Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

אנו מודים לשלבי אנדרסן, אבי מקלאוף, ולורל וודס על עזרתם בטכניקות אלו. מחקר זה מומן על ידי כספי האתחול מאוניברסיטת איווה המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה כדי מרי מ. וובר.

1. הכנת מדיה וריאגנטים
הערה: לוחיות הרישוי צריכות להיות מוכנות לפני היום, וטובות לחודש אחד. מדיה וריאגנטים ניתן לעשות בכל שלב וטוב לחודש 1.
<ol><li>להכין 1 L של תמיסת גלוקוז (10% w/v) על ידי המסת 100 g של D-(+)-גלוקוז ב 800 מ ל של מים מזוקקים בגביע 1, 000 mL. כוונן את אמצעי האחסון ל-1 ל' עם מים מזוקק?...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר הליכים צעד אחר צעד לזיהוי מסלולים ביולוגיים מארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור באמצעות הרעלת שמרים שונה מסך מדכא. זן שמרים השתמשו, ס cerevisiae ס W303, הוא auxotrophic עבור אורציל ו leucine. Uracil הגביע של הנבג משמש כדי לבחור שמרים נושאת את החלבון של עניין על pYesNTA-Kan וקטור בעוד לאו?...

הדו ח הראשון של ההליכים הדומים לאלה שהוצגו כאן אפיינו את הלגיונרים האלה מסוג העירוי הרביעי, שהוא deAMPylase שמשנה Rab11. טכניקות דומות שימשו לאפיון של מספר L. משאבה מנועי 1,2,3. השיטה הותאמה כדי לאפיין את הסוג Coxiella בורנתיבי הרביעיחלבון,ולאחרונה את השירות של טכניקה זו הורחבה לאפיון של כלמידיה trachomatis ממברנה חלבונים5 .
פרוטוקול זה ניתן לפרוץ לשני חלקים עיקריים: 1) את המסך רעילות שמרים, שבה חלבון החומר החיידקי של עניין מתבטא שמרים שיבוטים מוקרן לפנוטיפ רעיל כפי שמעידים על ידי פגם גדילה, ו 2) מסך מדכא שמרים , שבו הפנוטיפ הרעיל מדוכאים על ידי ביטוי של ספרייה גנומית שמרים במתח הרעיל. כך, את המסך רעילות היא מסך עבור פנוטיפים רעילים המניפסט כמו ליקויים בגדילה כאשר החיידק החיידקי של העניין הוא ביטוי יתר. שיבוטים רעילים, השתנה בהצלחה עם וביטוי האפקטור חיידקי, נבחרו ונשמר לשלב הבא. הצעד העיקרי השני כרוך יתר על הביטוי בספרייה גנומית חלקית שמרים מתעכל בשכפול שמרים רעילים. פלמידים ממציא את הספרייה גנומית שמרים הציע לשימוש בפרוטוקול זה לשאת 5-20 kb מוסיף, בדרך כלל מתאים 3-13 שמרים לקרוא מסגרות לקריאה (ORF) של גודל הגן הממוצע של ~ 1.5 kb על פני כל פלמידים, המייצגים גנום שמרים כולו מכוסה כ-10x. חלק זה של השיטת נקרא מסך מדכא, כמו המטרה היא לדכא את רעילות של חלבון אפקטור חיידקי. הפלמיונים הפוטנציאליים של מדכא מבודדים משמרים, ברצף ומזוהים הדיכוי ORFs. הרציונל הנמצא בבסיס מסך מדכא הוא כי חלבון האפקטור נקשר, אינטראקציה עם, ו/או להתמקד ברכיבים של מסלול מארח זה מטרות, וכי מתן אלה חלבונים מארחים בחזרה עודף יכול להציל את ההשפעה הרעילה על השביל ולכן, פגם הגדילה. כך, מזוהה ORFs כי לדכא רעילות לעתים קרובות מייצגים משתתפים רבים של מסלול מארח. ניסויים אורתוגונאליות מבוצעים לאחר מכן כדי לוודא כי האפקטור חיידקי אכן אינטראקציה עם השביל מעורבים. הדבר הכרחי במיוחד אם התגלתה שותפה מחייבת כגון clathrin או אקטין, משום שחלבונים אלה מעורבים בהמון תהליכים מארחים. ניסויים נוספים יכולים להבהיר את התפקוד הפיזיולוגי של חלבון האפקטור במהלך הזיהום. רעילות מסכי מדכא הם גם כלים רבי עוצמה לפענוח התפקוד הפיזיולוגי של חלבונים אפקטור חיידקי כי לא לאגד פיזית מארח חלבונים עם מספיק כדי לזהות על ידי immunoprecipitation או כי אינטראקציה עם ארח באינטראקציות פגע וברח אנזימטיות שאינן מזוהות על-ידי מסך היברידי משני שמרים.
למרות מסך מדכא יכול להיות שיטה רבת עוצמה כדי לחשוף אינטראקציות פיזיולוגיות פוטנציאליות בין חלבונים אפקטור חיידקים ומסלולים מארחים, חלבון אפקטור חיידקי חייב לגרום לפגם גדילה שמרים, אחרת באמצעות זה ב מסך משתיק קול יהיה שימוש קטן. יתר על כן, הפנוטיפ הרעיל חייב לגרום לפחות 2-3 יומן רישום10 הגרעון בצמיחה או יהיה קשה לזהות דכאי. אם המעבדה מוגדרת לתרבות התאים, הקרנת חלבונים לרעילות בקווי תאים משותפים כגון הלה יכולה לעתים קרובות להעניק תובנה לגבי המאמץ להמשיך במסך הרעילות לשמרים. ביטוי חוץ רחמי של חלבון אפקטור בתאי הלה לפעמים גורמת לרעילות כי מתאים מאוד רעילות בזן שמרים המשמש מסכים אלה4. סימני ההיכר של הלחץ בתאי הלה כוללים אובדן סיבי לחץ, ניתוק תאים מהצלחת, ועיבוי גרעיני המציין אפופטוזיס. כל אינדיקציה חזותית של מתח בתאי הלה להפוך את החלבון של עניין מועמד טוב לגרימת פגם גדילה בשמרים, אשר לשכפל הרבה יותר במהירות, ולכן מגיבים יותר להפרעות חיוניות של מסלולים חיוניים.
יצוין כי מסך מדכא לא תמיד לזהות שותפים איגוד מארח כמו דכאי, אבל זה עדיין יכול לסבך רכיבים קריטיים של מסלול מארח (s) ממוקדות, מניב השקפה הוליסטית של התהליכים הביולוגיים נחטף על ידי ה חלבון אפקטור חיידקי. על פני השטח, זה נראה מנוגד לאינטואיציה, משום שמתן שותף מחייב בחלבון האפקטור המיותר צפוי להציל את הפגם בגדילה. במאמצים לזהות מסלולים המיועדים על ידי C. trachomatis אפקטור חלבון CT229 (cpos), אשר נקשר לפחות 10 שונים רב GTPases במהלך זיהום5, אף אחד מהשותפים מחייב ראב לדכא את רעילות של CT229. עם זאת, מדכאי רבים המעורבים בסחר בסמים (CCV) מצופים, אשר הובילו לעבודה נוספת הממחיש כי CT229 במפורש פוגעת בסחר בנשק CCV. באופן דומה, בעת חקירת ה -C. burנתיבי אפקטור חלבון Cbu0041 (cira) כמה Rho GTPases כי הצילה את הפגם בגידול שמרים זוהו, ומאוחר יותר נמצא כי cira פונקציות כמו Gtpases הפעלת חלבון (גאפ) עבור rhoa4.
השימושיות של מסך מדכא שמרים להסבר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור לא יכול להיות יתר על המידה, וחוקרים אחרים מנסה לאפיין חלבונים תאיים אפקטור חיידקים יכול להפיק תועלת רבה מ טכניקות אלה. אלה מספרים הם בעלי ערך אם immunoprecipitations ו/או שמרים-שני מסכי היברידית לא הצליחו למצוא שותף מחייב והוא יכול להבהיר איזה מסלולים מיועדים על ידי חלבון אפקטור חיידקי. כאן, פרוטוקולים מפורטים עבור מסכי רעילות ומדכא כדי לזהות מסלולים ביולוגיים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריאלי תאיים אפקטור מסופקים, כמו גם כמה מכשולים נפוצים מנוסים בעת שימוש אלה בחני וה פתרונות תואמים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

חיידקים תאיים להפריש גורמים התקפה אלימה הנקרא אפקטור חלבונים לתוך ציטוסול מארח כי לפעול לחתור מארחים חלבונים ו/או מסלולים ביולוגיים הקשורים שלהם לטובת החיידק. זיהוי של חלבונים בקטריאלי החיידק אפקטור הפכה יותר לניהול בשל ההתקדמות ברצף הגנום החיידקי ואת הופעתו של אלגוריתמים המאפשרים זיהוי סיליקו של גנים קידוד הפרשת מועמדים ו/או eukaryotic כמו תחומים. עם זאת, זיהוי של גורמים והתקפה אלימה אלה הוא רק צעד התחלתי. באופן טבעי, המטרה היא לקבוע את התפקוד המולקולרי של החלבונים של אפקטור ולהבהיר כיצד הם מתקשרים עם המארח. בשנים האחרונות, טכניקות כמו מסך שני שמרים היברידית בקנה מידה גדול immunoprecipitations בשילוב עם ספקטרומטר המסה סייעו בזיהוי של אינטראקציות חלבונים חלבון. למרות שזיהוי של שותף כריכה מארח הוא הצעד הראשון המכריע לקראת הבעת המצאת הפונקציה המולקולרית של חלבון אפקטור חיידקי, לפעמים חלבון מארח נמצא יש פונקציות ביולוגיות מרובות (למשל, actin, clathrin טובולין), או חלבון חיידקי לא יכול פיזית לאגד חלבונים מארחים, לשלול את החוקר של מידע חיוני על מסלול מארח מדויק להיות מניפולציות. הרעלת שמרים שונה מסך בשילוב עם מסך משתיק קול הותאם כדי לזהות מסלולים מארחים המושפעים על ידי חלבונים החיידק אפקטור. מסך רעילות מסתמך על השפעה רעילה של שמרים הנגרמת על ידי חלבון אפקטור מפריעה המסלולים הביולוגיים המארחים, אשר לעתים קרובות מתבטא כפגם גדילה. ביטוי של הספרייה גנומית שמרים משמש כדי לזהות גורמים מארחים לדכא את רעילות של חלבון אפקטור חיידקי, ובכך לזהות חלבונים במסלול כי החלבון מטרות מטרה. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות עבור מסכי רעילות ומדכא. ניתן לבצע טכניקות אלה בכל מעבדה המסוגלת לשכפול מולקולרי וטיפוח של שמרים ומסלול קולי.

לפני מסך מדכא שמרים בפועל ניתן לבצע, חלבון הריבית של אפקטור העניין חייב להיבדק עבור רעילות בשמרים. זה מושגת על ידי ביטוי חלבון העניין של שמרים תחת שליטתה של מקדם גלקטוז-inducible. הצמיחה על גלוקוז (תנאים שאינם מחייבים) יש להשוות תחילה כדי להבטיח רעילות היא במיוחד בשל ביטוי של חלבון הריבית והוא ל...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

חיידקים תאיים מפרישים חלבונים משפיעים לתוך המארח שיכולים לתפעל מסלולים ביולוגיים כדי לקדם הישרדות פתוגן. חשיפת מטרות מארח של משפיעים חיונית להבנת פתוגנים תאיים כמו כלמידיה טרכומטיס. רעלת שמרים ומסכי מדכא יכולים לספק תובנה מרכזית לגבי היעד הביולוגי הטבעי של חלבונים משפיע חיידקי יכול להיות שימושי במיוחד כאשר שותף מחייב אינו ידוע.אנו מדגימים את רעילות השמרים ואת בדיקות מדכא כאן להקרנה עבור חלבונים אפקטים Trachomatis כלמידיה, אבל טכניקה זו שימשה גם לאפיון לגיונלה pneumophila ו Coxiella burnetii אפקטים. התחל על ידי חינוך חמישה מיליליטר של מרק נשירה יחיד עם מושבה אחת של שמרים טרנספורמציה עם חלבון אפקט המכיל פלסמיד. השתמש שמרים טרנספורמציה עם הווקטור לבד כמו שליטה שלילית דגירה inoculum לילה ב 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.למחרת, להוסיף 180 microliters של מים סטריליים A2 עד A6 בארות של צלחת 96 באר. Vortex תרבות הלילה ולהוסיף 180 microliters של שמרים גם A1. ואז באופן סדרתי לדלל את השמרים בארות עם מים. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לזהות חמישה microliters של כל דילול על גלוקוז נשירה יחיד נשירה אחת נשירה צלחות אגר דגירה את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.לאחר הדגירה, חזותית להעריך רעילות על ידי השוואת הצמיחה של שמרים המבטאים את החלבון משפיע גדל על מדיה המכילה גלקטוז לצמיחה של שמרים המבטאים את הווקטור לבד. לחסן 100 מיליליטר של מרק נשירה יחיד עם מיליליטר אחד של מלאי שמרים שהוכן בעבר דגירה זה במשך 16 עד 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 150 סל"ד. ביום שלמחרת, מוסיפים את כל 100 המיליליטרים של תרבות הלילה ל-900 מיליליטר של מרק נשירה יחיד מחומם מראש ומחרידים את הבקבוק במשך ארבע עד חמש שעות ב-30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.לאחר הדגירה, גלולה את התרבות ב 6, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת הכדור ב-250 מיליליטר של מים סטריליים. חזור על הצנטריפוגה והשליך את העל-טבעי.ואז לבזבז את גלולה ב 250 מיליליטר של אצטט ליתיום מילימולר אחד. גלולה את התרבות על ידי צנטריפוגה, להסיר את אצטט ליתיום, ו resuspend גלולה ב 9.6 מיליליטר של 50%PEG 3350. לאחר מכן הוסיפו רייגנטים לשינוי כמתואר בכתב היד והתאיימו את עוצמת הקול ל-15 מיליליטר עם מים סטריליים המהירים בעדינות כדי לערבב.דגירה את התערובת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן מוסיפים 750 מיקרוליטרים של DMSO ו דגירה באמבט מים ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. הוספת DMSO לפני הלם חום היא חיונית כדי להשיג יעילות טרנספורמציה גבוהה.לאחר הדגירה, גלולה את השמרים על ידי צנטריפוגה ב 3, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות. להשליך את supernatant ולשטוף את גלולה עם 10 מיליליטר של מים סטריליים ואז לחזור על הצנטריפוגה כדי גלולה את השמרים. תן את גלולת בשמונה מיליליטר של מים.לקבוע את יעילות הטרנספורמציה על ידי דילול המדגם אחד עד 10 וציפוי 100 microliters של כל דילול על אגר נשירה כפולה. לאחר מכן צלחת 200 microliters של המדגם על צלחות אגר גלקטוז נשירה כפולה דגירה הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 עד 96 שעות או עד מושבות להופיע. לאחר שהופיעו מושבות, תתקן אותן על אגר גלקטוז נשירה כפולה ותדגר אותן לעוד 24 עד 48 שעות.השתמש בחלק מהטלאי כדי לחסן חמישה מיליליטר של מרק נשירה כפולה ולהדקר את inoculum לילה ב 26 מעלות צלזיוס עם רועד ב 150 סל"ד. למחרת, להוסיף 180 microliters של מים סטריליים לחמש בארות של צלחת 96 באר החל A2 היטב. וורטקס תערובת תרבות הלילה. מוסיפים 180 מיקרוליטרים של שמרים כדי גם A1 ולדלל אותו באופן סדרתי באמצעות המים בארות A2 עד A6. ספוט חמישה microliters של כל דילול על גלוקוז נשירה אחת וצלחות אגר גלקטוז נשירה אחת הקפדה לכלול את המחולל הרעיל לבד כפקד.הדגירה את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ואז להשוות את הצמיחה של השמרים עם אפקט רעיל לבד לצמיחה של שמרים עם מדכא פוטנציאלי. כדי לאשר מדכאים שהפגינו רעילות מופחתת בהשוואה למחולל הרעיל בלבד, לבודד את הפלסמיד על פי הוראות כתב היד ולהפוך אותו מחדש לשמרים הרעילים. לחסן מרק גלוקוז נשירה כפול עם מושבה מצלחת השינוי.להדגיר אותו לילה ולמקום על גלוקוז נשירה כפולה אגר גלקטוז כדי לאשר דיכוי של רעילות. לפני ביצוע מסך מדכא השמרים, חלבונים משפיעים של עניין נבדקו רעילות שמרים. חלבון העניין בא לידי ביטוי בשמרים תחת שליטתו של מקדם גלקטוז בלתי ניתן לאכילה והצמיחה בגלקטוז הושוותה לצמיחה על גלוקוז.כאשר CT229 נבדק רעילות, מושבות קטנות יותר ודיכוי צמיחה נצפו. באופן אידיאלי, יש לראות ירידה של שניים עד שלושה יומנים כדי להמשיך עם מסכי מדכא שמרים. מסך המדכא נערך על ידי הפיכת הזן הרעיל עם הספרייה הגנומית שמרים pYAP 13 וציפוי הטרנספורמנטים על אגר גלקטוז.שיבוטי המדכא שהושגו נצפו על אגר גלקטוז נשירה כפול כדי לאשר דיכוי של רעילות. מדכאי pSup1 ו- pSup2 דיכאו את הרעילות של חלבון האפקטים ואילו pSup3 לא. הליכים אלה דורשים תשומת לב זהירה לפרטים בנוסף לעבודות הכנה קריטיות כולל כמויות גדולות של מדיה וצלחות מוכנות לפני ביצוע הניסוי.לאחר זיהוי מדכאים, ניסויים יכולים להתבצע כדי לאמת אינטראקציות עם המחולל של עניין כולל משיכת כלפי מטה, קולוקליזציה immunofluorescence, נוקאאוט אפקט או הפלה של גורמים מארחים שזוהו במסכים. פיתוח טכניקה זו עבור משפיעי כלמידיה אפשרה אפיון ראשוני מזורז של חלבונים משפיעים ועזרה למקד את מאמצינו בהבהרת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים המתווים אינטראקציות פתוגן מארחות.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

קרינה מזורז Biodosimetry אוטומטית על ידי כרומוזום Dicentric זיהוי (ADCI) והשערוך מינון

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...