Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

We danken Shelby Andersen, Abby McCullough en Laurel Woods voor hun hulp bij deze technieken. Deze studie werd gefinancierd door opstart fondsen van het departement van de Universiteit van Iowa van microbiologie en immunologie aan Mary M. Weber.

1. bereiding van de media en reagentia
Opmerking: platen moeten vóór de dag van de test worden bereid en zijn goed voor 1 maand. Media en reagentia kunnen op elk moment worden gemaakt en zijn goed voor 1 maand.
<ol><li>Bereid 1 L van de glucoseoplossing (10% w/v) door 100 g van D-(+)-glucose op te lossen in 800 mL gedistilleerd water in een bekerglas van 1, 000 mL. Stel het volume in op 1 L met gedestilleerd water. Filtreer door een 0,2 μm steriel filter in een steriele 1 L media opslag f...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

Dit protocol schetst stapsgewijze procedures voor het identificeren van de gastheer biologische trajecten die zijn gericht door bacteriële Effector eiwitten met behulp van een gemodificeerde gist toxiciteit en suppressor scherm. De gebruikte gist stam, S. cerevisiae W303, is auxotrofische voor zowel uracil als leucine. Uracil auxotrophy van de stam wordt gebruikt om gist te selecteren die het eiwit van belangstelling draagt op de pYesNTA-kan vector, terwijl Leucine auxotrophy wordt gebruikt om te selecteren voo...

Het eerste rapport van procedures vergelijkbaar met die hier gepresenteerd gekenmerkt de Legionella pneumophila type IV Effector Sidd, een deAMPylase dat wijzigt Rab11. Er werden vergelijkbare technieken gebruikt voor de karakterisering van verschillende L. pneumophila Effectors1,2,3. De assay werd aangepast om een Coxiella burnetii type IV Effector proteïne4te karakteriseren, en onlangs werd het nut van deze techniek uitgebreid voor de karakterisering van Chlamydia trachomatis inclusie membraan eiwitten5 .
Dit protocol kan worden opgesplitst in twee belangrijke delen: 1) het gist toxiciteits scherm, waarin de bacteriële Effector proteïne van belangstelling wordt uitgedrukt in gist en klonen worden gescreend op een toxisch fenotype zoals blijkt uit een groei fout, en 2) het gist suppressor-scherm , waarin het toxische fenotype wordt onderdrukt door uitdrukking van een gist genomische bibliotheek in de toxische stam. Zo is het toxiciteits scherm een scherm voor toxische fenotypes dat zich manifesteert als groei fouten wanneer de bacteriële Effector van belang wordt overexpressie. Giftige klonen, succesvol getransformeerd met en uitdrukken van de bacteriële Effector, worden geselecteerd en opgeslagen voor de volgende stap. De tweede belangrijke stap is het overdrukken van een gedeeltelijk verteerde gist genomische bibliotheek in de giftige gist kloon. Plasmiden maken van de gist genomische Library voorgesteld voor het gebruik in dit protocol dragen 5 − 20 KB inserts, meestal overeenkomend met 3 − 13 gist open reading frames (ORF) van een gemiddelde gengrootte van ~ 1,5 KB over alle plasmiden, die het hele gist genoom bedekt ongeveer 10x. Dit deel van de test wordt het suppressor scherm genoemd, omdat het doel is om de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit te onderdrukken. Potentiële suppressor plasmiden zijn geïsoleerd van gist, Sequenced, en het onderdrukken van Orf's geïdentificeerd. De ratio die aan het onderdrukker scherm ten grondslag ligt, is dat de Effector proteïne bindt, samenwerkt met, en/of overweldt van componenten van het ontvangende pad dat het target, en dat het verstrekken van die gastheer eiwitten terug in overmaat het toxische effect op het traject kan redden en dus, de groei fout. Zo, geïdentificeerde Orf's die toxiciteit onderdrukken vaak vertegenwoordigen meerdere deelnemers van een host-traject. Orthogonale experimenten worden vervolgens uitgevoerd om te controleren of de bacteriële Effector inderdaad met het betrokken traject samenwerkt. Dit is vooral nodig als een bindende partner zoals clathrin of actine is geïdentificeerd, omdat deze eiwitten betrokken zijn bij een veelheid van hostprocessen. Verdere experimenten kunnen dan de fysiologische functie van het Effector eiwit verheldoen tijdens infectie. De toxiciteits-en suppressor schermen zijn ook krachtige hulpmiddelen voor het ontcijferen van de fysiologische functie van bacteriële Effector eiwitten die niet fysiek gastheer eiwitten binden met affiniteiten die voldoende zijn om te detecteren door immunoprecipitatie of die interageren met de host in enzymatische hit-and-run interacties die mogelijk niet worden gedetecteerd door een gist-twee hybride scherm.
Hoewel het suppressor-scherm een krachtige methode kan zijn om potentiële fysiologische interacties tussen bacteriële Effector eiwitten en hosttrajecten te onthullen, moet het bacteriële Effector eiwit een groei fout in gist induceren, anders gebruikt het in de het onderdrukker scherm zal weinig gebruikt worden. Bovendien moet het toxische fenotype resulteren in ten minste een 2 − 3 log10 -tekort in groei of het zal moeilijk zijn om suppressors te identificeren. Als een laboratorium is opgezet voor celkweek, screening Effector eiwitten voor toxiciteit in gemeenschappelijke cellijnen zoals HeLa kan vaak inzicht geven of het de moeite waard om door te gaan met de gist toxiciteit scherm. Ectopische uitdrukking van het Effector-eiwit in HeLa-cellen leidt soms tot toxiciteit die zeer sterk correleert met de toxiciteit in de gist stam die voor deze schermen wordt gebruikt4. Waarneembare kenmerken van stress in HeLa-cellen zijn verlies van stress vezels, celloslating van de plaat en nucleaire condensatie die apoptosis aangeeft. Elke visuele indicatie van stress in HeLa-cellen maakt het eiwit van belang een goede kandidaat voor het induceren van een groei fout in gist, die veel sneller repliceert en dus beter reageert op perturbatie van essentiële trajecten.
Opgemerkt moet worden dat het onderdrukker scherm niet altijd host binding partners identificeert als onderdrukkers, maar het kan nog steeds cruciale componenten van de beoogde host-traject (en) impliceren, wat een holistisch beeld oplevert van de biologische processen die worden gekaapt door de bacteriële Effector eiwitten. Op het oppervlak, dit lijkt contra-intuïtief, omdat het verstrekken van de bindende partner van de Effector eiwit in overmaat zou worden verwacht dat de groei defect te redden. Bij inspanningen om trajecten te identificeren die zijn getarget door de C. trachomatis Effector Protein CT229 (cpos), die bindt aan ten minste 10 verschillende Rab GTPases tijdens infectie5, onderdrukte geen van de bindende partners van Rab de toxiciteit van CT229. Er werden echter talrijke onderdrukkers geïdentificeerd die betrokken waren bij de handel met clathrin-Coated blaasje (CCV), wat leidde tot verder werk dat aantoont dat CT229 in het bijzonder Rab-afhankelijke CCV-mensenhandel ondermijnt. Evenzo, bij het onderzoeken van de C. burnetii Effector Protein Cbu0041 (CIRA) verschillende Rho gtpases die de gist groei defect gered werden geïdentificeerd, en het werd later gevonden dat CIRA fungeert als een GTPase activeren eiwit (Gap) voor rhoa4.
Het nut van de gist suppressor scherm voor verhelderende gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten kan niet worden overschat, en andere onderzoekers proberen te karakteriseren intracellulaire bacteriële Effector eiwitten kunnen sterk profiteren van deze technieken. Deze assays zijn van waarde als immunoprecipitaties en/of gist-twee hybride schermen hebben nagelaten een bindende partner te vinden en kunnen verheldoen welke trajecten zijn gericht op het bacteriële Effector eiwit. Hier, gedetailleerde protocollen voor de toxiciteit en suppressor schermen om gastheer biologische trajecten doelwit van intracellulaire bacteriële Effector eiwitten identificeren, evenals enkele van de gemeenschappelijke obstakels ervaren bij het gebruik van deze testen en hun bijbehorende oplossingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

Intracellulaire bacteriën scheiden virulentie factoren die Effector eiwitten worden genoemd in de gastheer cytosol die handelen om gastheer eiwitten en/of hun geassocieerde biologische trajecten te verdraaien ten voordele van de bacterie. Identificatie van vermoedelijke bacteriële Effector eiwitten is meer beheersbaar geworden als gevolg van vooruitgang in bacteriële genoom volgordebepaling en de opkomst van algoritmen die toelaten in silico identificatie van genen coderen van secretie kandidaten en/of eukaryotic-achtige Domeinen. De identificatie van deze belangrijke virulentie factoren is echter slechts een eerste stap. Het doel is natuurlijk om de moleculaire functie van Effector eiwitten te bepalen en te verhelderen hoe ze omgaan met de gastheer. In de afgelopen jaren hebben technieken zoals het gist-twee-hybride scherm en grootschalige immunoprecipitaties in combinatie met massaspectrometrie geholpen bij de identificatie van eiwit-eiwit interacties. Hoewel identificatie van een host binding partner de cruciale eerste stap is om de moleculaire functie van een bacterieel Effector eiwit te verhelderend, wordt soms vastgesteld dat het gastheer eiwit meerdere biologische functies heeft (bijv. actin, clathrin, tubuline) of het bacteriële eiwit kan niet fysiek binden gastheer eiwitten, het ontnemen van de onderzoeker van cruciale informatie over de precieze gastheer traject wordt gemanipuleerd. Een gemodificeerd gist toxiciteits scherm in combinatie met een suppressor scherm is aangepast om gastheer trajecten te identificeren die worden beïnvloed door bacteriële Effector eiwitten. Het toxiciteits scherm is afhankelijk van een toxisch effect in gist veroorzaakt door de Effector proteïne interfereren met de gastheer biologische trajecten, die vaak manifesteert als een groei fout. De uitdrukking van een gist genomische bibliotheek wordt gebruikt om gastheerfactoren te identificeren die de toxiciteit van het bacteriële Effector eiwit onderdrukken en zo eiwitten identificeren in het traject dat het Effector eiwit target. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies voor zowel de toxiciteits-als de suppressor-schermen. Deze technieken kunnen worden uitgevoerd in elk lab dat geschikt is voor moleculair klonen en teelt van gist en Escherichia coli.

Voordat de werkelijke gist suppressor scherm kan worden uitgevoerd, de Effector eiwit van belang moet worden getest op toxiciteit in gist. Dit wordt bereikt door het uiten van het eiwit van belangstelling voor gist onder de controle van een galactose-inducible promotor. Groei van glucose (niet-inducerende voorwaarden) moet eerst worden vergeleken om ervoor te zorgen toxiciteit is specifiek te wijten aan de uitdrukking van het eiwit van belang en is niet een algemeen defect. Zoals weergegeven in Figuu...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Intracellulaire bacteriën scheiden effector-eiwitten af in de gastheer die biologische paden kunnen manipuleren om de overleving van ziekteverwekkers te bevorderen. Het onthullen van gastheerdoelen van effectoren is essentieel voor het begrijpen van intracellulaire ziekteverwekkers zoals Chlamydia trachomatis. Gisttoxiciteit en suppressor schermen kunnen belangrijke inzicht geven met betrekking tot het natuurlijke biologische doel van bacteriële effector eiwitten en kan vooral nuttig zijn wanneer een bindende partner onbekend is.We tonen de gist toxiciteit en suppressor testen hier voor screening voor Chlamydia trachomatis effector eiwitten, maar deze techniek is ook gebruikt voor het karakteriseren legionella pneumophila en Coxiella burnetii effectors. Begin met het inenten van vijf milliliter enkele drop-out bouillon met de enkele kolonie gist getransformeerd met de effector eiwit dat plasmide. Gebruik gist getransformeerd met de vector alleen als een negatieve controle en incubeer het entcuum 's nachts op 30 graden Celsius tijdens het schudden.Voeg de volgende dag 180 microliter steriel water toe aan de A2 via A6-putten van een 96-putplaat. Vortex de nachtelijke cultuur en voeg 180 microliter gist toe aan goed A1. Verdun vervolgens de gist in de putten in serie met water. Gebruik een multi-channel pipet om vijf microliter van elke verdunning op enkele drop-out glucose en single drop-out galactose agar platen spot en incubaat de platen op 30 graden Celsius gedurende 48 uur.Na de incubatie, visueel beoordelen toxiciteit door het vergelijken van de groei van gist uitdrukken van de effector eiwit geteeld op de galactose-bevattende media aan de groei van gist uitdrukken van de vector alleen. Inoculeren 100 milliliter van de enkele drop-out bouillon met een milliliter van de eerder bereidgist voorraad en incubeer het voor 16 tot 24 uur bij 30 graden Celsius met schudden op 150 RPM. Op de volgende dag, voeg de gehele 100 milliliter van de nachtcultuur aan 900 milliliter voorverwarmde enige drop-out bouillon toe en kweek de fles vier tot vijf uren bij 30 graden Van Celsius terwijl het schudden.Na de incubatie, pellet de cultuur op 6.000 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 250 milliliter steriel water. Herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant weg.Dan resuspend de pellet in 250 milliliter van een millimolar lithium acetaat. Pellet de cultuur door centrifugatie, verwijder het lithiumacetaat en zet de pellet opnieuw op in 9,6 milliliter van 50%PEG 3350. Voeg vervolgens transformatiereagentia toe zoals beschreven in het manuscript en pas het volume aan tot 15 milliliter met steriel water dat voorzichtig omkeert om te mengen.Incubeer het mengsel op 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 750 microliter DMSO toe en broed in een waterbad bij 42 graden Celsius gedurende nog eens 30 minuten. Het toevoegen van de DMSO voor een hitteschok is cruciaal om een hoge transformatie-efficiëntie te bereiken.Na de incubatie, pellet de gist door centrifugeren op 3,000 keer g gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant en was de pellet met 10 milliliter steriel water herhaal dan de centrifugatie om de gist pellet. Resuspend de pellet in acht milliliter water.Bepaal de transformatie-efficiëntie door het monster één tot 10 te verdunnen en 100 microliter van elke verdunning op dubbele drop-out agar te verdunnen. Dan plaat 200 microliter van het monster op dubbele drop-out galactose agar platen en de platen incuberen op 30 graden Celsius gedurende 48 tot 96 uur of totdat kolonies verschijnen. Zodra kolonies zijn verschenen, patch ze op dubbele drop-out galactose agar en broeden ze voor nog eens 24 tot 48 uur.Gebruik een deel van de patch om vijf milliliter dubbele drop-out bouillon inenten en het inoculum 's nachts in te broeden op 26 graden Celsius met schudden bij 150 RPM. Voeg de volgende dag 180 microliter steriel water toe aan vijf putten van een 96-putplaat die begint met goed A2. Vortex de nachtelijke cultuur mix. Voeg 180 microliter gist toe om A1 goed te doen en verdun het serieel met behulp van het water in putten A2 tot en met A6. Spot vijf microliters van elke verdunning op enkele drop-out glucose en single drop-out galactose agar platen ervoor te zorgen dat de giftige effector alleen als een controle.Broed de platen op 30 graden Celsius gedurende 48 uur en vergelijk de groei van de gist met toxische effector alleen met de groei van gist met de potentiële suppressor. Om suppressors te bevestigen die verminderde toxiciteit in vergelijking met de giftige effector alleen hebben aangetoond, isoleer het plasmid volgens manuscriptrichtingen en zet het opnieuw in de giftige gist. Inenting dubbele drop-out glucose bouillon met een kolonie van de transformatie plaat.Incubeer het 's nachts en ter plaatse op dubbele drop-out glucose en galactose agar om onderdrukking van toxiciteit te bevestigen. Voorafgaand aan het uitvoeren van de gist suppressor scherm, de effector eiwitten van belang werden getest op toxiciteit in gist. Het eiwit van belang werd uitgedrukt in gist onder de controle van een galactose induceerbare promotor en de groei op galactose werd vergeleken met de groei op glucose.Toen CT229 werd getest op toxiciteit, werden kleinere kolonies en groeionderdrukking waargenomen. Idealiter moet een twee tot drie log afname worden waargenomen om verder te gaan met gist suppressor schermen. De suppressor scherm werd uitgevoerd door het transformeren van de giftige stam met de gist genomische bibliotheek pYAP 13 en plating de transformatoren op galactose agar.De verkregen suppressor klonen werden gespot op dubbele drop-out galactose agar om onderdrukking van toxiciteit te bevestigen. Suppressors pSup1 en pSup2 onderdrukten de toxiciteit van het effector-eiwit, terwijl pSup3 dat niet deed. Deze procedures vereisen zorgvuldige aandacht voor detail in aanvulling op kritische voorbereidende werkzaamheden, waaronder het hebben van grote hoeveelheden media en platen klaar voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment.Zodra suppressors zijn geïdentificeerd, experimenten kunnen worden uitgevoerd om interacties met de effector van belang met inbegrip van pull downs, immunofluorescentie colocalisatie, effector knock-out of knockdown van host factoren geïdentificeerd in de schermen te verifiëren. De ontwikkeling van deze techniek voor Chlamydia-effectoren heeft gezorgd voor versnelde voorlopige karakterisering van effector-eiwitten en heeft geholpen om onze inspanningen te richten op het verduidelijken van de onderliggende moleculaire mechanismen die interacties met gastheerpathogen bemiddelen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Versnelde straling Biodosimetry geautomatiseerde door Dicentric chromosoom identificatie (ADCI) en de schatting van de dosis

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping2 methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...