Name: identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens
Uploaded: 2019-10-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Shelby Andersen, Abby McCullough ve Laurel Woods'a bu tekniklerle ilgili yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Iowa Üniversitesi Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü'nden Mary M. Weber'e başlangıç fonları tarafından finanse edilmiştir.

1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması
NOT: Plakalar tisme gününden önce hazırlanmalı ve 1 ay boyunca iyi olacaktır. Medya ve reaktifler herhangi bir noktada yapılabilir ve 1 ay boyunca iyidir.
<ol><li>1,000 mL'lik bir kabın içinde 800 mL distile suda 100 g D-(+)-glikozu eriterek glikoz çözeltisinin 1 L'sini (%10 w/v) hazırlayın. Distile su ile hacmi 1 L olarak ayarlayın. Steril 1 L ortam depolama şişesine 0,2 m steril filtreden süzün.</li>
	<li>1 L kabında 800 mL distile...

<ol>
	<li>Tan, Y., Luo, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+SidD+is+a+deAMPylase+that+modifies+Rab1.">Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1.</a> Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).</li><li>Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Legionella+effector+modulates+host+cytoskeletal+structure+by+inhibiting+actin+polymerization.">A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization.</a> Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).</li><li>Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+pneumophila+regulates+the+small+GTPase+Rab1+activity+by+reversible+phosphorylcholination.">Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+IV+secreted+effector+protein+CirA+stimulates+the+GTPase+activity+of+RhoA+and+is+required+for+virulence+in+a+mouse+model+of+Coxiella+burnetii+infection.">The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection.</a> Infection and Immunity. 84, (2016).</li><li>Faris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia+trachomatis+CT229+subverts+Rab+GTPase-dependent+CCV+trafficking+pathways+to+promote+chlamydial+infection.">Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection.</a> Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).</li><li>Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds.">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156, 119 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).</li><li>Kramer, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Functional+Genomic+Screens+Lead+to+Identification+of+a+Role+for+a+Bacterial+Effector+in+Innate+Immunity+Regulation.">Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).</li><li>H&#228;user, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-Based+Yeast+Two-Hybrid+Screens:+A+Practical+Guide.">Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide.</a> Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).</li><li>Mirrashidi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+mapping+of+the+inc-human+interactome+reveals+that+retromer+restricts+chlamydia+infection.">Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection.</a> Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+transformation+system+for+chlamydia+trachomatis:+Restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector.">Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).</li><li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+by+fluorescence-reported+allelic+exchange+mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis.">Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7 (1), 1-9 (2016).</li><li>Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-Specific,+Insertional+Inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+Using+a+Group+II+Intron.">Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron.</a> PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+specific+Chlamydia+trachomatis+inclusion+membrane+proteins+triggers+premature+inclusion+membrane+lysis+and+host+cell+death.">Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death.</a> Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).</li><li>Weber, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+IncA+is+required+for+Chlamydia+trachomatis+inclusion+fusion.">A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion.</a> Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).</li></ol>

Bu protokol, modifiye edilmiş maya toksisitesi ve bastırıcı ekran kullanarak bakteriyel efektör proteinler tarafından hedeflenen konak biyolojik yollarını belirlemek için adım adım prosedürleri özetliyor. Kullanılan maya suşu, S. cerevisiae W303, hem urasil hem de lösin için yardımcı dır. Suş urasil auxotrophy pYesNTA-Kan vektörü üzerinde ilgi protein taşıyan maya seçmek için kullanılır ise lösin ekofofimaya genomik kütüphane vektör pYep13 seçmek için kullanılır. Maya genomi...

Burada sunulan benzer prosedürlerin ilk raporu Legionella pnömofili tip IV efektör SidD karakterize,Rab11 değiştirir bir deAMPylase . Karşılaştırılabilir teknikler birkaç L. pnömofili efektörlerinin karakterizasyonu için kullanılmıştır1,2,3. Bir Coxiella burnetii tip IV efektör proteinkarakterizeetmek için yapılan tetkik, ve son zamanlarda bu tekniğin yararı Klamidya trachomatis inklüzum membran proteinlerin karakterizasyonu için genişletildi5 .
Bu protokol iki ana bölüme ayrılabilir: 1) hangi ilgi bakteriyel efektör protein ifade edilir maya toksisite ekranı ve klonlar bir büyüme defekti ile kanıtlandığı gibi toksik bir fenotip için taranır, ve 2) maya bastırıcı ekran , hangi toksik fenotip toksik suşu bir maya genomik kütüphane ifadesi ile bastırılır. Böylece, toksisite ekranı ilgi bakteriyel etkisi aşırı ifade edildiğinde büyüme kusurları olarak tezahür toksik fenotipler için bir ekrandır. Toksik klonlar, başarıyla dönüştürülmüş ve bakteriyel efektör ifade, seçilir ve bir sonraki adım için kaydedilir. İkinci büyük adım toksik maya klon kısmen sindirilmiş maya genomik kütüphane overexpressing içerir. Bu protokolde kullanılmak üzere önerilen maya genomik kütüphanesini oluşturan plazmidler, genellikle tüm plazmidlerde ~1,5 kb ortalama gen boyutuna karşılık gelen ve tüm maya genomunu kaplayan 5−20 kb ek uçlar taşırlar. yaklaşık 10x. Amaç bakteriyel efektör proteinin toksisitesini bastırmak için olduğu gibi, testin bu bölümü, bastırıcı ekran denir. Potansiyel bastırıcı plazmidler mayadan izole edilir, dizilir ve baskılayıcı ORF'ler tanımlanır. Bastırıcı ekranın altında yatan mantık, efektör proteinin hedefaldığı ana yol bileşenlerini bağlaması, etkileşimi ve/veya bunaltmasi ve bu konak proteinlerinin aşırı olarak geri sağlanmasının yol üzerindeki toksik etkiyi kurtarabileceği ve böylece, büyüme kusuru. Böylece, toksisiteyi baskılayan tanımlanmış ORF'ler genellikle bir ana yolun birden fazla katılımcıyı temsil eder. Ortogonal deneyler daha sonra bakteriyel efektör gerçekten karıştığı yol ile etkileşime doğrudoğrulamak için yapılır. Bu proteinler çok sayıda konak sürecine dahil olduğundan, clathrin veya aktin gibi bağlayıcı bir ortak tespit edildiyse bu özellikle gereklidir. Daha sonra daha fazla deney enfeksiyon sırasında efektör proteinfizyolojik işlevini açıklayabilir. Toksisite ve bastırıcı ekranlar aynı zamanda, konak proteinlerini immünoprepitasyon la tespit etmeye yetecek yakınlıklarla fiziksel olarak bağlamayan veya bir maya-iki hibrid ekran tarafından tespit olmayabilir enzimatik vur-çalıştır etkileşimleri ev sahibi.
Bastırıcı ekran bakteriyel efektör proteinler ve konak yolları arasındaki potansiyel fizyolojik etkileşimleri ortaya çıkarmak için güçlü bir yöntem olsa da, bakteriyel efektör protein maya bir büyüme defekti neden olmalıdır, aksi takdirde kullanarak bastırıcı ekran çok az kullanım olacaktır. Ayrıca, toksik fenotip büyüme en az 2−3 log10 açığı neden olmalıdır ya da bastırıcılar belirlemek zor olacaktır. Bir laboratuvar hücre kültürü için kurulmuşsa, HeLa gibi ortak hücre hatlarında toksisite için tarama efektörü proteinler genellikle maya toksisite ekran ile devam etmek için çaba değer olup olmadığı konusunda fikir verebilir. HeLa hücrelerinde efektör proteinin ektopik ekspresyonu bazen bu ekranlar için kullanılan maya suşundaki toksisite ile çok güçlü bir şekilde ilişkili toksisite ile sonuçlanır4. HeLa hücrelerinde stres gözlemlenebilir özellikleri stres liflerinin kaybı dahil, plaka hücre ayrılması, ve apoptosis gösteren nükleer yoğuşma. HeLa hücrelerinde stres herhangi bir görsel göstergesi ilgi protein maya bir büyüme defekti indüklemek için iyi bir aday yapmak, hangi çok daha hızlı çoğaltmak ve böylece daha gerekli yolların tedirginlik duyarlı.
Bu bastırıcı ekran her zaman bastırıcı olarak konak bağlayıcı ortakları tanımlamak değil unutulmamalıdır, ama yine de hedeflenen konak yolu (lar) kritik bileşenleri ima edebilir, biyolojik süreçlerin bütünsel bir görünüm elde bakteriyel efektör protein. Yüzeyde, bu mantıksız görünüyor, çünkü aşırı efektör protein bağlayıcı ortağı sağlayan büyüme defekti kurtarmak için beklenebilir. C. trachomatis efektör protein CT229 (CpoS) tarafından hedeflenen yolları belirlemek için çabalar, hangi enfeksiyon sırasında en az 10 farklı Rab GTPases bağlanır5, Rab bağlayıcı ortakların hiçbiri CT229 toksisitesini bastırılmış. Ancak, clathrin kaplı vezikül (CCV) ticaretinde yer alan çok sayıda bastırıcı tespit edilmiştir ve bu da CT229'un özellikle Rab bağımlı CCV ticaretini bozan çalışmalara yol açmıştır. Benzer şekilde, C. burnetii efektör protein Cbu0041 (CirA) maya büyüme defekti kurtarıldı birkaç Rho GTPases araştırırken tespit edildi, ve daha sonra RhoA için bir GTPase aktive protein (GAP) olarak CirA fonksiyonları bulundu4.
Bakteriyel efektör proteinler tarafından hedeflenen konak yollarının aydınlatılması için maya bastırıcı ekranın yararlılığı abartılamaz ve hücre içi bakteriyel efektör proteinlerini karakterize etmeye çalışan diğer araştırmacılar bundan büyük ölçüde fayda sağlayabilirler. bu teknikler. İmmünenyağışlar ve/veya maya-iki hibrid ekranlar bağlayıcı bir ortak bulamamışsa ve hangi yolların bakteriyel efektör protein tarafından hedeflendiğini açıklayabilirse bu tahliller değerlidir. Burada, hücre içi bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak biyolojik yollarını belirlemek için toksisite ve bastırıcı ekranlar için ayrıntılı protokoller, ayrıca bu tahliller ve bunların kullanımında karşılaşılan ortak engellerden bazıları sağlanır. ilgili çözümler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:871px;" width="870">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Agar</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2641500</td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Galactose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G0750-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet Gel extraction kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet PCR purification kit</td>
			<td style="width:199px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">GeneJet plasmid miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">K0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Herring Sperm DNA</td>
			<td style="width:199px;">Promega</td>
			<td>D1811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">KpnI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R3142S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>L6883-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly(ethylene glycol) 3350</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>1546547-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pYep13</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">37323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>470031-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">XhoI-HF</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast miniprep kit</td>
			<td style="width:199px;">Zymo</td>
			<td style="width:119px;">D2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y0626-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1501-20G</td>
			<td>without uracil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements</td>
			<td style="width:199px;">MilliporeSigma</td>
			<td>Y1771-20G</td>
			<td>without uracil, leucine, tryptophan</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of host pathways targeted by bacterial effector proteins using yeast toxicity and suppressor screens

Hücre içi bakteriler, konak proteinleri ve/veya bunların ilişkili biyolojik yollarını bakterinin yararına bozmak için harekete giren konak sitosola efektör proteinler adı verilen virülans faktörleri salgılarlar. Putatif bakteriyel efektör proteinlerinin tanımlanması, bakteri genom dizilimindeki gelişmeler ve salgı adaylarını ve/veya ökaryotik benzeri genlerin silico olarak tanımlanmasına olanak sağlayan algoritmaların ortaya çıkması yla daha yönetilebilir hale gelmiştir. Etki alanları. Ancak, bu önemli virülans faktörlerinin belirlenmesi sadece bir başlangıç adımıdır. Doğal olarak, amaç efektör proteinlerin moleküler fonksiyonunu belirlemek ve konak ile nasıl etkileşime açıklanır. Son yıllarda, maya iki melez ekran ve kütle spektrometresi ile birleştiğinde büyük ölçekli immünopretri gibi teknikler protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde yardımcı olması. Bir konak bağlayıcı ortağın tanımlanması, bakteriyel efektör proteinin moleküler işlevini niçin açıklığa kavuşturmaya yönelik önemli bir ilk adım olsa da, bazen konak proteinin birden fazla biyolojik işlevi olduğu saptandı (örneğin, aktin, klathrin, tubulin), veya bakteriyel protein, konak proteinlerini fiziksel olarak bağlamayabilir, bu da araştırmacıyı manipüle edilen kesin konak yolu hakkında önemli bilgilerden mahrum bırakabilir. Bir bastırıcı ekran ile birleştiğinde modifiye maya toksisite ekranı bakteriyel efektör proteinler tarafından etkilenen konak yollarını belirlemek için adapte edilmiştir. Toksisite ekranı, genellikle büyüme kusuru olarak kendini gösteren konak biyolojik yolları etkileyen efektör proteinin neden olduğu mayadaki toksik etkiye dayanır. Bir maya genomik kütüphane ifadesi bakteriyel efektör proteintoksisitesini bastırmak ve böylece etkici protein hedefleri yolunda proteinleri belirlemek konak faktörleri tanımlamak için kullanılır. Bu protokol hem toksisite hem de bastırıcı ekranlar için ayrıntılı talimatlar içerir. Bu teknikler moleküler klonlama ve maya ve Escherichia coliekimi yeteneğine sahip herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Gerçek maya bastırıcı ekran yapılabilir önce, ilgi efektör protein maya toksisite için test edilmelidir. Bu bir galaktoz indükleyici kontrolü altında maya ilgi protein ifade ederek gerçekleştirilir. Glikozda büyüme (nonindücing koşulları) öncelikle toksisite özellikle ilgi proteininin ekspresyonundan kaynaklandığından ve genel bir kusur olmadığından emin olmak için karşılaştırılmalıdır. Şekil 3'tegösterildiği gibi toksisite daha küçük koloniler ve/veya...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens at JoVE.com

Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens

Bakteriyel patojenler, önemli biyolojik süreçleri hedef alan konakiçine protein salgılarlar. Bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarının belirlenmesi moleküler patogenezi ele almanın anahtarıdır. Burada, toksik bakteriyel efektör proteinlertarafından hedeflenen konak yollarını açıklamak için modifiye edilmiş maya bastırıcı ve toksisite ekranı kullanılarak kullanılan bir yöntem tanımlanmıştır.

Maya Toksisitesi ve Bastırıcı Ekranlar Kullanılarak Bakteriyel Efektör Proteinlertarafından Hedeflenen Konak Yollarının Belirlenmesi

Intracellular bacteria secrete virulence factors called effector proteins into the host cytosol that act to subvert host proteins and/or their associated ...

Hücre içi bakteriler, patojen sağkalımını teşvik etmek için biyolojik yolları manipüle edebilen konak içine efektör proteinlersalgılar. Chlamydia trachomatis gibi hücre içi patojenlerin anlaşılması için etki cisim hedeflerinin ortaya çıkması esastır. Maya toksisitesi ve bastırıcı ekranlar bakteriyel efektör proteinlerin doğal biyolojik hedefi ile ilgili anahtar fikir sağlayabilir ve bağlayıcı bir ortak bilinmiyor sayılsa da özellikle yararlı olabilir.Biz klamidya trachomatis efektör proteinler için tarama için burada maya toksisitesi ve bastırıcı tahliller göstermek, ama bu teknik de Legionella pnömofili ve Coxiella burnetii etkileri karakterize etmek için kullanılmıştır. Plazmid içeren efektör proteinile dönüştürülmüş tek bir maya kolonisi ile tek damla suyu beş mililitre aşılayarak başlayın. Negatif kontrol olarak tek başına vektör ile dönüştürülmüş maya kullanın ve sallayarak 30 derece santigrat gecede incubate.Ertesi gün, 96 kuyulu bir plakanın A6 kuyuları aracılığıyla A2'ye 180 mikrolitre steril su ekleyin. Vortex gecede kültür ve iyi A1 maya 180 mikrolitre ekleyin. Sonra seri su ile kuyularda maya seyreltin. Tek damla glikoz ve tek drop-out galaktoz agar plakaları üzerine her seyreltme beş mikrolitre nokta ve 48 saat boyunca 30 santigrat derece plakaları kuluçka için çok kanallı pipet kullanın.Kuluçkadan sonra, galaktoz içeren ortam üzerinde yetişen efektör proteini ifade eden mayanın büyümesini, vektörü tek başına ifade eden mayanın büyümesi ile karşılaştırarak toksisiteyi görsel olarak değerlendirin. 100 mililitrelik tek damla suyu, önceden hazırlanmış maya stokunun bir mililitresi ile aşıla ve 150 RPM'de sallayarak 30 santigrat derecede 16 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, gece kültürünün tüm 100 mililitre sini 900 mililitre önceden ısıtılmış tek bırakma suyu ekleyin ve şişeyi 30 santigrat derecede 4-5 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 6,000 kez g'de kültürü peletleyin. Supernatant atın ve steril su 250 mililitre pelet resuspend. Santrifüjtekrar layın ve supernatant atın.Sonra bir milimolar lityum asetat 250 mililitre pelet resuspend. Santrifüj ile kültür pelet, lityum asetat kaldırmak ve% 50 PEG 3350 9,6 mililitre pelet resuspend. Daha sonra el yazmasında açıklandığı gibi dönüşüm reaktifleri ekleyin ve hacmi 15 mililitreye ayarlayın ve steril su yavaşça karıştırarak ters çevirin.Karışımı 30 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra dmso 750 mikrolitre ekleyin ve başka bir 30 dakika için 42 santigrat derece bir su banyosu nda kuluçka. Yüksek dönüşüm verimliliği elde etmek için DMSO'nun ısı şokundan önce eklenmesi çok önemlidir.Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 3,000 kez g santrifüj ederek maya pelet. Supernatant atın ve steril su 10 mililitre ile pelet yıkayın sonra maya pelet için santrifüj tekrarlayın. Peleti sekiz mililitre suda tekrar askıya alın.Numuneyi 1'den 10'a kadar seyrelterek dönüşüm verimliliğini belirleyin ve her seyreltmenin 100 mikrolitresini çift damla-out agar üzerine kaplama. Daha sonra numunenin 200 mikrolitresini çift açılır galaktoz agar plakasına koyun ve plakaları 48 ila 96 saat veya koloniler ortaya çıkana kadar 30 derecede kuluçkaya yatırın. Koloniler ortaya çıktıktan sonra, onları çift açılır galaktoz agar'a yamalayın ve 24 ila 48 saat daha kuluçkaya yatırın.Beş mililitre çift açılır et suyu aşılamak ve inoculumu bir gecede 26 santigrat derecede 150 RPM'de sallayarak kuluçkaya yatırmak için yamanın bir kısmını kullanın. Ertesi gün, iyi A2 ile başlayan 96 kuyulu bir plaka beş kuyuya steril su 180 mikrolitre ekleyin. Girdap gece kültür karışımı. Iyi A1 maya 180 mikrolitre ekleyin ve seri a2 ile A6 kuyularında su kullanarak seyreltin. Tek damla glikoz ve tek drop-out galaktoz agar plakaları üzerinde her seyreltme Nokta beş mikrolitre tek başına bir kontrol olarak toksik efektör dahil emin olun.48 saat boyunca 30 santigrat derece plakaları kuluçka ya da potansiyel bastırıcı ile maya büyüme tek başına toksik efektör ile maya büyümesini karşılaştırın. Sadece toksik etki yle karşılaştırıldığında azalmış toksisite gösteren bastırıcıları doğrulamak için, plazmidi el yazması yönlere göre izole edin ve toksik mayaya yeniden dönüştürün. Dönüşüm plakasından bir koloni ile çift damla glikoz suyu aşılamak.Bir gecede kuluçkaya yatırın ve toksisitenin bastırılmasını doğrulamak için çift damla glikoz ve galaktoz agar üzerinde nokta. Maya bastırıcı ekran gerçekleştirmeden önce, ilgi efektör proteinler maya toksisite için test edildi. İlgi proteini bir galaktoz indükleyici kontrolü altında maya ifade edildi ve galaktoz büyüme glikoz büyüme ile karşılaştırıldı.CT229 toksisite testi yapıldığında, daha küçük koloniler ve büyüme baskılanması gözlendi. İdeal olarak, maya bastırıcı ekranlar ile devam etmek için bir iki ila üç günlük azalma gözlenmelidir. Bastırıcı ekran, maya genomik kütüphane pYAP 13 ile toksik suşun dönüştürülmesi ve galaktoz agar üzerindeki transformatörlerin boyanması ile gerçekleştirilmiştir.Elde edilen bastırıcı klonlar toksisite bastırılması onaylamak için çift drop-out galaktoz agar tespit edildi. Bastırıcılar pSup1 ve pSup2 efektör proteinin toksisitesini bastırırken pSup3 bunu yapmadı. Bu yordamlar, denemeyi gerçekleştirmeden önce büyük miktarda ortam ve plakanın hazır olması da dahil olmak üzere kritik hazırlık çalışmalarına ek olarak ayrıntılara dikkat etmeyi gerektirir.Bastırıcılar tanımlandıktan sonra, çekme inmeleri, immünoreskence kolokalizasyonu, efektör nakavt veya ekranlarda tanımlanan konak faktörlerinin nakavt ı dahil olmak üzere ilginin etkisiyle etkileşimleri doğrulamak için deneyler yapılabilir. Klamidya efektörleri için bu tekniğin geliştirilmesi, efektör proteinlerin ön karakterizasyonunun hızlandırılmasına olanak sağladı ve patojen etkileşimlerine aracılık eden altta yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yönelik çabalarımızı odaklamaya yardımcı oldu.

Research

JoVE Journal

Genetics

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification ADCI and Dose Estimation

Hızlandırılmış radyasyon Biodosimetry tarafından otomatik Disentrik kromozom tanımlama (ADCI) ve doz tahmini

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Sinerjik uyuşturucu kombinasyonları örtüşme2 yöntemi tarafından yüksek üretilen iş tanımlaması

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...