Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Мы благодарим Шелби Андерсен, Эбби Маккалоу и Лорел Вудс за помощь в этих методах. Это исследование было профинансировано за счет стартап-фондов от Университета Айовы Департамента микробиологии и иммунологии мэри М. Вебер.

1. Подготовка носителей и реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны быть подготовлены до дня проведения ассеа и хороши в течение 1 месяца. Медиа и реагенты могут быть сделаны в любой момент и хороши в течение 1 месяца.
<ol><li>Приготовьте 1 л раствора глюкозы (10% ж/в), растворив 100 г D-(я)-...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

В этом протоколе излагаются пошаговые процедуры для определения биологических путей пребывания, нацеленных на бактериальные эффекторные белки с использованием модифицированной токсичности дрожжей и экрана супрессоров. Дрожжи штамм используется, S. cerevisiae W303, auxotrophic для обоих uracil ...

Первый доклад процедур, аналогичных тем, которые представлены здесь характеризуется Legionella пневмофилы типа IV эффектор СидД, deAMPylase, который изменяет Rab11. Сопоставимые методы были использованы для характеристики нескольких L. пневмофила эффекторов1,2,3. Анализ был адаптирован для характеристики Coxiella burnetii типа IV эффектор белка4, и в последнее время полезность этой техники была расширена для характеристики Chlamydia trachomatis включения мембранных белков5 .
Этот протокол может быть разбит на две основные части: 1) экран токсичности дрожжей, в котором бактериальный белок, представляющий интерес, выражается в дрожжах, а клоны проверяются на токсичный фенотип, о чем свидетельствует дефект роста, и 2) экран супрессора дрожжей , в котором токсичный фенотип подавляется выражением дрожжевой геномной библиотеки в токсичном штамме. Таким образом, экран токсичности является экраном для токсичных фенотипов, которые проявляются как дефекты роста, когда бактериальный эффект интереса является переэкспрессива. Токсичные клоны, успешно трансформированные с помощью бактериального эффектора и выражающие бактериальный эффектор, отбираются и сохраняются для следующего шага. Второй важный шаг включает в себя переэкспрессирование частично переваренных дрожжей геномной библиотеки в токсичных клон дрожжей. Плазмиды, составляющие дрожжевой геномной библиотеки, предложенные для использования в этом протоколе нести 5'20 кб вставки, как правило, соответствующие 3'13 дрожжей открытых кадров чтения (ORF) среднего размера гена 1,5 кб во всех плазмидах, представляющих весь геном дрожжей покрыты примерно в 10 раз. Эта часть ассея называется экраном супрессора, так как цель состоит в том, чтобы подавить токсичность белка бактериального эффектора. Потенциальные супрессорные плазмиды изолированы от дрожжей, секвенируются, и подавления ORFs определены. Обоснование, лежащее в основе экрана супрессора, состоит в том, что протеин-эффектор связывается, взаимодействует с и/или переполняет компоненты пути пребывания, на которые он нацелен, и что предоставление этих белков-хозяев в избытке может спасти токсическое воздействие на пути и, таким образом, дефект роста. Таким образом, выявленные ORF, подавляющие токсичность, часто представляют несколько участников пути хоста. Ортогоналальные эксперименты затем выполняются для проверки того, что бактериальный эффектор действительно взаимодействует с вовлеченным пути. Это особенно необходимо, если связывающий партнер, такой как клатрин или актин, был выявлен, потому что эти белки участвуют во множестве принимающих процессов. Дальнейшие эксперименты могут затем выяснить физиологическую функцию белка-эффектора во время инфекции. Токсичность и супрессор экраны также мощные инструменты для расшифровки физиологической функции бактериальных белков, которые физически не связывают белки-хозяева с сродствами, достаточными для обнаружения иммунопрецицией или которые взаимодействуют с хост в ферментативных хит-и-запустить взаимодействия, которые не могут быть обнаружены дрожжи-два гибридного экрана.
Хотя экран супрессора может быть мощным методом, чтобы выявить потенциальные физиологические взаимодействия между бактериальными белками-эффекторами и путями хозяина, бактериальный белок должен вызвать дефект роста в дрожжах, в противном случае используя его в экран супрессора будет мало пользы. Кроме того, токсичный фенотип должен привести, по крайней мере, к дефициту роста в 2х3 журнала10, иначе будет трудно определить супрессоры. Если лаборатория создана для клеточной культуры, скрининг эффектор белков для токсичности в общих клеточных линий, таких как HeLa часто может дать представление о том, стоит ли усилия, чтобы приступить к экрану токсичности дрожжей. Эктопическое выражение белка-эффектора в клетках HeLa иногда приводит к токсичности, которая очень сильно коррелирует с токсичностью в штамме дрожжей, используемом для этих экранов4. Наблюдаемые признаки стресса в клетках HeLa включают потерю стрессовых волокон, отслоение клеток от пластины и ядерный конденсацию, указывающий на апоптоз. Любое визуальное указание стресса в клетках HeLa делает интересующий белок хорошим кандидатом для индуцирования дефекта роста в дрожжах, которые размножаются гораздо быстрее и, таким образом, более чутко реагируют на возмущение основных путей.
Следует отметить, что экран супрессора не всегда определяет партнеров-хоста, связывающих сяпок, как супрессоров, но он все еще может вовлечь критические компоненты пути хоста (ы) целевых, что дает целостное представление о биологических процессах, захваченных бактериальный эффектор белка. На первый взгляд, это кажется нелогичным, потому что предоставление связующего партнера протеина-эффектора в избытке, как ожидается, спасет дефект роста. В усилиях по выявлению путей, направленных на C. trachomatis эффектор белка CT229 (CpoS), который связывается с по крайней мере 10 различных Rab GTPases во время инфекции5, ни один из Раб связывания партнеров подавлены токсичности CT229. Тем не менее, были выявлены многочисленные супрессоры, занимающиеся торговлей везикулами с покрытием clathrin (CCV), что привело к дальнейшей работе, продемонстрировавшей, что CT229 специально подрывает торговлю ХКВ, зависящим от раба. Аналогичным образом, при исследовании C. burnetii эффектор белка Cbu0041 (CirA) несколько Rho GTPases, которые спасли дефект роста дрожжей были выявлены, и позже было установлено, что CirA функции в качестве GTPase активации белка (GAP) для RhoA4.
Полезность экрана супрессора дрожжей для выяснения путей хозяина, мишенью которыми становятся бактериальные эффекторные белки, не может быть переоценена, и другие исследователи, пытающиеся охарактеризовать внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, могут извлечь большую пользу из эти методы. Эти анализы имеют значение, если иммунопрецитарии и / или дрожжей два гибридных экранов не смогли найти связующего партнера и может выяснить, какие пути ориентированы на бактериальный эффектор белка. Здесь предоставляются подробные протоколы для токсичности и супрессоров для определения биологических путей пребывания, нацеленных на внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, а также некоторые из распространенных препятствий, испытываемых при использовании этих анализов и их соответствующих решений.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

Внутриклеточные бактерии выделяют вирулентные факторы, называемые эффекторными белками в цитозол хозяина, которые действуют, чтобы подорвать белки-хозяева и/или связанные с ними биологические пути в пользу бактерии. Идентификация допустимых бактериальных эффекторов белков стала более управляемой благодаря достижениям в секвенировании бактериального генома и появлению алгоритмов, которые позволяют в силико-идентификации генов, кодирующих секрецию кандидатов и/или эукариотических Доменов. Однако выявление этих важных факторов вирулентности является лишь первым шагом. Естественно, цель состоит в том, чтобы определить молекулярную функцию эффекторов белков и выяснить, как они взаимодействуют с хозяином. В последние годы такие методы, как дрожжи двухгибридного экрана и крупномасштабных иммунопрециций в сочетании с масс-спектрометрии помогли в выявлении белково-белковых взаимодействий. Хотя идентификация партнера, связывающего хозяина, является важнейшим первым шагом на пути к выяснению молекулярной функции белка бактериального эффектора, иногда протеин-хозяин имеет несколько биологических функций (например, актин, клатрин, тубулин) или бактериальный белок не может физически связывать белки-хозяева, лишая исследователя важной информации о точном пути пребывания, которым манипулируют. Модифицированный экран токсичности дрожжей в сочетании с экраном супрессора был адаптирован для идентификации путей пребывания, пострадавших от белков бактериальных эффекторов. Экран токсичности опирается на токсическое воздействие на дрожжи, вызванное эффектор белка вмешательства в принимающей биологических путей, который часто проявляется как дефект роста. Выражение дрожжевой геномной библиотеки используется для выявления факторов, которые подавляют токсичность белка бактериального эффектора и таким образом определить белки в пути, что эффектор белка цели. Этот протокол содержит подробные инструкции как для токсичности, так и для экранов супрессора. Эти методы могут быть выполнены в любой лаборатории, способной молекулярного клонирования и выращивания дрожжей и кишечной палочки.

Прежде чем фактический экран супрессора дрожжей может быть выполнена, эффектор белка интерес должны быть проверены на токсичность в дрожжах. Это достигается путем выражения белка интереса к дрожжам под контролем галактоз-индуцируемого промоутера. Рост глюкозы (неиндуцирующие услови?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.

Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Внутриклеточные бактерии выделяет белки эффектора в хозяина, который может манипулировать биологическими путями для содействия выживанию патогенов. Выявление принимающих целей эффекторов имеет важное значение для понимания внутриклеточных патогенов, таких как chlamydia trachomatis. Дрожжи токсичности и супрессор экраны могут обеспечить ключевое понимание в отношении естественной биологической цели бактериальных белков эффектора и может быть особенно полезным, когда связывающий партнер неизвестен.Мы демонстрируем токсичность дрожжей и супрессор анализы здесь для скрининга на хламидиоз trachomatis эффектор белков, но этот метод также был использован для характеристики Legionella пневмофилы и Coxiella burnetii эффекторов. Начните с инокуляции пяти миллилитров одного выпадают бульона с одной колонией дрожжей, преобразованных с эффектором белка, содержащего плазмиду. Используйте дрожжи преобразованы с вектором только в качестве отрицательного контроля и инкубировать инокулум ночь при 30 градусах по Цельсию во время встряхивания.На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в скважины A2 через скважины A6 из 96 скважин. Vortex ночной культуры и добавить 180 микролитров дрожжей хорошо A1. Затем последовательно разбавляют дрожжи в колодцах водой. Используйте многоканарный пипетку, чтобы обнаружить пять микролитров каждого разбавления на одну выпавку глюкозы и одиночные выпавные галактозные агарные пластины и инкубировать пластины при 30 градусах Цельсия в течение 48 часов.После инкубации, визуально оценить токсичность, сравнивая рост дрожжей, выражающих эффектор белка, выращенного на галактозсодержащих средств массовой информации для роста дрожжей, выражающих вектор в одиночку. Прививите 100 миллилитров одного выпавного бульона одним миллилитром ранее приготовленного дрожжевого бульона и инкубировать его в течение 16-24 часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании при 150 об/мин. На следующий день добавьте все 100 миллилитров ночной культуры в 900 миллилитров предварительно разогретого бульона и инкубировать колбу в течение четырех-пяти часов при 30 градусах по Цельсию при встряхивании.После инкубации гранулы культуры в 6000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в 250 миллилитров стерильной воды. Повторите центрифугу и отбросьте супернатант.Затем повторно посовестите гранулы в 250 миллилитров одного миллимолярского литиевого ацетата. Пеллет культуры центрифугации, удалить ацетат лития, и повторно гранулы в 9,6 миллилитров 50%PEG 3350. Затем добавьте реагенты преобразования, описанные в рукописи, и отрегулируйте громкость до 15 миллилитров со стерильной водой, аккуратно переверкуемой для смешивания.Инкубировать смесь при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Затем добавьте 750 микролитров DMSO и инкубировать в водяной бане при 42 градусах по Цельсию еще 30 минут. Добавление DMSO до теплового удара имеет решающее значение для достижения высокой эффективности трансформации.После инкубации, гранулы дрожжей центрифугирование на 3000 раз г в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и промыть гранулы с 10 миллилитров стерильной воды затем повторить центрифугации гранул дрожжей. Переусейте гранулы в восьми миллилитров воды.Определите эффективность преобразования путем разбавления образца от одного до 10 и покрытия 100 микролитров каждого разбавления на двойной выпадают агар. Затем пластины 200 микролитров образца на двойной отсева галактозы агар пластин и инкубировать пластины при 30 градусов по Цельсию в течение 48 до 96 часов или до тех пор, пока колонии появляются. После того, как колонии появились, патч их на двойной отсева галактозы агар и инкубировать их еще на 24 до 48 часов.Используйте часть патча, чтобы привить пять миллилитров двойного выпадают бульона и инкубировать инокулум на ночь при 26 градусах по Цельсию со тряской при 150 об/мин. На следующий день добавьте 180 микролитров стерильной воды в пять колодцев пластины из 96 скважин, начиная с колодца А2. Vortex ночь культуры смеси. Добавьте 180 микролитров дрожжей в скважину А1 и последовательно разбавляйте его водой в колодцах А2 через А6. Пятно пять микролитров каждого разбавления на одной отсева глюкозы и одного отсева галактозы агар пластин убедившись, что включить токсичный эффектор только в качестве контроля.Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 48 часов, а затем сравнить рост дрожжей с токсичным эффектором только для роста дрожжей с потенциальным супрессором. Чтобы подтвердить супрессоры, которые продемонстрировали снижение токсичности по сравнению с токсичным эффектором в одиночку, изолировать плазмид в соответствии с рукописными направлениями и вновь превратить его в токсичные дрожжи. Прививка двойного отсева глюкозного бульона с колонией из трансформационной пластины.Инкубировать его на ночь и пятно на двойной отсева глюкозы и галактозы агар, чтобы подтвердить подавление токсичности. Перед выполнением дрожжевой супрессор экран, эффектор белков, представляющих интерес были протестированы на токсичность в дрожжах. Интерес к белку выражался в дрожжах под контролем неуязвимого промоутера галактозы, а рост галактозы сравнивали с ростом глюкозы.Когда CT229 был протестирован на токсичность, небольшие колонии и подавление роста наблюдались. В идеале, два-три журнала снижение следует наблюдать, чтобы приступить к дрожжевой супрессор экранов. Экран супрессора был проведен путем преобразования токсичного штамма с дрожжевой геномной библиотекой pYAP 13 и покрытием трансформантов на галактозном агаре.Полученные клоны супрессора были замечены на двойном выбросе галактозного агара для подтверждения подавления токсичности. Супрессоры pSup1 и pSup2 подавляли токсичность белка-эффектора, в то время как pSup3 - нет. Эти процедуры требуют тщательного внимания к деталям в дополнение к критическим подготовительным работам, включая наличие большого количества средств массовой информации и пластин, готовых до проведения эксперимента.После того, как супрессоры определены, эксперименты могут быть выполнены для проверки взаимодействия с эффектором интереса, включая тянуть падения, иммунофторесценции колокализации, эффектор нокаутом или нокдаун принимающих факторов, выявленных на экранах. Разработка этого метода для эффекторов хламидиоза позволила ускорить предварительную характеристику белков-эффекторов и помогла сосредоточить наши усилия на выяснении основных молекулярных механизмов, которые являются посредниками взаимодействия патогенов-хозяйцев.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Ускоренной излучения Биодозиметрические, автоматизированной идентификации Dicentric хромосомы (ADCI) и оценки дозы

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Высок объём идентификации наркотиков синергических сочетаний методом дублирования2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Информатики анализ последовательности данных из пакетного дрожжи 2-гибрид экраны

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

При содействии Deep последовательности, спонтанное подавитель экран в деления дрожжевой Делящиеся дрожжи

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Объединенные ГЕНЕТИЧЕСКИе экраны на основе CRISPR в клетках млекопитающих

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...