من مخزون الخميرة المعدة سابقا واحتضانه لمدة 16 إلى 24 ساعة في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، إضافة كامل 100 ملليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها إلى 900 ملليلتر من قبل الدافئة مرق التسرب واحد واحتضان القارورة لمدة أربع إلى خمس ساعات في 30 درجة مئوية في حين تهتز.بعد الاحتضان، بيليه الثقافة في 6،000 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. تخلص من السوبر و resuspend بيليه في 250 ملليلتر من الماء المعقم. كرر الطرد المركزي وتجاهل المابير.ثم إعادة تعليق بيليه في 250 ملليلتر من خلات الليثيوم ميليمولار واحد. بيليه الثقافة عن طريق الطرد المركزي، وإزالة خلات الليثيوم، وإعادة تعليق بيليه في 9.6 ملليلتر من 50٪ PEG 3350. ثم أضف الكواشف التحويلية كما هو موضح في المخطوطة، وقم بتعديل الحجم إلى 15 ملليلتر مع قلب الماء المعقم بلطف للمزج.احتضان الخليط في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة 750 ميكرولترات من DMSO واحتضان في حمام مائي في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. إضافة DMSO قبل الصدمة الحرارية أمر بالغ الأهمية لتحقيق كفاءة عالية التحول.بعد الحضانة، بيليه الخميرة عن طريق الطرد المركزي في 3، 000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وغسل بيليه مع 10 ملليلتر من الماء العقيم ثم كرر الطرد المركزي ل بيليه الخميرة. إعادة تعليق بيليه في ثمانية ملليلتر من الماء.تحديد كفاءة التحول عن طريق تمييع العينة من واحد إلى 10 والطلاء 100 ميكرولترات من كل تخفيف على مزدوجة الأجار التسرب. ثم لوحة 200 ميكروليتر من العينة على مزدوجة التسرب لوحات جالاكتوز أجار واحتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 إلى 96 ساعة أو حتى تظهر المستعمرات. بمجرد ظهور المستعمرات ، التصحيح لهم على تسرب مزدوج galactose أجار واحتضان لهم لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى.استخدام جزء من التصحيح لتطعيم خمسة ملليلتر من مرق التسرب المزدوج واحتضان inoculum بين عشية وضحاها في 26 درجة مئوية مع اهتزاز في 150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، إضافة 180 ميكرولترات من الماء المعقم إلى خمسة آبار من لوحة 96 جيدا بدءا من A2 جيدا. دوامة مزيج ثقافة بين عشية وضحاها. إضافة 180 ميكرولترات من الخميرة إلى A1 جيدا وتمييع تسلسلي باستخدام الماء في الآبار A2 من خلال A6. بقعة خمسة ميكرولترات من كل تخفيف على الجلوكوز واحد التسرب وألواح واحدة من تسرب جالاكتوز أجار مع التأكد من إدراج المفعول السام وحده كتحكم.احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ثم قارن نمو الخميرة مع التأثير السام وحده إلى نمو الخميرة مع القامع المحتملة. لتأكيد القامعين التي أظهرت انخفاض السمية بالمقارنة مع الأثر السام وحده، عزل البلازميد وفقا لاتجاهات المخطوطات وإعادة تحويله إلى الخميرة السامة. تلقيح مرق الجلوكوز المتسرب المزدوج مع مستعمرة من لوحة التحول.احتضانه بين عشية وضحاها وعلى الفور على السكر المزدوج التسرب و galactose أجار لتأكيد قمع السمية. قبل إجراء شاشة القامع الخميرة، تم اختبار البروتينات ذات الأهمية من أجل سمية في الخميرة. تم التعبير عن البروتين من الفائدة في الخميرة تحت سيطرة المروج galactose غير قابل للدبوس، ومقارنة النمو على جالاكتوز إلى النمو على الجلوكوز.عندما تم اختبار CT229 لسمية، لوحظ المستعمرات أصغر وإخماد النمو. من الناحية المثالية، ينبغي ملاحظة انخفاض سجل اثنين إلى ثلاثة للمضي قدما مع شاشات القامع الخميرة. أجريت شاشة القامع عن طريق تحويل سلالة سامة مع مكتبة الخميرة الجينوم PYAP 13 والطلاء التحويلات على غالاكتوز أجار.تم رصد المستنسخات القامع التي تم الحصول عليها على مزدوجة التسرب galactose أجار لتأكيد قمع السمية. قمع pSup1 وpSup2 قمعت سمية البروتين effector في حين pSup3 لم. وتتطلب هذه الإجراءات اهتماماً دقيقاً بالتفاصيل بالإضافة إلى الأعمال التحضيرية الحاسمة بما في ذلك وجود كميات كبيرة من الوسائط واللوحات جاهزة قبل إجراء التجربة.وبمجرد تحديد القامعين، يمكن إجراء التجارب للتحقق من التفاعلات مع المؤثرات من الفائدة بما في ذلك سحب هبوطا، الكولويولوجيا المناعية، ضربة قاضية من المؤثر أو الضربة القاضية من العوامل المضيفة التي تم تحديدها في الشاشات. وقد سمح تطوير هذه التقنية لمؤاذيات الكلاميديا للتوصيف الأولي المعجل للبروتينات المُفعِّلة وساعد على تركيز جهودنا على توضيح الآليات الجزيئية الأساسية التي تتوسط التفاعلات المُضيفة للمُمرضات.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

بيودوسيميتري الإشعاع المعجل الآلي تحديد الكروموسوم ديسينتريك (أدسي) وتقدير الجرعة

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

تحديد تركيبات المخدرات التآزر بواسطة الأسلوب2 تداخل الفائق

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

شاشات الهجين واحد الخميرة المحسنة لتحديد عامل النسخ ملزمة لتسلسل الحمض النووي البشري

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...