Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Nous remercions Shelby Andersen, Abby McCullough et Laurel Woods pour leur aide dans ces techniques. Cette étude a été financée par des fonds de démarrage du Département de microbiologie et d'immunologie de l'Université de l'Iowa à Mary M. Weber.

1. Préparation des médias et des réactifs
REMARQUE: Les assiettes doivent être préparées avant le jour de l'assidu et sont bonnes pour 1 mois. Les médias et les réactifs peuvent être faits à tout moment et sont bons pour 1 mois.
<ol><li>Préparer 1 L de la solution de glucose (10 % w/v) en dissolvant 100 g de D-()-glucose dans 800 ml d'eau distillée dans un bécher de 1 000 ml. Ajuster le volume à 1 L avec de l'eau distillée. Filtrer à travers un filtre stérile de 0,2 m dans u...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. 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V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

Ce protocole décrit les procédures étape par étape pour identifier les voies biologiques hôtes ciblées par les protéines effectrices bactériennes à l'aide d'une toxicité de levure modifiée et d'un écran suppresseur. La souche de levure utilisée, S. cerevisiae W303, est auxotrophique à la fois pour l'uracil et la leucine. Uracil auotrophy de la souche est utilisé pour sélectionner la levure portant la protéine d'intérêt sur le vecteur pYesNTA-Kan tandis que la leucine auotrophy est utilisé pou...

Le premier rapport de procédures similaires à ceux présentés ici caractérisait l'effecteur de type IV de Legionella pneumophila SidD, un deAMPylase qui modifie Rab11. Des techniques comparables ont été utilisées pour la caractérisation de plusieurs effecteurs de L. pneumophila 1,2,3. L'assay a été adapté pour caractériser une Coxiella burnetii type IV effector protéine4, et récemment l'utilité de cette technique a été élargie pour la caractérisation des protéines de membrane d'inclusion chlamydia trachomatis 5 .
Ce protocole peut être divisé en deux parties principales : 1) l'écran de toxicité de levure, dans lequel la protéine d'effetur bactérien d'intérêt est exprimée dans la levure et les clones sont examinés pour un phénotype toxique comme démontré par un défaut de croissance, et 2) l'écran de suppression de levure , dans lequel le phénotype toxique est supprimé par l'expression d'une bibliothèque génomique de levure dans la souche toxique. Ainsi, l'écran de toxicité est un écran pour les phénotypes toxiques qui se manifestent comme des défauts de croissance lorsque l'effecteur bactérien d'intérêt est surexprimé. Les clones toxiques, transformés avec succès avec et exprimant l'effecteur bactérien, sont sélectionnés et sauvegardés pour l'étape suivante. La deuxième étape majeure consiste à surexprimer une bibliothèque génomique de levure partiellement digérée dans le clone de levure toxique. Les plasmides constituant la bibliothèque génomique de levure suggérée pour l'utilisation dans ce protocole portent des inserts de 5 à 20 kb, correspondant habituellement à des cadres de lecture ouverts à 3 à 13 levures (ORF) d'une taille moyenne de gène de 1,5 kb sur tous les plasmides, représentant l'ensemble du génome couvert de levures environ 10x. Cette partie de l'assay est appelée l'écran suppresseur, comme le but est de supprimer la toxicité de la protéine effectrice bactérienne. Les plasmides suppresseurs potentiels sont isolés de la levure, séquencés, et les ORF sépilleurs identifiés. La raison d'être de l'écran suppresseur est que la protéine effectrice lie, interagit avec, et / ou submerge les composants de la voie hôte qu'il cible, et que fournir ces protéines hôtes en excès peut sauver l'effet toxique sur la voie et donc, le défaut de croissance. Ainsi, les ORF identifiés qui suppriment la toxicité représentent souvent plusieurs participants d'une voie d'hôte. Des expériences orthogonales sont ensuite effectuées pour vérifier que l'effecteur bactérien interagit en effet avec la voie impliquée. Ceci est particulièrement nécessaire si un partenaire liant tel que la clathrine ou l'actine a été identifié, parce que ces protéines sont impliquées dans une multitude de processus hôtes. D'autres expériences peuvent alors élucider la fonction physiologique de la protéine effectrice pendant l'infection. La toxicité et les écrans suppresseurs sont également de puissants outils pour déchiffrer la fonction physiologique des protéines effectrices bactériennes qui ne lient pas physiquement les protéines hôtes avec des affinités suffisantes pour détecter par immunoprécipitation ou qui interagissent avec le hôte dans les interactions hit-and-run enzymatiques qui peuvent ne pas être détectées par un écran hybride de levure-deux.
Bien que l'écran suppresseur puisse être une méthode puissante pour révéler les interactions physiologiques potentielles entre les protéines d'effecteur bactérien et les voies d'hôte, la protéine d'effecteur bactérien doit induire un défaut de croissance dans la levure, autrement l'utilisant dans le l'écran suppresseur sera de peu d'utilité. En outre, le phénotype toxique doit entraîner au moins un déficit de croissance de 2 à 3 log10, sinon il sera difficile d'identifier les suppresseurs. Si un laboratoire est mis en place pour la culture cellulaire, les protéines effecteurs de dépistage de la toxicité dans les lignées cellulaires communes telles que HeLa peut souvent donner un aperçu de savoir si elle vaut la peine de procéder à l'écran de toxicité de levure. L'expression ectopique de la protéine effectrice dans les cellules HeLa entraîne parfois une toxicité qui est très fortement corrélée avec la toxicité de la souche de levure utilisée pour ces écrans4. Les caractéristiques observables du stress dans les cellules HeLa comprennent la perte de fibres de stress, le détachement cellulaire de la plaque et la condensation nucléaire indiquant l'apoptose. Toute indication visuelle de stress dans les cellules HeLa font de la protéine d'intérêt un bon candidat pour induire un défaut de croissance dans la levure, qui se répliquent beaucoup plus rapidement et sont donc plus sensibles à la perturbation des voies essentielles.
Il convient de noter que l'écran suppresseur n'identifie pas toujours les partenaires liant l'hôte comme des suppresseurs, mais il peut toujours impliquer des composants critiques de la voie hôte (s) ciblée, donnant une vue holistique des processus biologiques détournés par le protéine effecteur bactérienne. À première vue, cela semble contre-intuitif, car on s'attendrait à ce que le fait de fournir le partenaire de liaison de la protéine effecteur en excès sauve le défaut de croissance. Dans les efforts visant à identifier les voies ciblées par la protéine C. trachomatis effector CT229 (CpoS), qui se lie à au moins 10 Rab GTPases différents pendant l'infection5, aucun des partenaires de liaison Rab supprimé la toxicité de CT229. Cependant, de nombreux suppresseurs impliqués dans le trafic de vésicule enduite de clathrine (CCV) ont été identifiés, ce qui a conduit à d'autres travaux démontrant que CT229 subvertit spécifiquement le trafic de CCV dépendant de Rab. De même, lors de l'étude de la protéine effectrice C. burnetii Cbu0041 (CirA) plusieurs Rho GTPases qui ont sauvé le défaut de croissance de levure ont été identifiés, et il a été plus tard constaté que CirA fonctionne comme une protéine d'activation GTPase (GAP) pour RhoA4.
L'utilité de l'écran suppresseur de levure pour élucider des voies d'hôte visées par des protéines d'effecteur bactérienne ne peut pas être surestimée, et d'autres chercheurs essayant de caractériser les protéines d'effecteur bactérien intracellulaire peuvent grandement bénéficier de ces techniques. Ces essais sont de valeur si les immunoprécipitations et/ou les écrans hybrides de levure-deux n'ont pas réussi à trouver un partenaire liant et peuvent élucider quelles voies sont visées par la protéine d'effecteur bactérien. Ici, des protocoles détaillés pour la toxicité et les écrans suppresseurs pour identifier les voies biologiques d'hôte visées par les protéines d'effecteur bactérien intracellulaire sont fournis, aussi bien que quelques-uns des obstacles communs éprouvés en utilisant ces essais et leur solutions correspondantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

Les bactéries intracellulaires sécrètent des facteurs de virulence appelés protéines effectrices dans le cytosol hôte qui agissent pour subvertir les protéines hôtes et/ou leurs voies biologiques associées au profit de la bactérie. L'identification des protéines effectrices bactériennes présumées est devenue plus gérable en raison des progrès dans le séquençage du génome bactérien et de l'avènement d'algorithmes qui permettent dans l'identification silico des gènes codant les candidats à la sécrétion et/ou de l'eucaryote Domaines. Cependant, l'identification de ces facteurs importants de virulence n'est qu'une première étape. Naturellement, l'objectif est de déterminer la fonction moléculaire des protéines effectrices et d'élucider la façon dont elles interagissent avec l'hôte. Ces dernières années, des techniques comme l'écran bi-hybride de levure et les immunoprécipitations à grande échelle couplées à la spectrométrie de masse ont aidé à identifier les interactions protéine-protéine. Bien que l'identification d'un partenaire liant hôte soit la première étape cruciale vers l'élucidation de la fonction moléculaire d'une protéine effectrice bactérienne, parfois la protéine hôte présente de multiples fonctions biologiques (p. ex. actine, clathrine, tubuline) ou la protéine bactérienne peut ne pas lier physiquement les protéines de l'hôte, privant le chercheur d'informations cruciales sur la voie précise de l'hôte manipulée. Un écran modifié de toxicité de levure couplé avec un écran de suppresseur a été adapté pour identifier des voies d'hôte impactées par les protéines d'effecteur bactérien. L'écran de toxicité repose sur un effet toxique dans la levure causé par la protéine effecteur interférer avec les voies biologiques de l'hôte, qui se manifeste souvent comme un défaut de croissance. L'expression d'une bibliothèque génomique de levure est employée pour identifier des facteurs d'hôte qui suppriment la toxicité de la protéine d'effecteur bactérien et identifient ainsi des protéines dans la voie que la protéine effectrice cible. Ce protocole contient des instructions détaillées pour les écrans de toxicité et de suppresseur. Ces techniques peuvent être réalisées dans n'importe quel laboratoire capable de clonage moléculaire et la culture de levure et Escherichia coli.

Avant que l'écran de suppression de levure réel puisse être exécuté, la protéine d'effeteur d'intérêt doit être examinée pour la toxicité dans la levure. Ceci est accompli en exprimant la protéine d'intérêt pour la levure sous le contrôle d'un promoteur galactose-inductible. La croissance du glucose (conditions non induisantes) doit d'abord être comparée pour s'assurer que la toxicité est spécifiquement due à l'expression de la protéine d'intérêt et n'est pas un défaut général. Comme le montre <...

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Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Les agents pathogènes bactériens sécrètent des protéines dans l'hôte qui ciblent des processus biologiques cruciaux. L'identification des voies d'accueil ciblées par les protéines effecteurs bactériens est essentielle pour lutter contre la pathogénie moléculaire. Ici, une méthode utilisant un suppresseur modifié de levure et un écran de toxicité pour élucider des voies d'hôte visées par les protéines bactériennes toxiques d'effecteur est décrite.

Identification des voies d'accueil ciblées par les protéines d'effetbactérieur à l'aide d'écrans de toxicité et de suppression de levures

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Les bactéries intracellulaires sécrètent des protéines effectrices dans l’hôte qui peuvent manipuler les voies biologiques pour favoriser la survie des pathogènes. Révéler les cibles hôtes des effecteurs est essentiel pour comprendre les pathogènes intracellulaires comme Chlamydia trachomatis. La toxicité des levures et les écrans suppresseurs peuvent fournir un aperçu clé de la cible biologique naturelle des protéines effectrices bactériennes et peuvent être particulièrement utiles lorsqu’un partenaire liant est inconnu.Nous démontrons la toxicité de levure et les analyses de suppresseur ici pour le criblage pour des protéines d’effecteur de trachomatis de Chlamydia, mais cette technique a également été employée pour caractériser legionella pneumophila et effecteurs de burnetii de Coxiella. Commencez par inoculer cinq millilitres de bouillon d’abandon unique avec la colonie unique de levure transformée avec la protéine effectrice contenant du plasmide. Utilisez la levure transformée avec le vecteur seul comme un contrôle négatif et incuber l’inoculum pendant la nuit à 30 degrés Celsius tout en secouant.Le lendemain, ajouter 180 microlitres d’eau stérile aux puits A2 à A6 d’une plaque de 96 puits. Vortex de la culture de nuit et ajouter 180 microlitres de levure au puits A1. Ensuite, diluer périodiquement la levure dans les puits avec de l’eau. Utilisez une pipette multicanal pour repérer cinq microlitres de chaque dilution sur un seul glucose décrocheur et des plaques d’agar galactose décrocheuses et incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures.Après l’incubation, évaluer visuellement la toxicité en comparant la croissance de la levure exprimant la protéine effectrice cultivée sur le média contenant de la galactose à la croissance de levure exprimant le seul vecteur. Inoculer 100 millilitres du bouillon d’abandon unique avec un millilitre du bouillon de levure préalablement préparé et l’incuber pendant 16 à 24 heures à 30 degrés Celsius avec secousses à 150 RPM. Le lendemain, ajouter les 100 millilitres entiers de la culture nocturne à 900 millilitres de bouillon unique préchauffé et incuber le flacon pendant quatre à cinq heures à 30 degrés Celsius en secouant.Après l’incubation, pelleter la culture à 6000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille en 250 millilitres d’eau stérile. Répétez la centrifugation et jetez le supernatant.Puis resuspendez la pastille en 250 millilitres d’acétate de lithium millimlaire. Pelleter la culture par centrifugation, enlever l’acétate de lithium, et resuspendre la pastille en 9,6 millilitres de 50%PEG 3350. Ajoutez ensuite les réapprovisionnements de transformation tels que décrits dans le manuscrit et ajustez le volume à 15 millilitres avec de l’eau stérile inversant doucement pour mélanger.Incuber le mélange à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 750 microlitres de DMSO et incuber dans un bain d’eau à 42 degrés Celsius pendant encore 30 minutes. L’ajout du DMSO avant le choc thermique est crucial pour atteindre une efficacité de transformation élevée.Après l’incubation, pelleter la levure en centrifugant à 3000 fois g pendant cinq minutes. Jeter le supernatant et laver la pastille avec 10 millilitres d’eau stérile, puis répéter la centrifugation pour pelleter la levure. Resuspendez la pastille en huit millilitres d’eau.Déterminez l’efficacité de la transformation en diluant l’échantillon un à 10 et en placage de 100 microlitres de chaque dilution sur une double agar décrochée. Ensuite, plaquez 200 microlitres de l’échantillon sur les plaques d’agar galactose double abandon et couvez les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 à 96 heures ou jusqu’à ce que les colonies apparaissent. Une fois que les colonies sont apparues, patchez-les sur la double agar galactose décrochées et incubez-les pendant encore 24 à 48 heures.Utilisez une partie de la tache pour inoculer cinq millilitres de bouillon double abandon et incuber l’inoculum pendant la nuit à 26 degrés Celsius avec des secousses à 150 RPM. Le lendemain, ajouter 180 microlitres d’eau stérile à cinq puits d’une plaque de 96 puits en commençant par le puits A2. Vortex le mélange de culture du jour au lendemain. Ajouter 180 microlitres de levure au puits A1 et les diluer en série en utilisant l’eau dans les puits A2 à A6. Placez cinq microlitres de chaque dilution sur le glucose décrocheur unique et les plaques d’agar galactose d’abandon unique en s’assurant d’inclure l’effecteur toxique seul comme contrôle.Incuber les plaques à 30 degrés Celsius pendant 48 heures, puis comparer la croissance de la levure avec effecteur toxique seul à la croissance de la levure avec le suppresseur potentiel. Pour confirmer les suppresseurs qui ont démontré une toxicité diminuée par rapport à l’effecteur toxique seul, isoler le plasmide selon les instructions manuscrites et le transformer en levure toxique. Inoculer le bouillon de glucose double décrochage avec une colonie de la plaque de transformation.Incubez-le pendant la nuit et repérait sur le glucose double abandon et l’agar de galactose pour confirmer la suppression de la toxicité. Avant d’effectuer l’écran suppresseur de levure, les protéines effectrices d’intérêt ont été testées pour la toxicité dans la levure. La protéine d’intérêt a été exprimée dans la levure sous le contrôle d’un promoteur inductible de galactose et la croissance sur le galactose a été comparée à la croissance sur le glucose.Lorsque le CT229 a été testé pour la toxicité, de plus petites colonies et la suppression de la croissance ont été observées. Idéalement, une diminution de deux à trois rondins devrait être observée pour procéder à des écrans suppresseurs de levure. L’écran suppresseur a été réalisé en transformant la souche toxique avec la bibliothèque génomique de levure pYAP 13 et en placage des transformateurs sur l’agar galactose.Les clones suppresseurs obtenus ont été repérés sur une double agar galactose décrochée pour confirmer la suppression de la toxicité. Suppresseurs pSup1 et pSup2 supprimé la toxicité de la protéine effecteur tandis que pSup3 n’a pas. Ces procédures nécessitent une attention particulière aux détails en plus des travaux préparatoires critiques, y compris le fait d’avoir de grandes quantités de supports et de plaques prêts avant d’effectuer l’expérience.Une fois que les suppresseurs sont identifiés, des expériences peuvent être effectuées pour vérifier les interactions avec l’effecteur d’intérêt, y compris les retraits, la colocalisation de l’immunofluorescence, le KO effecteur ou le renversement des facteurs d’hôte identifiés dans les écrans. Le développement de cette technique pour les effecteurs de chlamydia a permis une caractérisation préliminaire accélérée des protéines effectrices et a aidé à concentrer nos efforts sur l’élucidation des mécanismes moléculaires sous-jacents qui médiation les interactions des pathogènes hôtes.

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