Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Ringraziamo Shelby Andersen, Abby McCullough e Laurel Woods per la loro assistenza con queste tecniche. Questo studio è stato finanziato dai fondi delle startup del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università dell'Iowa a Mary M. Weber.

1. Preparazione di supporti e reagenti
NOTA: Le piastre devono essere preparate prima del giorno del saggio e sono buone per 1 mese. I supporti e i reagenti possono essere realizzati in qualsiasi momento e sono buoni per 1 mese.
<ol><li>Preparare 1 L della soluzione per il glucosio (10% w/v) sciogliendo 100 g di glucosio D-() in 800 mL di acqua distillata in un becher da 1.000 mL. Regolare il volume a 1 L con acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m in una bottiglia s...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

Questo protocollo delinea le procedure passo-passo per identificare i percorsi biologici dell'ospite mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando una tossicità del lievito modificato e uno schermo soppressore. Il ceppo di lievito utilizzato, S. cerevisiae W303, è auxotrofico sia per uracil che per leucina. L'auxotrotrofia uracildela del ceppo viene utilizzata per selezionare il lievito che trasporta la proteina di interesse sul vettore pYesNTA-Kan, mentre l'auxotrotrotrotrofia leucita viene utiliz...

Il primo rapporto di procedure simili a quelle qui presentate ha caratterizzato l'effetto della legionella pneumophila di tipo IV SidD, una deAMPylase che modifica Rab11. Tecniche comparabili sono state utilizzate per la caratterizzazione di diversi effetti L. pneumophila 1,2,3. Il saggio è stato adattato per caratterizzare una proteina effettore Coxiella burnetii tipoIV 4, e recentemente l'utilità di questa tecnica è stata ampliata per la caratterizzazione delle proteine della membrana di inclusione della Chlamydia trachomatis 5 .
Questo protocollo può essere suddiviso in due parti principali: 1) lo schermo di tossicità del lievito, in cui la proteina dell'effettore batterico di interesse è espressa in lievito e i cloni vengono sottoposti a screening per un fenotipo tossico come evidenziato da un difetto di crescita, e 2) lo schermo soppressore del lievito , in cui il fenotipo tossico viene soppresso dall'espressione di una libreria genomica del lievito nel ceppo tossico. Pertanto, lo schermo di tossicità è uno schermo per i fenotipi tossici che si manifestano come difetti di crescita quando l'effetto batterico di interesse è sovraespresso. I cloni tossici, trasformati con successo ed esprimendo l'effettore batterico, vengono selezionati e salvati per la fase successiva. Il secondo passo importante consiste nell'esprimere sovraesprimenza di una libreria genomica di lievito parzialmente digerito nel clone del lievito tossico. I plasmidi che compongono la libreria genomica del lievito suggerita per l'uso in questo protocollo trasportano inserti da 5,20 kb, di solito corrispondenti a 3-13 telai di lettura aperti di lievito (ORF) di una dimensione media del gene di 1,5 kb su tutti i plasmidi, che rappresentano l'intero genoma del lievito coperto circa 10x. Questa parte del saggio è chiamata lo schermo del soppressore, in quanto l'obiettivo è sopprimere la tossicità della proteina dell'effettore batterico. I potenziali plasmidi soppressori sono isolati dal lievito, sequenziati e gli ORF soppressori identificati. La logica alla base dello schermo soppressore è che la proteina eflatrice si lega, interagisce e/o travolge i componenti del percorso host a cui si rivolge, e che fornire le proteine ospiti in eccesso può salvare l'effetto tossico sul percorso e quindi, il difetto di crescita. Pertanto, gli ORF identificati che sopprimono la tossicità spesso rappresentano più partecipanti di un percorso host. Vengono quindi eseguiti esperimenti ortogonali per verificare che l'effettuatore batterico interagisca effettivamente con il percorso implicato. Ciò è particolarmente necessario se è stato identificato un partner di legame come clathrin o actin, perché queste proteine sono coinvolte in una moltitudine di processi host. Ulteriori esperimenti possono quindi chiarire la funzione fisiologica della proteina dell'effettore durante l'infezione. Gli schermi di tossicità e soppressore sono anche potenti strumenti per decifrare la funzione fisiologica delle proteine degli effetti batterici che non legano fisicamente le proteine ospiti con affinità sufficienti da rilevare per immunoprecipitazioni o che interagiscono con il ospite in interazioni eseguito e con hit-and-run enzimatiche che potrebbero non essere rilevate da uno schermo ibrido yeast-two.
Anche se lo schermo soppressore può essere un metodo potente per rivelare potenziali interazioni fisiologiche tra le proteine degli effetti batterici e le vie dell'ospite, la proteina degli effetti batterici deve indurre un difetto di crescita nel lievito, altrimenti schermo soppressore sarà di scarsa utilità. Inoltre, il fenotipo tossico deve comportare una crescita di almeno 2-3 log10 o sarà difficile identificare i soppressori. Se un laboratorio è impostato per la coltura cellulare, lo screening delle proteine effettori per la tossicità in linee cellulari comuni come HeLa può spesso fornire informazioni sul fatto che valga la pena procedere con lo schermo di tossicità del lievito. L'espressione ectopica della proteina esecutore nelle cellule HeLa a volte si traduce in una tossicità che correla fortemente con la tossicità nel ceppo di lievito utilizzato per questi schermi4. I segni osservabili di stress nelle cellule HeLa includono la perdita di fibre di stress, il distacco cellulare dalla piastra e la condensa nucleare che indica l'apoptosi. Qualsiasi indicazione visiva dello stress nelle cellule HeLa rende la proteina di interesse un buon candidato per indurre un difetto di crescita nel lievito, che si replicano molto più rapidamente e sono quindi più sensibili alla perturbazione delle vie essenziali.
Va notato che lo schermo del soppressore non sempre identifica i partner di associazione dell'ospite come soppressori, ma può ancora implicare componenti critici del percorso o dei percorsi host presi di mira, producendo una visione olistica dei processi biologici dirottati dal proteina degli effetti batterici. In superficie, questo sembra controintuitivo, perché fornire il partner legante della proteina efsiatore in eccesso ci si aspetterebbe per salvare il difetto di crescita. Nel tentativo di identificare i percorsi presi di mira dalla proteina eflacuta c.ocoficida CT229 (CpoS), che si lega ad almeno 10 diversi Rab GTPases durante l'infezione5, nessuno dei partner di legame Rab ha soppresso la tossicità del CT229. Tuttavia, sono stati identificati numerosi soppressori coinvolti nel traffico di vescicle rivestite di clatrari (CCV), il che ha portato a ulteriori lavori di dimostrando che il CT229 sovverte specificamente il traffico di CCV dipendente da Rab. Allo stesso modo, quando si studia la proteina effettore C. burnetii Cbu0041 (CirA) sono stati identificati diversi Rho GTPases che hanno salvato il difetto di crescita del lievito, e in seguito si è scoperto che CirA funziona come una PROTEINa attivando GTPase (GAP) per RhoA4.
L'utilità dello schermo del soppressore del lievito per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli effetti batterici non può essere sopravvalutata, e altri ricercatori che tentano di caratterizzare le proteine degli effetti batterici intracellulari possono trarne grande beneficio queste tecniche. Questi saggi hanno un valore se le immunoprecipitazioni e/o gli schermi ibridi di lievito-due non sono riusciti a trovare un partner vincolante e possono chiarire quali vie sono prese di mira dalla proteina degli effetti batterici. Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la tossicità e gli schermi soppressori per identificare i percorsi biologici dell'ospite presi di mira dalle proteine degli effetti batterici intracellulari, nonché alcuni degli ostacoli comuni incontrati quando si utilizzano questi saggi e i loro soluzioni corrispondenti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

I batteri intracellulari secernono fattori di virulenza chiamati proteine eftraenti nel citosol ospite che agiscono per sovvertire le proteine ospiti e/o i loro percorsi biologici associati a beneficio del batterio. L'identificazione delle proteine degli effetti batterici putativi è diventata più gestibile grazie ai progressi nel sequenziamento del genoma batterico e all'avvento di algoritmi che consentono l'identificazione in silico dei geni che codificano i candidati alla secrezione e/o quelli eucarioti Domini. Tuttavia, l'identificazione di questi importanti fattori di virulenza è solo un primo passo. Naturalmente, l'obiettivo è quello di determinare la funzione molecolare delle proteine efmarcatori e chiarire come interagiscono con l'ospite. Negli ultimi anni, tecniche come lo schermo bi-ibrido del lievito e le immunoprecipitazioni su larga scala accoppiate con la spettrometria di massa hanno aiutato nell'identificazione delle interazioni proteina-proteina. Sebbene l'identificazione di un partner di legame ospite sia il primo passo fondamentale per chiarire la funzione molecolare di una proteina efmarcatore batterica, a volte la proteina ospite si trova ad avere molteplici funzioni biologiche (ad esempio, actina, clathrin, tubulina), o la proteina batterica non può legare fisicamente le proteine ospiti, privando il ricercatore di informazioni cruciali sulla precisa via ospite manipolata. È stato adattato uno screening di tossicità del lievito modificato abbinato a uno schermo soppressore per identificare le vie dell'ospite influenzate dalle proteine degli effetti batterici. Lo schermo di tossicità si basa su un effetto tossico nel lievito causato dalla proteina efcontadina che interferisce con i percorsi biologici ospiti, che spesso si manifesta come un difetto di crescita. L'espressione di una libreria genomica del lievito viene utilizzata per identificare i fattori ospiti che sopprimono la tossicità della proteina degli effetti batterici e quindi identificano le proteine nel percorso che la proteina esecutore prende di mira. Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sia per le schermate di tossicità che per le schermate di soppressore. Queste tecniche possono essere eseguite in qualsiasi laboratorio in grado di clonazione molecolare e coltivazione di lievito ed Escherichia coli.

Prima di poter eseguire lo schermo del soppressore effettivo del lievito, la proteina dell'effettore di interesse deve essere testata per la tossicità nel lievito. Ciò si ottiene esprimendo la proteina di interesse per il lievito sotto il controllo di un promotore inducibile di galactose. La crescita del glucosio (condizioni non induttive) dovrebbe prima essere confrontata per garantire che la tossicità sia specificamente dovuta all'espressione della proteina di interesse e non sia un difetto generale. Come mostrato n...

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Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

I patogeni batterici secernono proteine nell'ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.

Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

I batteri intracellulari secernono proteine dell'effettore nell'ospite che possono manipolare le vie biologiche per promuovere la sopravvivenza degli agenti patogeni. Rivelare i bersagli ospiti degli effettori è essenziale per comprendere agenti patogeni intracellulari come la clamidia trachomatis. Gli schermi di tossicità e soppressore del lievito possono fornire informazioni chiave sul bersaglio biologico naturale delle proteine dell'effettore batterico e possono essere particolarmente utili quando un partner legante è sconosciuto.Dimostriamo qui la tossicità del lievito e i test soppressori per lo screening delle proteine dell'effettore Chlamydia trachomatis, ma questa tecnica è stata utilizzata anche per caratterizzare gli effettori Legionella pneumophila e Coxiella burnetii. Inizia inoculando cinque millilitri di brodo a goccia singola con la singola colonia di lievito trasformata con la proteina dell'effettore contenente plasmide. Utilizzare lievito trasformato con il solo vettore come controllo negativo e incubare l'inoculo durante la notte a 30 gradi Celsius mentre si trema.Il giorno successivo, aggiungere 180 microlitri di acqua sterile ai pozzi da A2 a A6 di una piastra da 96 pozza. Vortice la coltura notturna e aggiungere 180 microlitri di lievito al pozzo A1. Quindi diluire serialmente il lievito nei pozzi con acqua. Utilizzare una pipetta multicanale per individuare cinque microlitri di ogni diluizione su singole piastre di agar di galattosio drop-out e incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore.Dopo l'incubazione, valutare visivamente la tossicità confrontando la crescita del lievito esprimendo la proteina effettore coltivata sul supporto contenente galattosio con la crescita del lievito che esprime il solo vettore. Inoculare 100 millilitri del singolo brodo drop-out con un millilitro del brodo di lievito precedentemente preparato e incubarlo per 16-24 ore a 30 gradi Celsius con scuotimento a 150 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere gli interi 100 millilitri della coltura notturna a 900 millilitri di brodo a goccia singolo preri riscaldato e incubare il pallone per quattro o cinque ore a 30 gradi Celsius mentre si trema.Dopo l'incubazione, pellet la coltura a 6.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 250 millilitri di acqua sterile. Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante.Quindi rimospendare il pellet in 250 millilitri di un acetato di litio millimolare. Pellettare la coltura mediante centrifugazione, rimuovere l'acetato di litio e rimorsi il pellet in 9,6 millilitri del 50%PEG 3350. Quindi aggiungere i reagenti di trasformazione come descritto nel manoscritto e regolare il volume a 15 millilitri con acqua sterile invertendo delicatamente per mescolare.Incubare la miscela a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere 750 microlitri di DMSO e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per altri 30 minuti. L'aggiunta del DMSO prima dello shock termico è fondamentale per ottenere un'elevata efficienza di trasformazione.Dopo l'incubazione, pelletare il lievito centrifugando a 3.000 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet con 10 millilitri di acqua sterile, quindi ripetere la centrifugazione per pellettare il lievito. Resuspend il pellet in otto millilitri d'acqua.Determinare l'efficienza di trasformazione diluendo il campione da uno a 10 e placcando 100 microlitri di ogni diluizione su un doppio agar drop-out. Quindi placcare 200 microlitri del campione su piastre di agar di galattosio a doppia caduta e incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48-96 ore o fino a quando non compaiono colonie. Una volta che le colonie sono apparse, rattopparle su un doppio agar galattosio drop-out e incubarle per altre 24-48 ore.Utilizzare parte del cerotto per inoculare cinque millilitri di brodo doppio drop-out e incubare l'inoculo durante la notte a 26 gradi Celsius con scuotimento a 150 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere 180 microlitri di acqua sterile a cinque pozzi di una piastra da 96 po 'a partire dal pozzo A2. Vortice il mix culturale notturno. Aggiungere 180 microlitri di lievito al pozzo A1 e diluirlo serialmente utilizzando l'acqua nei pozzi da A2 a A6. Individuare cinque microlitri di ogni diluizione su singoli glucosio drop-out e singole piastre di agar di galattosio drop-out assicurandosi di includere il solo effettore tossico come controllo.Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore, quindi confrontare la crescita del lievito con il solo effettore tossico con la crescita del lievito con il potenziale soppressore. Per confermare i soppressori che hanno dimostrato una tossicità ridotta rispetto al solo effettore tossico, isolare il plasmide secondo le indicazioni manoscritte e ritras trasformarlo nel lievito tossico. Inoculare il doppio brodo di glucosio con una colonia dalla piastra di trasformazione.Incubarlo durante la notte e individuare il doppio agar di glucosio e galattosio per confermare la soppressione della tossicità. Prima di eseguire lo schermo del soppressore del lievito, le proteine dell'effettore di interesse sono state testate per la tossicità nel lievito. La proteina di interesse è stata espressa nel lievito sotto il controllo di un promotore inducibile di galattosio e la crescita sul galattosio è stata confrontata con la crescita del glucosio.Quando il CT229 è stato testato per la tossicità, sono state osservate colonie più piccole e soppressione della crescita. Idealmente, si dovrebbe osservare una diminuzione da due a tre tronchi per procedere con gli schermi soppressori di lievito. Lo schermo del soppressore è stato condotto trasformando il ceppo tossico con la libreria genomica del lievito pYAP 13 e placcando i trasformatori sull'agar di galattosio.I cloni soppressori ottenuti sono stati avvistati su un doppio agar di galattosio drop-out per confermare la soppressione della tossicità. I soppressori pSup1 e pSup2 sopprimevano la tossicità della proteina effettore, mentre pSup3 no. Queste procedure richiedono un'attenta attenzione ai dettagli oltre al lavoro preparatorio critico, incluso avere grandi quantità di supporti e piastre pronti prima di eseguire l'esperimento.Una volta identificati i soppressori, possono essere eseguiti esperimenti per verificare le interazioni con l'effettore di interesse, tra cui abbattimenti, colocalizzazione dell'immunofluorescenza, knockout dell'effettore o eliminazione dei fattori ospiti identificati negli schermi. Lo sviluppo di questa tecnica per gli effettori clamidia ha permesso una rapida caratterizzazione preliminare delle proteine dell'effettore e ha contribuito a concentrare i nostri sforzi sulla chiarire i meccanismi molecolari sottostanti che mediano le interazioni patogene ospiti.

Research

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Genetics

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Genetica

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