Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
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我们感谢谢尔比·安德森、艾比·麦卡洛和劳雷尔·伍兹在这些技术方面给予的帮助。这项研究由爱荷华大学微生物学和免疫学系的启动基金资助给玛丽M.韦伯。

1. 培养剂和试剂的制备
注：板材应在测定日之前准备，并好1个月。介质和试剂可随时制成，适合1个月。
<ol><li>通过在 1000 mL 烧杯中溶解 800 mL 蒸馏水中的 100 g D-（+）-葡萄糖，制备 1 L 葡萄糖溶液（10% w/v）。用蒸馏水将音量调节到 1 L。通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌 1 L 介质存储瓶中。</li>
	<li>在 1 L 烧杯中溶解 100 g D-（+）- 蒸馏水中的 100 g D-（+）- 甘蔗素，制备 1 L 的甘...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

该协议概述了使用改性酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白靶向宿主生物通路的分步程序。使用的酵母菌株，S.cerevisiae W303，是辅助营养的尿素和亮氨酸。该菌株的Uracil辅助营养器用于选择含有pYesNTA-Kan载体上感兴趣的蛋白质的酵母，而亮氨酸辅助营养器用于选择酵母基因组库载体pYep13。酵母基因组库质粒携带3~13个ORF，因此每个ORF应单独克隆到p415-ADH载体6或类似载体?...

第一次报告的程序类似于这里提出的那些特点军团菌肺炎嗜血杆菌类型IV效应器SidD，一个deAMPylase，修改Rab11。比较技术用于表征几个L.肺炎球菌效应器1，2，3。该测定被调整为Coxiella burnetii型IV效应蛋白4，最近该技术的效用被扩展为衣原体沙眼结合膜蛋白的表征5.
该协议可以分为两个主要部分：1）酵母毒性筛，其中感兴趣的细菌效应蛋白在酵母中表达，克隆被筛选为由生长缺陷证明的有毒表型，2）酵母抑制器屏幕，其中毒性表型被毒菌株中的酵母基因组库表达所抑制。因此，毒性屏幕是有毒表型的屏幕，当感兴趣的细菌效应者过度表达时，这些表型表现为生长缺陷。有毒克隆，成功地转换和表达细菌效应器，选择并保存下一步。第二个主要步骤涉及在有毒酵母克隆中过度表达部分消化的酵母基因组库。在该协议中建议使用酵母基因组库的质粒携带5-20 kb的插入物，通常对应于所有质粒平均基因大小为±1.5 kb的3~13个酵母开放阅读框架（ORF），代表覆盖的整个酵母基因组大约10倍。这部分的测定称为抑制器屏幕，因为目标是抑制细菌效应蛋白的毒性。电势抑制质粒从酵母中分离出来，测序，并识别抑制性ORF。抑制器屏幕的基本原理是，效应蛋白与其目标的宿主通路结合、相互作用和/或压倒其目标，而过量地将这些宿主蛋白提供回可挽救该通路的毒性效应，从而，生长缺陷。因此，抑制毒性的确定ORF通常代表宿主通路的多个参与者。然后进行正交实验，以验证细菌效应器确实与牵连通路相互作用。如果已识别出克扯林或肌蛋白等结合性伙伴，这一点尤为必要，因为这些蛋白质涉及多种宿主过程。进一步的实验可以阐明感染过程中效应蛋白的生理功能。毒性和抑制器屏幕也是破译细菌效应蛋白的生理功能的有力工具，这些蛋白质在物理上不会将宿主蛋白与亲和力结合，其亲和力足以通过免疫沉淀检测或与在酶命中和运行交互中主机，这些交互可能不会被酵母-二混合屏幕检测到。
虽然抑制器屏幕可以是一种强大的方法来揭示细菌效应蛋白和宿主通路之间的潜在生理相互作用，但细菌效应蛋白必须诱导酵母中的生长缺陷，否则在抑制器屏幕将没有什么用。此外，有毒表型必须导致至少 2⁄3 log10增长赤字，否则将难以识别抑制器。如果为细胞培养建立实验室，在HeLa等常见细胞系中筛选毒性效应蛋白通常可以洞察是否值得进行酵母毒性筛查。HeLa细胞中效应蛋白的异位表达有时导致毒性，与用于这些屏幕4的酵母菌株的毒性密切相关。HeLa细胞中可观察到的应力特征包括应力纤维的丧失、细胞脱离板和指示凋亡的核凝结。HeLa细胞中任何压力的视觉指示都使得感兴趣的蛋白质成为诱导酵母生长缺陷的良好候选者，酵母的复制速度要快得多，从而对基本通路的扰动反应更灵敏。
应当指出，抑制器屏幕并不总是将宿主绑定伙伴标识为抑制器，但它仍然可能涉及目标宿主通路的关键组件，从而全面了解被细菌效应蛋白。从表面上看，这似乎是违反直觉的，因为提供过量的效应蛋白的结合伙伴有望挽救生长缺陷。在努力确定C.沙眼效应蛋白CT229（CpoS）所针对的途径时，在感染5期间与至少10种不同的Rab GTPass结合，没有一个拉布结合伙伴抑制了CT229的毒性。然而，查明了参与克拉林涂层囊泡（CCV）贩运的许多抑制者，这导致进一步的工作表明，CT229特别颠覆了依赖Rab的CCV贩运。同样，在调查C.burnetii效应蛋白Cbu0041（CirA）时，发现了几种能挽救酵母生长缺陷的Rho GTPases，后来发现CirA作为RhoA4的GTPase激活蛋白（GAP）的作用。
酵母抑制器屏幕对阐明细菌效应蛋白靶向宿主通路的效用怎么强调也不过分，其他试图描述细胞内细菌效应蛋白的研究人员可以从中获益这些技术。如果免疫沉淀和/或酵母-两个混合屏幕未能找到结合的伙伴，并且可以阐明细菌效应蛋白所针对的通路，这些检测是有价值的。在这里，提供了毒性和抑制器屏幕的详细方案，以识别细胞内细菌效应蛋白所针对的宿主生物通路，以及使用这些测定剂及其相应的解决方案。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

细胞内细菌将称为效应蛋白的毒性因子分泌到宿主细胞醇中，这些细胞醇的作用是破坏宿主蛋白和/或其相关的生物途径，以利于细菌。由于细菌基因组测序的进步和算法的出现，使得假定细菌效应蛋白的识别变得更加易于管理，这些算法允许在硅素识别编码分泌候选项和/或真核生物的基因方面进行编码域。然而，确定这些重要的毒力因素只是第一步。自然地，目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明它们如何与宿主相互作用。近年来，酵母双杂交筛和大规模免疫沉淀技术以及质谱仪等技术有助于识别蛋白质-蛋白质相互作用。虽然识别宿主结合性伴侣是阐明细菌效应蛋白的分子功能的关键的第一步，但有时宿主蛋白具有多种生物功能（例如，活性素、克拉辛、土布林），或细菌蛋白可能不会物理结合宿主蛋白，使研究人员失去有关纵的精确宿主通路的关键信息。经过修饰的酵母毒性筛与抑制器屏幕相结合，已调整，以识别受细菌效应蛋白影响的宿主通路。毒性屏幕依赖于由效应蛋白干扰宿主生物通路引起的酵母中的毒性效应，这通常表现为生长缺陷。酵母基因组库的表达用于识别抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别效应蛋白靶向通路中的蛋白质。该协议包含毒性和抑制器屏幕的详细说明。这些技术可以在任何能够进行分子克隆和培养酵母和大肠杆菌的实验室中进行。

在实际的酵母抑制器屏幕可以执行之前，必须测试感兴趣的效应蛋白在酵母中的毒性。这是通过在一个可诱导诱导剂的控制下表达对酵母感兴趣的蛋白质来实现的。葡萄糖的生长（非诱导条件）应首先进行比较，以确保毒性是特别由于感兴趣的蛋白质的表达，而不是一般的缺陷。如图3所示，毒性表现为较小的菌落和/或生长减少。酵母生长减少2⁄3对数是酵母抑制器屏幕的理...

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Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以关键生物过程为目标。识别细菌效应蛋白所针对的宿主通路是解决分子发病机制的关键。这里，描述了一种使用改性酵母抑制剂和毒性筛分的方法，以阐明有毒细菌效应蛋白所针对的宿主通路。

使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

细胞内细菌将效应蛋白分泌到宿主中，这些宿主可以操纵生物通路，促进病原体的生存。揭示效应器的宿主靶点对于了解细胞内病原体（如沙眼衣原体）至关重要。酵母毒性和抑制剂筛选可以提供有关细菌效应蛋白的自然生物靶点的关键见解，当结合伙伴未知时，可以特别有用。我们演示酵母毒性和抑制剂检测在这里筛选衣原体沙眼效应蛋白， 但这项技术也已被用于定性军团菌嗜血杆菌和科西拉燃烧剂效应剂.首先接种五毫升的单辍汤与酵母的单组转化与含有质粒的效应蛋白。使用酵母单独与载体转化作为负对对，并在30摄氏度的温度下孵育孵化，同时摇动。第二天，通过96孔板的 A6 井向 A2 中加入 180 微升无菌水。漩涡过夜培养，并添加180微升酵母到井 A1。然后连续用水稀释井中的酵母。使用多通道移液器将每次稀释的五微升分液检测到单滴出葡萄糖和单滴出半乳糖板上，并在 30 摄氏度下孵育板 48 小时。孵育后，通过比较酵母的生长，将含有半乳糖的介质上生长的酵母的生长与仅表达载体的酵母的生长进行比较，直观地评估毒性。接种100毫升的单滴出汤与先前准备的酵母库存的1毫升，并在30摄氏度下孵育16至24小时，在150 RPM下摇晃。第二天，将隔夜培养的100毫升加入900毫升预先加热的单滴汤，并在30摄氏度下孵育烧瓶4至5小时，同时摇晃。孵育后，在摄氏4度下，在6000次g下分粒，10分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新在250毫升的无菌水中。重复离心并丢弃上经剂。然后将颗粒重新在250毫升的一毫升醋酸锂中重新暂停。通过离心对培养物进行颗粒化，去除醋酸锂，并在 9.6 毫升 50%PEG 3350 中重新暂停颗粒。然后添加手稿中描述的转化试剂，并将体积调整为 15 毫升，无菌水轻轻反转以混合。在30摄氏度下孵育混合物30分钟。然后加入750微升DMSO，在42摄氏度的水浴中孵育30分钟。在热冲击前添加 DMSO 对于实现高转化效率至关重要。孵育后，在3000次g中离心5分钟，将酵母颗粒为颗粒。丢弃上经剂，用10毫升无菌水清洗颗粒，然后重复离心，使酵母颗粒。将颗粒重新在8毫升水中。通过将样品稀释 1 至 10，将每次稀释的 100 微升电镀到双滴出的加糖上，确定转化效率。然后板200微升的样品在双辍半乳糖加糖板和孵育板在30摄氏度48至96小时或直到菌落出现。一旦菌落出现，修补他们双辍学半乳糖的阿加，并孵育他们另外24至48小时。使用部分贴片接种五毫升的双滴出肉汤，并在26摄氏度下孵育孵化，在150 RPM下摇晃。第二天，从 A2 井开始，在 96 孔板的 5 口井中加入 180 微升无菌水。漩涡一夜之间文化混合。将180微升酵母加入井 A1，并使用水在 A2 至 A6 井中连续稀释。在单滴出葡萄糖和单滴出半乳糖板上发现每次稀释的五微升，确保单独包括毒性效应器作为控制。在30摄氏度下孵育板48小时，然后将酵母的生长与毒性效应器单独与酵母的生长与潜在的抑制器进行比较。要确认与毒性效应器相比毒性降低的抑制剂，请根据手稿指示分离质粒并将其重新转化为有毒酵母。接种双辍糖汤与从转化板的殖民地。孵育过夜，并发现双辍糖和半乳糖加糖，以确认抑制毒性。在执行酵母抑制器筛选之前，对感兴趣的效应蛋白进行了酵母毒性测试。在乳糖可吸收的促进剂的控制之下，在酵母中表达感兴趣的蛋白质，将乳糖的生长与葡萄糖的生长进行比较。当CT229被测试毒性时，观察到较小的菌落和生长抑制。理想情况下，应观察到两到三个日志减少，以继续酵母抑制器屏幕。抑制器屏幕通过利用酵母基因组库pYAP 13改变毒株，并在乳糖上电镀转化剂进行。在双滴出半乳糖剂中发现获得的抑制克隆，以确认抑制毒性。抑制器pSup1和pSup2抑制了效应蛋白的毒性，而pSup3则没有。这些程序需要仔细注意细节，除了关键的准备工作，包括有大量的介质和板准备之前执行实验。一旦识别抑制剂，就可以进行实验，以验证与利益效应器的相互作用，包括下拉、免疫荧光结肠化、效应器敲除或击除屏幕中确定的宿主因子。这种衣原体效应器技术的发展使得效应蛋白的初次表征得到了加速，并有助于我们集中力量阐明调解宿主病原体相互作用的基本分子机制。

Research

JoVE Journal

Genetics

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接合交配测定在接合介入转移蛋白的序列特异性分析

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科研

遗传学

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

间歇酵母 2-混合筛序列数据的信息化分析

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

一种在裂变酵母中的深度固序辅助自发抑制屏

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

强化酵母单杂交筛网识别与人 dna 序列结合的转录因子

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

哺乳动物细胞中基于CRISPR的聚集基因屏幕

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...