Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
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シェルビー・アンダーセン、アビー・マッカロー、ローレル・ウッズの支援に感謝します。この研究は、アイオワ大学微生物学・免疫学科からメアリー・M・ウェーバーに資金を提供しました。

1. 媒体および試薬の調製
注:プレートは、アッセイの日の前に準備する必要があり、1ヶ月間良いです。媒体および試薬はいつでも作ることができ、1ヶ月間良いです。
<ol><li>1,000mLビーカーに800mLの蒸留水にD-(+)-グルコース100gを溶解して、グルコース溶液の1L(10%w/v)を調製する。蒸留水で体積を1Lに調整します。0.2μmの滅菌フィルターを通して滅菌1 Lメディア貯蔵ボトルに?...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

このプロトコルは、修飾酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いて細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主生物学的経路を同定するためのステップバイステップの手順を概説する。使用される酵母株としては、S.セレビシエW303が、ウラシルおよびロイシンの両方に対する栄養補助である。株のウラシル栄養萎縮は、pYesNTA-Kanベクター上で目的のタンパク質を運ぶ酵母を選?...

ここで提示されたものと同様の手順の最初のレポートは、レジオネラ肺炎球菌型IVエフェクターSidD、Rab11を変質するdeAMPylasを特徴としました。同等の技術は、いくつかのL.肺炎球菌エフェクター1、2、3の特性評価に使用された。アッセイは、コキシエラ・ブルネチーIVエフェクタータンパク質4を特徴付けるために適応され、最近、クラミジア・トラコマティス含有膜タンパク質の特性評価のためにこの技術の有用性が拡張された5.
このプロトコルは、2つの主要な部分に分けることができる:1)目的の細菌エフェクタータンパク質が酵母およびクローンで発現され、成長欠陥によって示される有毒な表現型についてスクリーニングされ、2)酵母サプレッサースクリーン、有毒株中の酵母ゲノムライブラリーの発現により毒性表現型が抑制されるものである。したがって、毒性スクリーンは、目的の細菌エフェクターが過剰発現されたときに増殖欠陥として現れる毒性表現型の画面である。細菌エフェクターで正常に変換され、発現する有毒クローンが選択され、次のステップのために保存されます。第2の主要なステップは、有毒酵母クローン内の部分的に消化された酵母ゲノムライブラリーを過剰発現することを含む。このプロトコルで使用するために提案された酵母ゲノムライブラリを構成するプラスミドは5−20 kbのインサートを運び、通常はすべてのプラスミドにわたって〜1.5kbの平均遺伝子サイズの3−13酵母オープンリーディングフレーム(ORF)に対応し、全酵母ゲノムカバーを表す約10倍。アッセイのこの部分は、細菌エフェクタータンパク質の毒性を抑制することを目的とするように、サプレッサースクリーンと呼ばれる。潜在的なサプレッサープラスミドは、酵母から単離され、配列化され、および同定された抑制ORFである。サプレッサースクリーンの根底にある根拠は、エフェクタータンパク質が標的とする宿主経路の成分に結合し、相互作用し、および/または圧倒される成分を、それらの宿主タンパク質を過剰に戻すことができ、経路に対する毒性効果を救うことができるということです。成長欠陥。したがって、毒性を抑制するORFを同定すると、多くの場合、宿主経路の複数の参加者を表す。次に、直交実験を行い、細菌エフェクターが実際に関連経路と相互作用することを検証します。これは、これらのタンパク質が多数の宿主プロセスに関与しているため、クラトリンやアクチンなどの結合パートナーが同定された場合に特に必要です。さらなる実験は、感染中にエフェクタータンパク質の生理機能を解明することができる。毒性およびサプレッサースクリーンはまた、免疫沈降によって検出するのに十分な親和性を有する宿主タンパク質を物理的に結合しない細菌エフェクタータンパク質の生理機能を解読するための強力なツールであり、酵母2ハイブリッドスクリーンでは検出されない可能性のある酵素的ヒットアンドラン相互作用のホスト。
サプレッサースクリーンは、細菌エフェクタータンパク質と宿主経路との間の潜在的な生理学的相互作用を明らかにする強力な方法であり得るが、細菌エフェクタータンパク質は酵母の増殖欠陥を誘導しなければならない。サプレッサー画面はほとんど役に立ちません。さらに、有毒な表現型は、少なくとも2−3ログ10の成長の欠損をもたらすか、またはサプレッサーを同定することが困難であろう。細胞培養のために実験室が設置されている場合、HeLaなどの一般的な細胞株における毒性のスクリーニングエフェクタータンパク質は、酵母毒性スクリーンを進める努力に値するかどうかについての洞察を与えることができる。HeLa細胞におけるエフェクタータンパク質の湿疹発現は、これらのスクリーン4に用いられる酵母株における毒性と非常に強く相関する毒性をもたらす場合がある。HeLa細胞におけるストレスの観察可能な特徴は、ストレス繊維の喪失、プレートからの細胞剥離、およびアポトーシスを示す核縮合を含む。HeLa細胞におけるストレスの視覚的な徴候は、酵母の増殖欠陥を誘導するための良い候補となるタンパク質を作り、これははるかに迅速に複製し、したがって、本質的な経路の摂動に対してより応答性が高くなります。
サプレッサー画面は、必ずしもホスト・バインディング・パートナーをサプレッサーとして識別するとは限りませんが、ターゲットとするホスト経路の重要なコンポーネントに影響を与える可能性があり、それによってハイジャックされる生物学的プロセスの全体像が得られます。細菌エフェクタータンパク質。表面上、エフェクタータンパク質の結合パートナーを過剰に提供することは、成長欠陥を救出することが期待されるため、これは直感的ではないようです。感染5時に少なくとも10種類のRab GTPアーゼに結合するC.トラコマティスエフェクタープロテインCT229(CpoS)の標的となる経路を同定する取り組みにおいて、Rab結合パートナーのいずれもCT229の毒性を抑制しなかった。しかし、クラトリン被覆小胞(CCV)の密売に関与する多数のサプレッサーが同定され、CT229がRab依存型CCVの密売を特異的に転覆していることを示すさらなる作業につながった。同様に、酵母増殖欠陥を救出したC.ブルネティエフェクタープロテインCbu0041(CirA)を調べたところ、その後、RhoA4に対するGTPアーゼ活性化タンパク質(GAP)としてCirAが機能することが判明した。
細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を解明するための酵母サプレッサースクリーンの有用性はいくら強調してもしすぎることはできず、細胞内細菌エフェクタータンパク質を特徴付けようとする他の研究者は、大きな利益を得ることができます。これらの技術。これらのアッセイは、免疫沈降および/または酵母2つのハイブリッドスクリーンが結合パートナーを見つけることができず、どの経路が細菌エフェクタータンパク質によって標的にされているかを解明できる場合に価値があります。ここでは、細胞内細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主生物学的経路を同定するための毒性およびサプレッサースクリーンの詳細なプロトコルと、これらのアッセイを使用する際に経験した一般的な障害のいくつかおよび対応するソリューション。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

細胞内細菌は、細菌の利益のために宿主タンパク質および/または関連する生物学的経路を覆すために作用する宿主サイトゾルにエフェクタータンパク質と呼ばれる毒性因子を分泌する。細菌ゲノムシーケンシングの進歩や、分泌候補および/または真核様をコードする遺伝子のシリコ同定を可能にするアルゴリズムの出現により、細菌エフェクタータンパク質の同定がより管理しやすくなったドメイン。しかし、これらの重要な毒性因子の同定は、最初のステップに過ぎません。当然のことながら、目的はエフェクタータンパク質の分子機能を決定し、それらが宿主とどのように相互作用するかを解明することです。近年、酵母2ハイブリッドスクリーンや大規模免疫沈降と質量分析を組み合わせた技術が、タンパク質間相互作用の同定に役立っています。宿主結合パートナーの同定は、細菌エフェクタータンパク質の分子機能を解明するための重要な第一歩であるが、宿主タンパク質が複数の生物学的機能(例えば、アクチン、クラトリン、チューブリン)を有することが判明することがある。細菌タンパク質は、ホストタンパク質を物理的に結合させないかもしれないし、操作されている正確な宿主経路に関する重要な情報を研究者から奪う。サプレッサースクリーンと組み合わせた修飾酵母毒性スクリーンは、細菌エフェクタータンパク質の影響を受ける宿主経路を同定するように適合されている。毒性スクリーンは、多くの場合、増殖欠陥として現れる宿主生物学的経路を妨害するエフェクタータンパク質によって引き起こされる酵母の毒性効果に依存する。酵母ゲノムライブラリーの発現は、細菌エフェクタータンパク質の毒性を抑制し、エフェクタータンパク質が標的とする経路内のタンパク質を同定する宿主因子を同定するために使用される。このプロトコルには、毒性画面とサプレッサー画面の両方の詳細な指示が含まれています。これらの技術は、酵母および大腸菌の分子クローニングおよび培養が可能な任意の実験室で行うことができる。

実際の酵母サプレッサースクリーンを実行する前に、目的のエフェクタータンパク質が酵母の毒性をテストする必要があります。これは、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下で酵母に目的とするタンパク質を発現させることによって達成される。グルコースの成長(非誘導条件)は、まず、目的のタンパク質の発現に起因する毒性が特異的であり、一般的な欠陥ではないことを保証する?...

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Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

細菌病原体は、重要な生物学的プロセスを標的とする宿主にタンパク質を分泌する。細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を同定することは、分子病因に対処する鍵となる。ここで、毒性細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を解明するために改変酵母サプレッサーおよび毒性スクリーンを用いる方法について説明する。

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

細胞内細菌は、病原体の生存を促進するために生物学的経路を操作することができる宿主にエフェクタータンパク質を分泌する。クラミジア・トラコマティスのような細胞内病原体を理解するためには、エフェクターの宿主標的を明らかにすることが不可欠である。酵母毒性およびサプレッサースクリーンは、細菌エフェクタータンパク質の自然な生物学的標的に関する重要な洞察を提供することができ、結合パートナーが不明な場合に特に有用であり得る。クラミジア・トラコマティス・エフェクタータンパク質のスクリーニング用の酵母毒性およびサプレッサーアッセイをここで実証していますが、レジオネラ・ニューモフィラやコクシエラ・ブレネチエフェクターの特性化にも使用されています。プラスミドを含むエフェクタータンパク質で形質転換した酵母の単一コロニーで5ミリリットルの単一ドロップアウトスープを接種することから始めます。ベクター単独で形質転換した酵母を陰性対照として使用し、振りながら摂氏30度で一晩接種をインキュベートする。翌日、96ウェルプレートのA6ウェルを通してA2に180マイクロリットルの無菌水を加えます。一晩培養をボルテックスし、180マイクロリットルの酵母をA1に加える。その後、水で井戸中の酵母を連続して希釈します。マルチチャンネルピペットを使用して、各希釈液の5マイクロリットルをシングルドロップアウトグルコースとシングルドロップアウトガラクトース寒天プレートにスポットし、プレートを摂氏30度で48時間インキュベートします。インキュベーション後、ガラクトース含有培地上で増殖したエフェクタータンパク質を発現する酵母の増殖を、ベクター単独で発現する酵母の増殖と比較して、毒性を目視で評価する。100ミリリットルの単一の脱落したスープを、以前に調製した酵母ストックの1ミリリットルで接種し、150 RPMで振ると摂氏30度で16〜24時間インキュベートします。翌日、一晩培養した100ミリリットル全体を900ミリリットルの温めた単一ドロップアウトスープに加え、揺れながら30°Cで4~5時間フラスコをインキュベートします。インキュベーション後、6,000倍gで4度で10分間培養をペレット化する。上清を捨て、250ミリリットルの滅菌水でペレットを再懸濁します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。その後、酢酸リチウム1ミリモルの250ミリリットルでペレットを再懸濁する。ペレットは遠心分離により培養し、酢酸リチウムを除去し、ペレットを50%PEG3350の9.6ミリリットルで再懸濁した。次に、原稿に記載されている形質転換試薬を加え、滅菌水を穏やかに反転して15ミリリットルに調整して混合します。30°Cで30分間インキュベートします。その後、750マイクロリットルのDMSOを加え、さらに30分間摂氏42度の水浴でインキュベートします。高い変換効率を達成するには、ヒートショックの前にDMSOを追加することが重要です。インキュベーション後、5分間3,000回gで遠心分離機で酵母をペレット化する。上清を捨て、10ミリリットルの滅菌水でペレットを洗い、遠心分離を繰り返して酵母をペレット化します。ペレットを8ミリリットルの水に再び懸濁します。サンプル1~10を希釈し、各希釈液の100マイクロリットルを二重脱落寒天にめっきすることにより、変換効率を決定します。その後、サンプル200マイクロリットルを二重脱落ガラクトース寒天プレートにプレートし、48〜96時間、またはコロニーが現れるまで摂氏30度でプレートをインキュベートする。コロニーが出現したら、二重中退ガラクトース寒天にパッチを当て、さらに24〜48時間インキュベートします。パッチの一部を使用して、5ミリリットルの二重脱落スープを接種し、150 RPMで振って摂氏26度で一晩接種をインキュベートします。翌日、180マイクロリットルの無菌水を、A2から始まる96ウェルプレートの5つの井戸に加えます。一晩の培養ミックスを渦。180マイクロリットルの酵母をA1に加え、A2からA6までの井戸の水を使用して連続して希釈します。単一のドロップアウトグルコースとシングルドロップアウトガラクトース寒天プレートに各希釈液の5マイクロリットルを見つけ、毒性エフェクターを単独でコントロールとして含めます。プレートを摂氏30度で48時間インキュベートし、有毒エフェクターだけで酵母の成長を潜在的なサプレッサーを有する酵母の成長と比較する。毒性エフェクター単独と比較して減少した毒性を示したサプレッサーを確認するには、原稿の指示に従ってプラスミドを分離し、有毒酵母に再変換する。二重脱落したグルコーススープを、変質プレートからコロニーで接種する。一晩インキュベートし、二重中退グルコースとガラクトース寒天にスポットを当て、毒性の抑制を確認します。酵母サプレッサースクリーンを実施する前に、目的のエフェクタータンパク質が酵母における毒性について試験された。目的のタンパク質をガラクトース誘導促進剤の制御下で酵母で発現させ、ガラクトース上での増殖をグルコース上での増殖と比較した。CT229が毒性について試験された場合、より小さいコロニーおよび増殖抑制が観察された。理想的には、酵母サプレッサースクリーンを進めるために2〜3ログ減少を観察する必要があります。サプレッサースクリーンは、酵母ゲノムライブラリーpYAP13で有毒株を変容させ、ガラクトース寒天に変質剤をめっきすることにより行った。得られたサプレッサークローンを、毒性の抑制を確認するために二重脱落ガラクトース寒天で発見した。サプレッサーpSup1およびpSup2はエフェクタータンパク質の毒性を抑制したのに対し、pSup3は抑制しなかった。これらの手順では、実験を行う前に大量のメディアやプレートを準備するなど、重要な準備作業に加えて、細部まで細心の注意を払う必要があります。サプレッサーが特定されると、プルダウン、免疫蛍光共局在、エフェクターノックアウト、またはスクリーンで特定されたホスト因子のノックダウンを含む目的のエフェクターとの相互作用を検証する実験を行うことができます。クラミジアエフェクターのためのこの技術の開発は、エフェクタータンパク質の迅速な予備的な特徴付けを可能にし、宿主病原体相互作用を媒介する基礎的な分子メカニズムの解明に焦点を当てるのに役立ちました。

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

迅速な放射線 Biodosimetry を自動化された減数分裂の染色体の識別 (ADCI) と線量評価

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

バッチ酵母 2 ハイブリッド スクリーンからシーケンス データの情報解析

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...