Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Agradecemos a Shelby Andersen, Abby McCullough y Laurel Woods por su ayuda con estas técnicas. Este estudio fue financiado con fondos de startups del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Iowa a Mary M. Weber.

1. Preparación de medios y reactivos
NOTA: Las planchas deben prepararse antes del día del ensayo y son buenas durante 1 mes. Los medios y reactivos se pueden hacer en cualquier momento y son buenos durante 1 mes.
<ol><li>Preparar 1 L de la solución de glucosa (10% p/v) disolviendo 100 g de D-(+)-glucosa en 800 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 1.000 ml. Ajuste el volumen a 1 L con agua destilada. Filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 m en una botella estéril de...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. 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A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

Este protocolo describe los procedimientos paso a paso para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas utilizando una pantalla de toxicidad y supresor de levadura modificada. La cepa de levadura utilizada, S. cerevisiae W303, es auxotravófica tanto para uracilo como para leucina. La auxotrofia Uracil de la cepa se utiliza para seleccionar levaduras portadoras de la proteína de interés en el vector pYesNTA-Kan, mientras que la auxotrofia de leucina se util...

El primer informe de procedimientos similares a los aquí presentados caracterizó al efector de la Legionella pneumophila tipo IV SidD, una deAMPylase que modifica Rab11. Se utilizaron técnicas comparables para la caracterización de varios efectores L. pneumophila 1,2,3. El ensayo fue adaptado para caracterizar una proteína efectora Coxiella burnetii tipo IV4,y recientemente la utilidad de esta técnica se amplió para la caracterización de las proteínas de membrana de inclusión de Chlamydia trachomatis 5 .
Este protocolo se puede dividir en dos partes principales: 1) la pantalla de toxicidad de la levadura, en la que la proteína del efector bacteriano de interés se expresa en la levadura y los clones se examinan para detectar un fenotipo tóxico como lo demuestra un defecto de crecimiento, y 2) la pantalla supresora de levadura , en el que el fenotipo tóxico se suprime mediante la expresión de una biblioteca genómica de levadura en la cepa tóxica. Por lo tanto, la pantalla de toxicidad es una pantalla para fenotipos tóxicos que se manifiestan como defectos de crecimiento cuando el efector bacteriano de interés está sobreexpresado. Los clones tóxicos, transformados con éxito y la expresión del efector bacteriano, se seleccionan y guardan para el siguiente paso. El segundo paso importante consiste en sobreexpresar una biblioteca genómica de levadura parcialmente digerida en el clon de levadura tóxica. Los plásmidos que componen la biblioteca genómica de levadura sugerida para su uso en este protocolo llevan inserciones de 5 a 20 kb, generalmente correspondientes a 3 x 13 marcos de lectura abierta de levadura (ORF) de un tamaño medio de gen de 1,5 kb en todos los plásmidos, representando todo el genoma de levadura cubierto cubierto aproximadamente 10veces. Esta parte del ensayo se llama la pantalla supresora, ya que el objetivo es suprimir la toxicidad de la proteína efector bacteriana. Los posibles plásmidos supresores están aislados de la levadura, secuenciados y los ORF supresores identificados. La razón que subyace a la pantalla supresora es que la proteína del efector se une, interactúa y/o abruma los componentes de la vía huésped a la que se dirige, y que proporcionar esas proteínas huésped en exceso puede rescatar el efecto tóxico en la vía y, por lo tanto, el defecto de crecimiento. Por lo tanto, los ORF identificados que suprimen la toxicidad a menudo representan a múltiples participantes de una vía huésped. A continuación, se realizan experimentos ortogonales para verificar que el efector bacteriano interactúa de hecho con la vía implicada. Esto es especialmente necesario si se ha identificado un socio de unión como clathrin o actina, ya que estas proteínas están implicadas en una multitud de procesos de huésped. Otros experimentos pueden elucidar la función fisiológica de la proteína efector durante la infección. Las pantallas de toxicidad y supresor son también potentes herramientas para descifrar la función fisiológica de las proteínas efectoras bacterianas que no unen físicamente las proteínas huésped con afinidades suficientes para detectar por inmunoprecipitación o que interactúan con la host en interacciones enzimáticas de hit-and-run que pueden no ser detectados por una pantalla híbrida de levadura dos.
Aunque la pantalla supresora puede ser un método potente para revelar posibles interacciones fisiológicas entre las proteínas efectoras bacterianas y las vías del huésped, la proteína efectora bacteriana debe inducir un defecto de crecimiento en la levadura, de lo contrario usarlo en el pantalla supresor será de poca utilidad. Además, el fenotipo tóxico debe resultar en al menos un déficit de 2 a 3registros 10 en crecimiento o será difícil identificar supresores. Si se configura un laboratorio para el cultivo celular, el cribado de proteínas efectoras para la toxicidad en líneas celulares comunes como HeLa a menudo puede dar una idea de si vale la pena el esfuerzo para proceder con la pantalla de toxicidad de la levadura. La expresión ectópica de la proteína efector en las células de HeLa a veces resulta en toxicidad que se correlaciona muy fuertemente con la toxicidad en la cepa de levadura utilizada para estas pantallas4. Las características notables del estrés en las células de HeLa incluyen la pérdida de fibras de tensión, el desprendimiento celular de la placa y la condensación nuclear que indica apoptosis. Cualquier indicación visual de estrés en las células de HeLa hace que la proteína de interés sea un buen candidato para inducir un defecto de crecimiento en la levadura, que se replica namucho más rápidamente y por lo tanto son más sensibles a la perturbación de las vías esenciales.
Cabe señalar que la pantalla del supresor no siempre identifica a los socios de unión de host como supresores, pero todavía puede implicar componentes críticos de la(s) vía(s) del huésped(s) objetivo(es), lo que produce una visión holística de los procesos biológicos que está secuestrando el proteína efector bacteriana. En la superficie, esto parece contraintuitivo, porque proporcionar el socio de unión de la proteína efector en exceso se espera que rescate el defecto de crecimiento. En los esfuerzos por identificar vías dirigidas por la proteína efector C. trachomatis CT229 (CpoS), que se une a al menos 10 GTPases Rab diferentes durante la infección5, ninguno de los socios de unión de Rab suprimió la toxicidad de CT229. Sin embargo, se identificaron numerosos supresores involucrados en el tráfico de vesículas recubiertas de clathrin ( CCV), lo que llevó a seguir trabajando demostrando que el CT229 subvierte específicamente el tráfico de CCV dependiente de Rab. Del mismo modo, al investigar la proteína efector C. burnetii Cbu0041 (CirA) se identificaron varias Rho GTPases que rescataron el defecto de crecimiento de la levadura, y más tarde se encontró que CirA funciona como una proteína activadora GTPase (GAP) para RhoA4.
La utilidad de la pantalla supresora de levadura para esclarecer las vías del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas no se puede exagerar, y otros investigadores que intentan caracterizar las proteínas efectoras bacterianas intracelulares pueden beneficiarse en gran medida estas técnicas. Estos ensayos son de valor si las inmunoprecipitaciones y/o las pantallas híbridas de levadura dos no han encontrado un compañero de unión y pueden dilucidar qué vías son atacadas por la proteína efectora bacteriana. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la toxicidad y las pantallas supresoras para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas intracelulares, así como algunos de los obstáculos comunes experimentados al usar estos ensayos y sus soluciones correspondientes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

Las bacterias intracelulares secretan factores de virulencia llamados proteínas efectoras en el citosol huésped que actúan para subvertir las proteínas huésped y/o sus vías biológicas asociadas en beneficio de la bacteria. La identificación de proteínas efectoras bacterianas putativas se ha vuelto más manejable debido a los avances en la secuenciación del genoma bacteriano y la llegada de algoritmos que permiten en silico la identificación de genes que codifican candidatos a la secreción y/o eucariotas Dominios. Sin embargo, la identificación de estos importantes factores de virulencia es sólo un paso inicial. Naturalmente, el objetivo es determinar la función molecular de las proteínas efectoras y dilucidar cómo interactúan con el huésped. En los últimos años, técnicas como la pantalla dos híbridas de levadura y las inmunoprecipitaciones a gran escala, junto con la espectrometría de masas, han ayudado a identificar interacciones proteína-proteína. Aunque la identificación de un socio de unión huésped es el primer paso crucial para dilucidar la función molecular de una proteína efector bacteriana, a veces se encuentra que la proteína huésped tiene múltiples funciones biológicas (por ejemplo, actina, clathrin, tubulina), o la proteína bacteriana puede no unir físicamente las proteínas huésped, privando al investigador de información crucial sobre la vía exacta del huésped que se está manipulando. Se ha adaptado una pantalla de toxicidad por levadura modificada junto con una pantalla supresora para identificar las vías del huésped afectadas por las proteínas efectoras bacterianas. La pantalla de toxicidad se basa en un efecto tóxico en la levadura causado por la proteína efectora que interfiere con las vías biológicas del huésped, que a menudo se manifiesta como un defecto de crecimiento. La expresión de una biblioteca genómica de levadura se utiliza para identificar factores de huésped que suprimen la toxicidad de la proteína efectora bacteriana y así identificar proteínas en la vía a la que se dirige la proteína efector. Este protocolo contiene instrucciones detalladas tanto para las pantallas de toxicidad como para las pantallas supresoras. Estas técnicas se pueden realizar en cualquier laboratorio capaz de clonación molecular y cultivo de levadura y Escherichia coli.

Antes de que se pueda realizar la pantalla supresora de levadura real, la proteína efector de interés debe ser probada para la toxicidad en la levadura. Esto se logra expresando la proteína de interés en la levadura bajo el control de un promotor inducible de galactosa. El crecimiento de la glucosa (condiciones no inductivas) debe compararse primero para garantizar que la toxicidad se deba específicamente a la expresión de la proteína de interés y no sea un defecto general. Como se muestra en <strong class="xfig"...

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Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.

Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Las bacterias intracelulares secretan proteínas efectoras en el huésped que pueden manipular vías biológicas para promover la supervivencia de patógenos. Revelar los objetivos anfitriones de los efectores es esencial para entender patógenos intracelulares como Chlamydia trachomatis. La toxicidad de la levadura y las pantallas supresoras pueden proporcionar información clave sobre el objetivo biológico natural de las proteínas de efector bacteriano y pueden ser particularmente útiles cuando se desconoce un compañero de unión.Aquí demostramos la toxicidad de la levadura y los ensayos supresores para el cribado de proteínas efectora Chlamydia trachomatis, pero esta técnica también se ha utilizado para caracterizar los efectos efectores de Legionella pneumophila y Coxiella burnetii. Comience por inocular cinco mililitros de caldo de abandono único con la única colonia de levadura transformada con la proteína efectora que contiene plásmido. Utilice la levadura transformada con el vector solo como control negativo e incubar el inóculo durante la noche a 30 grados centígrados mientras agita.Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril al A2 a través de pozos A6 de una placa de 96 pozos. Vórtice el cultivo nocturno y añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1. A continuación, diluir en serie la levadura en los pozos con agua. Utilice una pipeta multicanal para detectar cinco microlitros de cada dilución en una sola glucosa desinstado y placas de agar de gata desinstado única e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas.Después de la incubación, evaluar visualmente la toxicidad comparando el crecimiento de la levadura expresando la proteína efectora cultivada en los medios que contienen gactosa con el crecimiento de levadura expresando el vector solo. Inocular 100 mililitros del caldo de abandono único con un mililitro del caldo de levadura previamente preparado e incubarlo durante 16 a 24 horas a 30 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue los 100 mililitros enteros del cultivo nocturno a 900 mililitros de caldo de abandono único precalentó e incubar el matraz durante cuatro a cinco horas a 30 grados centígrados mientras agita.Después de la incubación, pele el cultivo a 6.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 250 mililitros de agua estéril. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.Luego resuspender el pellet en 250 mililitros de un acetato de litio mililolar. Pele el cultivo por centrifugación, retire el acetato de litio y resusppend el pellet en 9,6 mililitros de 50%PEG 3350. A continuación, agregue reactivos de transformación como se describe en el manuscrito y ajuste el volumen a 15 mililitros con agua estéril invirtiendo suavemente para mezclar.Incubar la mezcla a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue 750 microlitros de DMSO e incubar en un baño de agua a 42 grados Celsius durante otros 30 minutos. Agregar el DMSO antes del choque térmico es crucial para lograr una alta eficiencia de transformación.Después de la incubación, peletizar la levadura centrifugando a 3.000 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 mililitros de agua estéril y luego repita la centrifugación para peletizar la levadura. Resuspender el pellet en ocho mililitros de agua.Determine la eficiencia de la transformación diluyendo la muestra de uno a 10 y enchatando 100 microlitros de cada dilución en un agar de doble deserción. A continuación, la placa 200 microlitros de la muestra en placas de agar de gatactosa de doble deserción e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 a 96 horas o hasta que aparezcan colonias. Una vez que las colonias hayan aparecido, parchearlas en el agar de gatactosa deserción doble e incubarlos durante otras 24 a 48 horas.Utilice parte del parche para inocular cinco mililitros de caldo de goteo doble e incubar el inóculo durante la noche a 26 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril a cinco pozos de una placa de 96 pozos comenzando con el pozo A2. Vortex la mezcla de cultivo durante la noche. Añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1 y diluir en serie utilizando el agua en los pozos A2 a A6. Detecte cinco microlitros de cada dilución en una sola deserción de glucosa y placas de ga gatactosa desinstado únicas, asegurándose de incluir el efector tóxico solo como control.Incubar las placas a 30 grados celsius durante 48 horas y luego comparar el crecimiento de la levadura con el efector tóxico solo con el crecimiento de la levadura con el supresor potencial. Para confirmar los supresores que han demostrado una disminución de la toxicidad en comparación con el efector tóxico solo, aísle el plásmido de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y vuelva a transformarlo en la levadura tóxica. Inocular caldo de glucosa de doble deserción con una colonia de la placa de transformación.Incubarlo durante la noche y detectarlo en el agar de doble deserción glucosa y ga gatasa para confirmar la supresión de la toxicidad. Antes de realizar la pantalla supresora de levadura, las proteínas efectoras de interés se probaron para detectar toxicidad en levaduras. La proteína de interés se expresó en la levadura bajo el control de un promotor inducible de ga gactosa y el crecimiento de la ga gactosa se comparó con el crecimiento de la glucosa.Cuando CT229 se probó para la toxicidad, se observaron colonias más pequeñas y supresión del crecimiento. Idealmente, se debe observar una disminución de dos a tres registros para proceder con las pantallas supresoras de levadura. La pantalla supresora se llevó a cabo transformando la cepa tóxica con la biblioteca genómica de levadura pYAP 13 y enchapando los transformantes en el agar gactosa.Los clones supresores obtenidos fueron vistos en el agar de gactosa de abandono doble para confirmar la supresión de la toxicidad. Los supresores pSup1 y pSup2 suprimieron la toxicidad de la proteína efectora, mientras que pSup3 no. Estos procedimientos requieren una cuidadosa atención al detalle, además de los trabajos preparatorios críticos, incluyendo tener grandes cantidades de medios y placas listos antes de realizar el experimento.Una vez identificados los supresores, se pueden realizar experimentos para verificar las interacciones con el efector de interés, incluyendo derribos, colocación de inmunofluorescencia, eliminación del efector o derribo de los factores del host identificados en las pantallas. El desarrollo de esta técnica para los efectores de la clamidia ha permitido la caracterización preliminar acelerada de las proteínas efectora y ha ayudado a centrar nuestros esfuerzos en el esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes que median las interacciones de los patógenos del huésped.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

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The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Investigación

Genética

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

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Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

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Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

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