Name: electrowetting-based digital microfluidics platform for automated enzyme-linked immunosorbent assay
Uploaded: 2020-02-23T12:00:00
Duration: 8 min 22 s
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Wir möchten den Beitrag unserer Kollegen von der Microfluidic & Microengineering Research Group für ihre Arbeit an der mechanischen Konstruktion und Systemintegration würdigen. Die Autoren danken Dstl Porton Down für ihre unschätzbare Unterstützung und finanziellen Beitrag, für vergangene und laufende Projekte, die die DMF-Technologie und ihre Anwendungen weiterentwickeln.

1. Vorläufige Schritte, die für den Test erforderlich sind
HINWEIS (WICHTIG): Alle vorbereitenden Schritte müssen in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Natriumazid sollte nicht zur Lagerung verwendet werden, da es die Aktivität des Enzyms Meerrettichperoxidase (HRP) hemmen würde.
<ol><li>Vorbereiten Sie den Laufpuffer (100 mM HEPES, pH 7,5), indem Sie die (4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-Ethanesulfonsäure verwenden, und fügen Sie Tween 80 zu einer Konzentration von 0,01% (v/v) hinzu.</li>
	<li>Immobilisieren Sie die primären Antikörper (Capture-Antikörper) auf die Oberfläche der NHS-aktivierten magnetischen Mikroperlen, indem Sie dem vom Lieferanten bereitgestellten Protokoll folgen. Kurz gesagt, das Magnetic IP/Co-IP Kit (Table of Materials) Protokoll umfasst die folgenden Schritte.<ol>
<li>Aliquot 0,2 ml Perlen (2 mg) in ein Kunststoffrohr und entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen, indem Sie 1 ml eiskalte 1 mM HCl hinzufügen.</li>
		<li>Binden Sie den ausgewählten Antikörper (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyklonal, Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonal oder Goat anti-MS2 polyklonal), 40 g/ml in 67 mM Boratpuffer, kovalent zu den Perlen für 1 h mit Schütteln bei 37 °C. Tabelle 1 enthält die Liste aller Antikörper, die mit dem aktuellen Protokoll und den Antigenerregern6verwendet werden.</li>
		<li>Waschen Sie die ungebundenen Antikörper zweimal mit 0,8 ml Elution Buffer.</li>
		<li>Die Reaktion mit 1 ml Quenching Buffer für 1 h ablöschen.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen einmal mit Modified Borate Buffer und einmal mit IP Lysis/Wash Buffer.</li>
		<li>Die Perlen in 0,5 ml IP Lysis/Waschpuffer aussetzen und bei 4 °C lagern, bis sie für den Einsatz erforderlich sind. HINWEIS: Für beste Ergebnisse wird eine frische Charge von Mikroperlen am Tag vor der EWOD-Isolation und dem ELISA-On-Chip an die Antikörper gekoppelt. Die an den Primärantikörper gekoppelten Mikroperlen können jedoch bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden. Sollte es zu einer Agglomeration kommen, tippen Sie auf die Durchstechflasche, um den Niederschlag zu brechen und die Perlen in der Lösung wieder auszusetzen.</li>
		<li>Blockieren Sie die Mikroperlen mit dem gekoppelten Antikörper über Nacht, mit der Endkonzentration 4 mg/ml für die Mikroperlen, in einem Blocker Casein (1% w/v) in 100 mM Phosphat-gepufferter Saline (PBS). HINWEIS: Der Blockierungsschritt wird immer am Tag vor dem Biodetektionstest durchgeführt.</li>
		<li>Trennen Sie die Perlen vom Blocker Casein mit einem Magneten und entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend in 1 ml Laufpuffer und mischen für 1 min.</li>
		<li>Trennen Sie die Perlen mit dem Magneten und entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Wiederholen Sie die oben genannten Waschschritte (1.2.10 und 1.2.11) zweimal. HINWEIS: Drei Waschschritte reichen aus, um die Haftung der Perlen an der Oberfläche zu reduzieren und die freie Bewegung des Tröpfchens zu erleichtern.</li>
		<li>Die Perlen im Laufpuffer in einer Konzentration von 2,5 mg/ml wieder aussetzen. Diese Lösung von Mikroperlen ist bereit, mit dem EWOD-Chip zu verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung der neutravidin konjugierten Meerrettichperoxidase (HRP) und des sekundären biotinylierten Antikörpers auf eine Endkonzentration von jeweils 1 g/ml im Laufpuffer vor (verwendet für BG-Nachweis6). ANMERKUNG: Um die Antigene (Tabelle 1) anzusprechen, wurden verschiedene Konzentrationen von sekundären biotinylierten Antikörpern im Bereich von 0,5 bis 4,0 g/ml erfolgreich getestet.</li>
	<li>Mischen Sie gleiche Volumina des Luminol mit Wasserstoffperoxidlösung kurz vor dem Ausführen des HINWEIS: Luminol wird verwendet, um die Anzahl der Bindungsereignisse basierend auf dem HRP-Enzym zu quantifizieren, das kovalent an den sekundären Antikörper gebunden ist, der auf das Antigen (z. B. Krankheitserreger) abzielt. Jedoch, verschiedene Berichtsmoleküle und Strategien können für den Nachweis17 anstelle der Chemilumineszenz und Luminol verwendet werden.</li>
</ol>2. Herstellung und Oberflächenbehandlung der EWOD-Chipkomponenten
HINWEIS: Der EWOD-Chip besteht aus einer Betätigungsplatte mit gemusterten Chromelektroden, um den scheinbaren Kontaktwinkel eines Tröpfchens und eine Abdeckplatte abzuwechseln, um die Höhe der Tröpfchen zu definieren.
<ol><li>Zeichnen Sie das Design der Elektroden und Steckverbinder in 2D mit Standard-CAD-Software. Zur Lagerung der verwendeten Lösungsmittel(Abbildung 1)ist auch das Abfallsammelpad mit den Abmessungen 5 x 5 mm2 miteinbeziehen. HINWEIS: Um die Tröpfchen zu manipulieren, verwenden wir 47 Elektroden mit jeweils 1,7 x 1,7 mm2. Diese Elektrodengröße bietet Platz für Tröpfchenvolumina zwischen 1,5 l und 3 l (bei einem Abstand von 500 m). Erfahrungsgemäß ist bei der Arbeit mit einem Abstand von 500 m die minimale Tröpfchengröße, die betätigt werden kann. Sie entspricht in etwa der Tröpfchenkontur (projiziert), die auf das quadratische Pad begrenzt wird. Es gibt jedoch keine theoretische Grenze in der Größe, außer durch den Widerstand (Reibung) des Flüssigkeitskörpers verursacht. Es wird jedoch empfohlen, dass das Volumen bei einer zuverlässigen Betätigung mit einem Abstand von 500 m nicht mehr als 3 l beträgt. Die Elektroden werden von 48-Kanal-Elektronik adressiert. HINWEIS: Die Designabmessungen und -größen der Pads können je nach den vorgesehenen Volumen und den Laboreinheiten (LUOs), aus denen das Protokoll besteht, variieren.</li>
	<li>Senden Sie die Entwurfszeichnung an einen Maskenfertigungsservice, um die Chrommaske auf ein Glassubstrat zu drucken. Die Dicke der Chromschicht beträgt 100 nm. HINWEIS: Die Chromschicht auf der Fotomaske, die als Substrat für den EWOD-Chip verwendet wird, ist per Definition undurchsichtig. Das Design jeder unserer Elektroden beinhaltet ein Rasterlayout, um Halbtransparenz zu gewährleisten.</li>
	<li>Schneiden Sie die Platte auf die Größe von 56 x 56 mm2 mit einer Präzisions-CNC-Dicing/Cutting Saw.</li>
	<li>Klebeband über die elektrischen Kontakte kleben, um sie während der beiden Beschichtungsschritte zu isolieren.</li>
	<li>Beschichten Sie die Platte Chrom-Glas-Platte mit einer dielektrischen Schicht, indem Sie 6 m Parylen-C auf ihre Oberfläche legen. Das Gorham-Verfahren18 wird mit 7,4 g DPX-C in einem Parylen-Depositionssystem (Materialtabelle )verwendet.</li>
	<li>Spin-coat amorphe Fluorpolymere (Materialtabelle) mit einem Spincoater bei 1500 U/min für 30 s auf der Platte und backen Sie es bei 140 °C für 30 min. HINWEIS: Dadurch wird die Oberfläche hydrophob. Man kann überprüfen, ob die Beschichtung erfolgreich abgelagert wurde, indem man ein Tröpfchen Wasser auf die Oberfläche legt. Der Kontaktwinkel zwischen dem Tröpfchen und der Platte muss im Bereich von 110o liegen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Klebeband von den elektrischen Kontakten.</li>
	<li>Spin-coat amorphe Fluorpolymere (Materialtabelle) mit einem Spincoater bei 1500 U/min für 30 s auf dem 4-in Silizium-Wafer und backen Sie ihn bei 140 °C für 30 min. HINWEIS: Es ist wichtig, dass sowohl die Oberflächen der Betätigungsplatten als auch die Abdeckplatten hydrophob sind, um eine reibungslose Bewegung der diskreten Tröpfchen während des Assays zu erleichtern.</li>
</ol>3. Beladen, Montage und Betrieb des EWOD-Chips auf der DMF-Plattform
HINWEIS: Der EWOD-Chip arbeitet in Parallelplattenkonfiguration mit einem genau definierten Abstand von 0,5 mm zwischen der Betätigungsplatte und der leitfähigen, geerdeten Abdeckplatte. Diese Sandwich-Baugruppe wird im aktuellen Abschnitt beschrieben.
<ol><li>Entfernen Sie den Deckel von der DMF-Plattform6 und legen Sie ihn auf die Bank. HINWEIS: Eine dunkle Faraday Käfigkammer ist notwendig, um Streulicht und elektromagnetische Störungen während der Detektion zu verhindern. Es gibt keine Verriegelung auf dem Deckel, daher ermöglicht die Plattform uns, die Bewegung von Tröpfchen zu beobachten.</li>
	<li>Legen Sie eine saubere Betätigungsplatte auf die rotierende Bühne, Chrom nach oben gerichtet. Die Platte muss an der oberen linken Ecke der Einbaubühne ausgerichtet werden (Abbildung 2A).</li>
	<li>Klemmen Sie die Betätigungsplatte von oben mit der Platte mit den 47 Kontaktstiften. Dies sichert die Platte an Ort und Stelle und erleichtert die Ausrichtung mit den Kontaktstiften.</li>
	<li>Legen Sie den 0,5 mm Shim und den 2 mm Polymethylmethacrylat (PMMA) Separator auf die rotierende Stufe, um einen kontrollierten Spalt zwischen der Betätigung und den Abdeckplatten zu schaffen. HINWEIS: Optional kann das Feuchtigkeitstransportpapier auf das Abfallentsorgungspad gelegt werden, bevor die Tröpfchen vor dem nächsten Schritt aliquotiert werden. Während der Test fortfährt, wird der Abfall direkt in das Papier aufgenommen, das am Ende des Assays entfernt werden kann.</li>
	<li>Laden Sie die Tröpfchen auf die vorgeschlagenen Ladepads (Abbildung 1).<ol>
<li>Aliquot vier 2,5-L-Tröpfchen aus dem Running-Puffer auf die B-, A-, R-, E-de-bezeichneten Pads, ein Tröpfchen auf jedem Pad.</li>
		<li>Aliquot 2,5 l L:H2O2 (1:1, v/v) Lösung auf dem D-bezeichneten Pad.</li>
		<li>Aliquot 2,5 l Neutravidin konjugiert mit HRP (1 g/ml) auf das F-bezeichnete Pad.</li>
		<li>Aliquot 2,5 l biotinylierter Sekundärantikörper (1 g/ml) auf das G-de-de-denoted Pad.</li>
		<li>Aliquot 2.5 μL of Microbeads with conjugated primary antibody (2.5 mg/mL) go onto I-denoted pad.</li>
		<li>Aliquot 2,5 l der unbekannten Probe auf C-bezeichnetes Pad. ANMERKUNG: Das vorgeschlagene Lademuster ist nur ein Beispiel für ein experimentelles Layout, jedoch kann das Lademuster an die Bedürfnisse der Benutzer anpassen, solange diese Änderungen mit der in der Software definierten Sequenz übereinstimmen (Ergänzende Datei 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Abdeckplatte neben dem runden Aussparbereich auf die Oberfläche des Rigs und schieben Sie sie seitlich in die Aussparung und auf die Oberseite der Betätigungsplatte (Abbildung 2B).</li>
	<li>Setzen Sie den Permanentmagneten auf die Abdeckplatte und befesten Sie ihn, indem Sie die beiden Riegel schieben (Abbildung 2C).</li>
	<li>Drehen Sie die Bühne um 180° und überprüfen Sie visuell, ob die geladenen Tröpfchen noch an Ort und Stelle sind (Abbildung 1C). HINWEIS: Man sollte in der Lage sein, die Position und die Form der Tröpfchen durch die transparente Bühne und die Rückseite der Betätigungsplatte zu augaugen (Abbildung 2D). Der Test ist einsatzbereit, wenn runde Tröpfchen auf den Ladeelektrodenpads zu sehen sind. Falls ein Tröpfchen verschoben wird, kann man den Magneten und die Abdeckplatte entfernen, dann das verdrängte Tröpfchen mit einer sauberen Pipette wiederherstellen und wieder auf das Ladepad legen.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die Ladeposition für jedes Tröpfchen mit der programmierten Betätigungssequenz in der Software übereinstimmt (Details zur Software finden Sie in der Zusatzdatei 1). HINWEIS: Um die Position der Tröpfchen visuell überprüfen zu können, muss der Photodetektor demontiert werden (Abbildung 2D).</li>
	<li>Positionieren Sie den abgeschirmten Fotodetektor "kann" in den Schlitz der rotierenden Stufe. HINWEIS: Das Photodetection-System schwenkt um eine Photodiode, die eine große Sammelfläche (10 x 10 mm2) hat, um die Lichtsammlung ohne zusätzliche Optik zu maximieren, sowie einen Transimpedanzverstärker, um Rauschen zu minimieren6. Das System ist jedoch extrem empfindlich und kann winzige Signale sammeln. Um den Geräuschpegel zu reduzieren, wurden eine Reihe von elektronikbasierten Strategien implementiert (z. B. wurde das Photodetection-System durch Denkadus in einem Faraday-Käfig geschützt, einem Metallgehäuse, das als abgeschirmtes "Can" bekannt ist).</li>
	<li>Schließen Sie das Kabel an den Photodetektor mit der Schirmung "kann". HINWEIS: Sobald der EWOD-Chip am Photodetektor ausgerichtet ist, ist die DMF-Plattform komplett montiert und kann nun betriebsbereit sein.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel über die DMF-Plattform und starten Sie die Programmsequenz über die an der University of Hertfordshire entwickelte Software-Schnittstelle. HINWEIS: Zusätzliche Software wird zum Lesen und Aufzeichnen der Lumineszenz aus dem Tröpfchen als Funktion der Zeit in einer CSV-Datei verwendet (siehe Ergänzende Datei 2).<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die programmierte Sequenz (siehe Ergänzende Datei 1) an der Schnittstelle angezeigt wird, um den Bediener darüber zu informieren, dass "das Luminol-Tröpfchen bereit ist, die extrahierten Magnetperlen zu sammeln" oder "Der Detektionströpfchen ist bereit, an die Erkennungsstelle verschoben zu werden." In beiden Fällen ist eine Bestätigung des Bedieners erforderlich, um mit der Sequenz fortzufahren.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Betrieb im visuellen Modus (Optional zur Optimierung von Protokollen)
HINWEIS: Um jeden Tröpfchen-basierten Vorgang zu visualisieren, kann der Test auf Wunsch durch Überspringen der Schritte 3.10-3.12 und ersetzen durch die folgenden Operationen betrieben werden.
<ol><li>Starten Sie die Programmsequenz über die Softwareschnittstelle. HINWEIS: Die Tröpfchenbewegung kann während des Betriebs im visuellen Modus beobachtet werden, was bei der Protokolloptimierung nützlich ist. Erstens, um die Reproduzierbarkeit des magnetischen Trennvorgangs zu überprüfen. Zum Beispiel, wenn die Menge der verwendeten Perlen zu niedrig ist, wird die magnetische Trennung nicht auftreten, umgekehrt, wenn die Menge der Perlen zu hoch ist, kann das Tröpfchen durch das Perlenpellet immobilisiert werden. Zweitens, die Zuverlässigkeit eines neuen Assays zu ermitteln, da eine Tröpfchenformulierung eine Betätigungsstörung verursachen kann, die durch Beobachtung nachgewiesen werden kann.</li>
	<li>Montieren Sie den photodetektor abgeschirmt "kann" in den Schlitz der rotierenden Bühne, wenn Sie dazu aufgefordert werden.</li>
	<li>Schließen Sie das Kabel an den Fotodetektor mit der Schirmung "kann", indem Sie die Stifte in die Steckdose einsetzen.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel über die DMF-Plattform und setzen Sie den Test fort. HINWEIS: Verwenden Sie die zusätzliche Software zum Lesen und Aufzeichnen der Lumineszenz aus dem Tröpfchen als Funktion der Zeit in einer CSV-Datei (siehe Ergänzende Datei 2)</li>
</ol>5. Entfernen von flüssigen Abfällen und Reinigen des Chips
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass das Gerät vor der Reinigung ausgeschaltet und von den Stromquellen (Computer, Hauptgerät) getrennt ist. Tragen Sie Handschuhe, einen Labormantel und schutzbrillen Schutzglas (PPE) beim Entfernen biologischer Proben aus dem Chip!
<ol><li>Um auf die Elektroden und die verwendeten Lösungsmittel auf der Betätigungsplatte zuzugreifen, öffnen Sie den DMF-Plattformdeckel und drehen Sie die Bühne um 180°.</li>
	<li>Entpacken Sie das Magnetgehäuse, entfernen Sie den Magneten von der rotierenden Bühne und legen Sie ihn auf die Bank.</li>
	<li>Entfernen Sie die Abdeckplatte, Siliziumwafer, aus dem Schlitz mit einer Pinzette, spülen Sie sie mit DI-Wasser, trocknen Sie sie mit Druckluft und legen Sie sie in eine Petrischale, wo der Wafer gelagert und wiederverwendet werden kann.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikropipette, um den flüssigen Abfall aus dem Pad zu bewegen, ohne die Oberfläche zu berühren.</li>
	<li>Reinigen Sie die Oberfläche, indem Sie die Flüssigkeit mit saugfähigem Papier (Filtermaterial) von der Betätigungsplatte ableiten. HINWEIS: Wenn Sie die Oberfläche intakt halten, erhöht sich die Lebensdauer der Betätigungsplatte, die mehrere Anwendungen ermöglicht.</li>
	<li>Reinigen Sie die Betätigungsplatte, indem Sie die Oberfläche der Elektroden mit einem sauberen DI-Wassertropfen mit einer sauberen Pipette sanft fegen. Entfernen Sie dann das Tröpfchen mit Papierkorb (Filtermaterial). VORSICHT: Entsorgen Sie die mit biologischem Material kontaminierten Gewebe, Papiere, Pipettenspitzen und Handschuhe in der Bioabfalltonne.</li>
	<li>Verwenden Sie die Betätigungsplatte für einen anderen Test oder entfernen Sie sie von der DMF-Plattform für die Lagerung oder das Recycling.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das EWOD-Immunoassay-Protokoll ist flexibel und kann je nach Reagenztyp, Stabilität und Nutzungsanforderungen, die durch das Assay-Protokoll definiert sind, eine Vielzahl von Laboreinheitenoperationen (z. B. Capture-Antigen, Mischen, Inkubation, Perlenextraktion, Waschen) umfassen. Als Beweis des Prinzips werden im aktuellen Artikel zwei Immunoassay-Protokolle berücksichtigt, die die Implementierung von acht oder zehn LUOs (Abbildung 4) mit dem beschriebenen EWOD-Chip zeigen. Eine solche Miniaturisierung verdient durch den Mikroliter, diskrete Volumen von Reagenzien/Analyt, die die Wirksamkeit des ELISA erhöhen, indem sowohl der Verbrauch von Reagenzien, die pro Operation benötigte Zeit, im Wesentlichen die gesamte Versuchszeit (6 bis 10 min). Darüber hinaus wird der Assay automatisiert mit zeitweiser Manipulation der Tröpfchen, was Variationen verringert und die Präzision des Immunoassays17verbessert. In seinem derzeitigen Format beinhaltet das Experiment die manuelle Handhabung von Tröpfchen zu Beginn jedes Assays, was ein Punkt für die weitere Diskussion im nächsten Abschnitt ist.
Ein wichtiger Schritt in der aktuellen DMF-Methode ist das Dosieren der Tröpfchen auf der Oberfläche des EWOD-Chips. Typischerweise wird eine Mikropipette mit einer Einwegspitze verwendet, um das genaue Volumen zu messen und zu laden. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem Tröpfchen und der geladenen Oberfläche der Einwegspitze kann es jedoch schwierig werden, das Tröpfchen auf der hydrophoben Oberfläche der Betätigungsplatte immobilisieren zu lassen. Dadurch kann das Tröpfchen nach der Außenfläche der Spitze nach oben schießen, anstatt auf der Platte zu verbleiben. Um dies zu vermeiden, muss die Mikropipette in einer aufrechten Position, senkrecht zur Spanoberfläche gehalten werden, ohne sie zu berühren, dann kann das Tröpfchen auf das Ladepad abgegeben werden, indem es mit der Oberfläche in Berührung gebracht wird. Wenn das Tröpfchen an der Pipettenspitze klebt, geben Sie es an die Lagerlösung zurück, tauschen Sie die Spitze aus und legen Sie ein frisches Tröpfchen wieder auf. In einer Weiterentwicklung des aktuellen Proof-of-Concept-Systems kann eine automatische Lieferung von Tröpfchen ins Auge gefasst werden.
Ein weiterer kritischer Schritt, bevor der Test ausgeführt wird, ist das Schließen des Deckels der parallelen Plattenbaugruppe. Wie bereits im Protokoll erwähnt, muss der Deckel auf die Betätigungsplatte geschoben werden. Die hydrophobe Oberfläche des Deckels verhindert die Verzerrung und Verschiebung der Tröpfchen, die auf der Betätigungsplatte sitzen. Um die reibungslose Bewegung des Tröpfchens zu gewährleisten, wird dringend empfohlen, eine makellose Betätigungsplatte, die korrekte Beladung der Tröpfchen und die Spanmontage zu verwenden. Wiederverwendbarkeit der Betätigungsplatten ist möglich; Die Anzahl der Zyklen hängt jedoch von den Betätigungsspannungen (Abbildung 3) und der Analyt-/Reagenzablagerung auf der Oberfläche ab, auch biofouling genannt. Die vorgestellte Plattform nutzte chrombedruckten EWOD-Chip, der bei einer Betriebsspannung von 120 V bis zu viermal bei Betriebsspannung von 120 V und der Zwischenplattenreinigung nach jedem Experiment zuverlässig wiederverwendet werden konnte. Die Platten wurden recycelt, um die Kosten pro Experiment zu reduzieren, indem die biofoulierte amorphe Fluorpolymere (Materialtabelle) die biofoulierte amorphe Fluorpolymere(Materialtabelle)dekontaminieren (die Oberfläche mit unverdünntem Reinigungsmittel vor gründlicher Spülung reinigen) und eine frische auf der Platte verfälschten. Das Recycling von Betätigungsplatten erfordert jedoch eine manuelle Handhabung, kostspielige Reagenzien (amorphe Fluorpolymere (Materialtabelle))und spezielle Ausrüstungen (Spincoater). Alternative EWOD-Chips werden erfolgreich mit kostengünstigen Substraten wie Papier19, Acetatfolien oder Leiterplatten (PCB)20,21untersucht. Solche Einweg-Verbrauchsmaterialien können eine zuverlässige und erschwingliche Nutzung der DMF-Plattform ermöglichen und Mittel bereitstellen, um das Biofouling-Problem zu umgehen.
Biofouling ist die Hauptbeschränkung von EWOD für biologische Anwendungen22,23. Frühere Studien über DMF haben zwei Mechanismen identifiziert, die zur Biofouling beitragen, nämlich passive Adsorption aufgrund hydrophober Wechselwirkungen und eine elektrostatisch getriebene Adsorption, die sich manifestiert, wenn ein elektrisches Feld angewendet wird24. Die Ergebnisse im aktuellen Artikel stimmen mit dieser Theorie überein, da dokumentiert wurde, dass die Wiederverwendbarkeit der Betätigungsplatte bei hohen Betätigungsspannungen abnimmt. Eine mögliche Erklärung ist, dass Proteine leicht auf Fluorpolymer-beschichteten (Teflon-ähnlichen) Oberflächen adsorbieren und sich schneller auf gefoult im Vergleich zu unberührten Oberflächen aggregieren24. Infolgedessen sind proteinbezogene Assays auf DMF schwer zu quantifizieren und können einen Verlust an Analyt, Kreuzkontamination und verminderter Präzision erfahren17. Das Worst-Case-Szenario ist, wenn eine kritische Menge an Proteinadsorbs das Gerät nutzlos macht. Um das Biofouling zu minimieren, wurden verschiedene Ansätze untersucht, von der Minimierung der Verweilzeit des Tröpfchens auf dem Chip über die Beschichtungen23bis hin zu Additiven (d.h. Tensiden oder Pluronsäure) in die mit Biomaterial beladenen Tröpfchen6,22. Daher ist ein wichtiger Aspekt des Immunoassay-Assays auf EWOD die Wahl von Anti-Biofouling-Strategien, die mit dem jeweiligen Protokoll kompatibel sind.
Die automatisierte DMF-Plattform wurde entwickelt, um einen einzelnen Sandwich-ELISA-Test pro Lauf durchzuführen und dabei Mikroliter-Volumen sowohl für Reagenzien als auch für Analyt zu verwenden. Bei Bedarf gibt es herkömmliche Sandwich-ELISA-Kits auf Basis vorbeschichteter 96-Well- oder 384-Well-Platten, die in Kombination mit Zusätzlichenlaborgeräten zu einem höheren Durchsatz pro Durchlauf führen; Nur auf der Grundlage des Reagenzienpreises betragen die ungefähren Kosten pro Test/Bohrung 6.04 USD (580 USD/96) bzw. 0.33 USD (2x580 USD/384). Damit sind die herkömmlichen ELISA-Methoden ideal für eine große Anzahl von Proben, die typischerweise von geschultem fachkund-at-Personal in zentralen Laboreinrichtungen verarbeitet werden. An abgelegenen Orten ergab die detaillierte Kostenanalyse von ELISA für die Umweltüberwachung jedoch, dass bei der Aufnahme der Kapitalkosten (d. h. Der Betriebskosten des Labors, der wiederkehrenden Kosten, des Probentransports, des Verbrauchs und des Personals) der tatsächliche Preis pro ELISA 60 USD betrug, wovon 34 USD für Lieferungen pro Stichprobe25waren. Im Gegensatz dazu ist die vorgeschlagene DMF-Plattform tragbar, erfordert eine minimale Schulung für den Betrieb und kann mit vorbeschichteten Perlen in wenigen Minuten eine Proben-zu-Antwort-Analyse liefern. So kann die vorgestellte Technologie an bedarfsorientierten Standorten eingesetzt werden und Analysen ergänzen, die sonst in zentralen Labors verfügbar sind.
Im repräsentativen Ergebnisbereich wurde die automatisierte DMF-Immunoassay-Plattform zum direkten Nachweis von Krankheitserregern zur Abwehranwendung eingesetzt. Andere mögliche Anwendungen für die DMF-Plattform umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, biodiagnostic, kontinuierliche Überwachung und automatisierte Probenahme. Potenziell könnte sich das DMF auf verschiedene Sektoren auswirken, von der Versorgung mit Gesundheitsanwendungen für personalisierte Gesundheitsversorgung über die kontrollierte Umweltüberwachung zum Schutz von Patienten vor der in der Luft befindlichen Hospital Acquired Infection bis hin zum Pflanzenüberwachungssystem für die Landwirtschaft und Lebensmittelproduktion.

Die vorgeschlagene Methode zielt darauf ab, die automatisierte Probenvorbereitung für ELISA mit quantitativer Detektion von Antigenen mit EWOD-basiertem Ansatz mit digitaler Mikrofluidik (DMF) und magnetophoretischer Trennung zu erleichtern. Es wurde für mehrere biologische Anwendungen nachgewiesen, dass DMF in Kombination mit Magnetophorese eine interessante Alternative zu Flüssigkeitshandhabungsanwendungen ist1. Genauer gesagt ist der Nachweis von Krankheitserregern in vielen Sektoren ein impliziter Aspekt, von der Gesundheitsversorgung2 über die Landwirtschaft bis hin zur Umwelt3,4 bis zur nationalen Sicherheit5. Eine Detektionstechnologie, die in der Lage ist, die Bedrohungen durch Krankheitserreger zu beheben, muss einen hohen Durchsatz (z. B. kurze Testzeit), Effizienz (niedrige Nachweisgrenze – LoD – und hohe Empfindlichkeit) und Spezifität (auf den Zielpathogentyp) aufweisen, damit sie funktionsfähig ist6.
Zuvor wurde Das EWOD-basierte DMF erfolgreich für Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), den Nachweis eines antibiotikaresistenten Erregers (Methicillin-resistente Staphylococcus aureaus oder MRSA), M.pneumonia und C.albicans mit einem Low-Budget-, Printed-Circuit-Board-Chip und Magnetophorese7implementiert. Die Technik wurde auch für den Nachweis von Desoxyribonukleinsäure (DNA) Mutationen durch Pyrosequencierung und chemilumineszierenden Nachweisangewendet 8. EWOD-basierte Plattformen erweitern ihre Funktionalität auch auf Immunoassay-Anwendungen und ermöglichen so die gleichzeitige Probenwiederherstellung und -erkennung innerhalb einer einzigen, integrierten Plattform. So wurde beispielsweise ein einziges EWOD-Chip-Design mit einer DMF-Plattform für Point-of-Care-Tests sowohl für perlenbasierte Immunoassays von Herztroponin I aus einer Vollblutprobe als auch als separates Experiment RT-PCR für MRSA-Erkennung2erfolgreich demonstriert. Dieser Chip verwendet Ölfüller, der die Verdunstung der Tröpfchen verhindert und die zuverlässige automatisierte Manipulation von Nanoliter-Volumen erleichtert. Vielseitige Bioanwendungen wurden mit der Implementierung ähnlicher DMF-Ansätze untersucht, die quantitative homogene und heterogene Immunoassays9,10 einschließlich Der Entwicklung von Experimenten (DoE) für die Assay-Parameteroptimierung11abdecken.
Trotz ihrer offensichtlichen Vorteile, die Intensivierung aufgrund von winzigen Arbeitsvolumina zu verarbeiten, kann eine ölgefüllte DMF-Plattform eine Herausforderung darstellen und erfordert ein gewisses Maß an Know-how, um zu arbeiten. Ölgefüllte Systeme, da sie versiegelte Komponenten benötigen, sind nicht ideal für bestimmte Anwendungen vor Ort, bei denen die Transportfähigkeit des Systems wichtig ist. Darüber hinaus wäre ein ölbasiertes System sehr schwierig, wenn nicht gar unmöglich, für bestimmte Anwendungen zu verwenden, wobei die Trockenmaterialsammlung auf einer Oberfläche, wie von Zhao und Cho12vorgeschlagen, Jönsson-Niedziéka et al.13und Foat et al.14. Im Gegensatz dazu sind ölfreie Systeme einfach zu integrieren und haben den Vorteil, dass sie eine einfache Chip-zu-Chip-Probenübersetzung bieten. Aus diesen Gründen wurde die vorgeschlagene Methode entwickelt, um einen EWOD-basierten Immunoassay auf DMF bereitzustellen, der kein Öl erfordert, was den Betrieb des Geräts effektiv vereinfacht.
In diesem Beitrag berichten wir über die Verwendung einer maßgeschneiderten, freistehenden, vollautomatischen DMF-Plattform für Immunoassays und erarbeiten das Protokoll für den schnellen Nachweis von Biomolekülen, nämlich: Proteine, vegetative Bakterien, bakterielle Sporen und Viren. Die Kombination von EWOD-Chip mit magnetischen Partikeln zur automatisierten Probenvorbereitung und Immunpräzipitation wurde bereits mit einer zusätzlichen Off-Line-MS-Messung15demonstriert. Kürzlich wurde die In-Field-Diagnostik gegen Masern und Röteln IgG in der abgelegenen Bevölkerung Kenias durch die Wheeler-Gruppe16nachgewiesen. Sowohl Wheeler es als auch unser System sind transportabel, in sich geschlossen, vollautomatisiert mit mitgelieferten On-Chip-, Echtzeit-Chemilumineszenzmessungen gehören wohl zu den fortschrittlichsten DMF-Biodetektionssystemen.
Die beiden Systeme wurden für sehr unterschiedliche Anwendungen entwickelt. Wheelers System zielt auf Biomarker ab, um biomedizinische Diagnostik an Patienten zu ermöglichen, während unser Biodetektionssystem auf verteidigungsbasierter Anforderung für den direkten Nachweis von Zuvor aus der Luft beprobten Krankheitserregern basiert. Die Ähnlichkeit zwischen beiden ist das zugrunde liegende Prinzip der Tröpfchenbetätigung, das das breite Spektrum lebensbeeinflussender Sektoren zeigt, die die EWOD-basierte Technologie beeinflussen kann. Nämlich könnten die DMF-basierte Erkennungsplattform und das zugehörige EWOD-System wichtige Auswirkungen auf die Gesundheit (biomedizinische Diagnostik) finden; militärischer und ziviler Schutz (Bedrohungserkennung); Agrartechnologie (Pflanzenüberwachung) und Arbeitssicherheit (kontrollierte Umweltüberwachung)
Die Leistung unserer DMF-Plattform wird anhand des vollautomatischen Nachweises von humanem Serumalbumin (HSA, einem Kugelprotein), Escherichia coli (E. coli, einem vegetativen Bakterium), Bacillus atrophaeus (BG, einer bakteriellen Sporen) und MS2 (ein Bakteriophagenvirus) bewertet. Noch wichtiger ist, dass die vorgeschlagene DMF-Methode in dem Sinne äußerst vielseitig ist, dass die Capture-Antikörper ausgetauscht werden könnten, um den Nachweis anderer Antigene zu erreichen, die sich von den vier in diesem Artikel berücksichtigten unterscheiden. Die DMF-Plattform könnte eine mögliche Anwendung aufbauen, die auf aptamer Biosensing basiert, bei der die Magnetperlen spezifische Aptamer zur Erfassung und/oder Detektion von Nukleotiden tragen. Die Konstruktion und Realisierung der verschiedenen Komponenten, die die integrierte, vollständig in sich geschlossene DMF-Plattform bilden, einschließlich des Hochspannungs-Wellenformgenerators und der Antriebselektronik, wird an anderer Stelle offenbart6.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Serum Albumin [15C7]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab24438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B. atrophaeus (BG) spores</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rb anti-BG polyclonal</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker Casein</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TFS 37582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNC Dicing/Cutting Saw</td>
			<td>MTI Corp, USA</td>
			<td>SYJ-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop</td>
			<td>AGC, Japan</td>
			<td>CTL-809M</td>
			<td>Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli MRE 162</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-MS2 polyclonal</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu photodiode</td>
			<td>Hamamatsu, Japan</td>
			<td>S9270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hidrochloric acid (32%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W530574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask manufacturing service</td>
			<td>Compugraphics, Scotland, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS2 virus</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parylene-C, DPX-C</td>
			<td>Specialty Coating System, USA</td>
			<td>CAS No.: 28804-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88828</td>
			<td>Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb anti-BG polyclonal</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal</td>
			<td>Dstl, UK</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab201876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCS Parylene Deposition System</td>
			<td>Specialty Coating System, USA</td>
			<td>2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer, 4&#39;&#39;, p-type, &#60;100&#62;, 1&#8211;10 &#937;cm</td>
			<td>Pi Kem Ltd</td>
			<td>N/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Coater</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37075</td>
			<td>It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 80</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28328</td>
			<td>The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrowetting-based digital microfluidics platform for automated enzyme-linked immunosorbent assay

Elektrobenetzung ist der Effekt, durch den der Kontaktwinkel eines Tröpfchens, das einer Oberflächenladung ausgesetzt ist, verändert wird. Elektrowetten-on-dielectric (EWOD) nutzt die dielektrischen Eigenschaften von dünnisolatorfolien, um die Ladungsdichte zu erhöhen und damit den Elektronässeing-Effekt zu steigern. Das Vorhandensein von Ladungen führt zu einer elektrisch induzierten Ausbreitung des Tröpfchens, die eine gezielte Manipulation über eine hydrophobe Oberfläche ermöglicht. Hier zeigen wir das EWOD-basierte Protokoll zur Probenverarbeitung und -detektion von vier Kategorien von Antigenen unter Verwendung einer automatisierten Oberflächenbetätigungsplattform über zwei Varianten einer Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Methode. Der ELISA wird an magnetischen Perlen mit immobilisierten Primärantikörpern durchgeführt, die ausgewählt werden können, um auf ein bestimmtes Antigen zu zielen. Ein mit HRP konjugierter Antikörper bindet an das Antigen und wird zur Quantifizierung der erfassten Krankheitserreger mit H2O2/Luminol vermischt. Es wurden Test-Abschlusszeiten zwischen 6 und 10 min erreicht, während winzige Mengen an Reagenzien verwendet wurden.

Der Aufprall auf die Betätigungsspannung wurde untersucht, um aufzuklären, welche optimalen Bedingungen für die Durchführung der Assays waren. Ein Tröpfchen aus dem Puffer wurde bei verschiedenen Betätigungsspannungen angetrieben und seine Bewegung aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigten (Abbildung 3) eine Korrelation zwischen der mittleren quadratischen Betätigungsspannung (Vrms) und der durchschnittlichen Geschwindigkeit. Die Langlebigkeit einer Betätigungsplatte wurde jedoch verringert, wenn hohe Werte für Vrms verwendet wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde 105 V rms als Standard-Betätigungsspannung gewählt, 120 Vrms wurden für den H2 O2/Luminol Tröpfchen am besten gefunden und 165 Vrms wurde für die Extraktion LUO implementiert. Diese Spannungen wurden in die automatisierte Programmiersequenz (Zusatzdatei 1) aufgenommen.
Zwei Immunoassays (Abbildung 4) wurden erfolgreich mit dem EWOD-Chip mit der DMF-Plattform für vier verschiedene Krankheitserreger getestet (Tabelle 1). Der EWOD-Chip erleichterte die aufeinanderfolgende Bewegung der Tröpfchen von den Ladepads in den Mischbereich und schließlich in den Abfall. Es gab zwei grundlegende LUOs, die während des gesamten Protokolls wiederholt wurden, um ELISA abzuschließen. Die erste war die Extraktion LUO; Kurz beschrieben wurde das Tröpfchen mit den Schwebeperlen zur Trennstelle in der Mitte der Mischzone getrieben, der Magnet wurde automatisch aktiviert, um sich dem Chip zu nähern und die Magnetperlen in einem Pellet zu bündeln (Abbildung 5). Als nächstes wurde das Tröpfchen in Richtung Abfallpolster bewegt, so dass die Perlen auf der Betätigungsplatte gelassen wurden, wodurch die ExtraktionluO abgeschlossen wurde. Das Mischen war der nächste Schlüssel LUO auf dem EWOD-Chip. Die Analytprobe mit einer unbekannten Konzentration von Krankheitserregern wurde durch Elektronässen auf die Perlen verschoben. Dann wurden die Perlen resuspendiert, indem das Tröpfchen mit den verklumpten Perlen über den Mischbereich bewegt wurde (insgesamt 10 Pads). Diese beiden LUOs waren wesentlich, da sie eine miniaturisierte, schnelle und reproduzierbare Probenverarbeitung mit konsekutivem Nachweis der Erreger in 6 bis 10 min ermöglichten. Abbildung 6 zeigt die komplette Sequenz von LUOs aus einem Immunoassay, der mit dem EWOD-Chip durchgeführt wurde.
Um den gewünschten Automatisierungsgrad zu erreichen, konnten Variationen im Protokoll eingeführt werden. Zum Beispiel wurden die Perlen vom Antigen-Tropfen getrennt, der dann auf das Abfallpolster übertragen wurde, was die grundlegende Extraktion LUO wiederholte. In diesem Stadium könnte sich das Protokoll verzweigen, je nachdem, ob der Nachweisantikörper bereits mit dem HRP konjugiert wurde, und effektiv insgesamt acht LUOs für den Nachweis der verschiedenen Antigene verwenden (Abbildung 7A-C). In diesen Fällen wurde das Tröpfchen mit dem Detektionsantikörper in die Perlen gebracht und dann durch Betätigung vermischt. Alternativ kann die Bindung des Detektionsantikörpers an das Neutravidin-HRP-Konjugat sequenziell vor Ort am EWOD-Chip durchgeführt werden, wie es für die Quantifizierung von E. coli nachgewiesen wurde (Abbildung 7D). Beide Protokolle, der acht- und zehnstufige ELISA (Abbildung 4), ergaben reproduzierbare Detektion von Antigenen.
Inkubationszeiten und Konjugatkonzentrationen wurden variiert, um experimentell die optimalen Bedingungen für den Test zu finden (Abbildung 7A). Es wurde festgestellt, dass die Inkubationszeit von 160 s und die Konjugatkonzentration von 2 g/ml das beste Signal-Rausch-Verhältnis mit einer 36%igen Erhöhung der Signalstärke und praktisch keiner Änderung der Hintergrundgeräuschpegel erreichten. Alle im Abschnitt repräsentative Ergebnisse verwendeten Zahlen und Daten wurden von einer früherenArbeit6 geändert.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Primärer / Capture-Antikörper</td>
			<td>Nachweis-Antikörper</td>
			<td>Antigen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Human Serum Albumin [15C7] (Anti-HSA, Abcam ab10241)</td>
			<td>Pferd Radish Peroxidase (HRP) getaggt Anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438)</td>
			<td>Human Serum Albumin (HSA, Abcam)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rb anti-BG polyklonal</td>
			<td>Biotinylierte summierte Rb-Anti-BG-Polyklonal</td>
			<td>Sporen von B. globigii (BG)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rb anti-E.coli MRE 162 polyklonal</td>
			<td>Biotinylierte S.-E.coli-162-MRE-Polyklonal</td>
			<td>E. coli MRE 162</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ziege anti-MS2 polyklonal</td>
			<td>Biotinylierte summierte Rb-Anti-MS2-Polyklonal</td>
			<td>MS2-Bakteriophagenvirus</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Antigene und Antikörper, die mit diesem Protokoll getestet wurden. Vier Arten von Pathogenantigenen wurden verwendet, um die Fähigkeiten des EWOD-Chips mit der DMF-Plattform zu demonstrieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig1a.jpg"> Abbildung 1: Design der EWOD-Platte. (a) Schematische Notation der EWOD-Betätigungsplatte mit Anschlüssen (Quadrate, Oben), die (Linien) mit den Elektroden (Quadrate, Unten) verbunden sind. Jedem Pad wird eine Nummer zugewiesen und kann über den Softwarecode (Zusatzdatei 1) adressiert werden. Die Ladeelektrodenpads sind durch Pfeile gekennzeichnet und durch einen Großbuchstaben über oder unter jedem Pad gekennzeichnet. Ein wesentliches Merkmal der DMF-Plattform ist die Mischzone aus zehn Pads (Nr. 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Als visuelle Anleitung ist die Mischzone mit einem roten Rechteck markiert. (b) Mikrograph des Microgrid-Designs der Pads. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig2.jpg"> Abbildung 2: Komponenten und Schlüsselstufen für die DMF-Baugruppe (Digital Microfluidic System). (A) Befestigen Sie die EWOD-Betätigungsplatte, legen Sie den Shim auf die rotierende Stufe und laden Sie die Tröpfchen. (B) Positionieren Sie die Abdeckplatte. (C) Montieren Sie das Magnetgehäuse, befestigen Sie die Riegel und drehen Sie die Bühne um 180°. (D) Der automatisierte Magnet zeigt nach unten. Prüfen Sie die Position und Form der Tröpfchen, überprüfen Sie, ob die Leiterplattenstifte (PCB) an den Kontakten auf dem EWOD-Chip ausgerichtet sind, schließen Sie den Photodetektor an und legen Sie ihn in den Fotodetektorsteckplatz. Nach dem Anschluss der Steuerelektronik an einen Computer ist das System bereit, den Test auszuführen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig2alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig3large.jpg"> Abbildung 3: Wiederholte Verwendung der Betätigungsplatten und Auswirkungen auf die Betätigungsspannung. Die durchschnittliche Geschwindigkeit eines Tröpfchens aus dem Laufpuffer wird in Abhängigkeit von der Betätigungsspannung (blaue Kreise) und der Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen (N = 3) dargestellt. Hier zeigt die Anzahl der Assays pro Platte (graue Balken) einen verstärkten Zerfall der Oberfläche bei höheren Spannungen an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig4a.jpg"> Abbildung 4: Diagramm der mit EWOD getesteten Immunoassays. Jeder Kreis in diesem Diagramm stellt ein Volumen von 2,5 l dar, das auf den EWOD-Chip geladen wird. Das erste Protokoll (auf der linken Seite) zeigt acht LUOs mit vorgemischtem Antikörper-HRP-Konjugat; Während das zweite Protokoll zehn LUOs umfasst, die separat den biotinylierten Detektionsantikörper, die Perlenextraktion und die konsekutive Bindung des Neutravidin-HRP-Konjugats hinzufügen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig5.jpg"> Abbildung 5: Magnetperlenextraktion. Dieser Prozess wird in (a-c) die Betätigung des Tröpfchens mit den abgehängten Magnetperlen an die magnetische Trennstelle in der Mitte der Mischzone (Pad Nr. 33) unterteilt, (d, e) der Magnet bewegt sich in Position, die die Perlen fokussiert, (f, g, h) Perlen werden durch die magnetische Kraft an Ort und Stelle gehalten, während das Tröpfchen von EWOD in Richtung Abfallpad (Pad Nr. 41) abgeschwächt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig5alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig6.jpg"> Abbildung 6: Vollständige Immunoassay-Sequenz mit EWOD, die die Reagenzien, die Probenbelastung und den Betrieb der Laboreinheit zeigt. Jede Zeile enthält eine Sequenz von Beispielbildern aus den charakteristischen Operationen auf einem Tröpfchen. Die Vorgänge sind in Spalten unterteilt. Das Mischen wird nicht für die Perlen in Suspension durchgeführt, präsentiert durch eine schwarze gebrochene Linie. Tröpfchenrichtungen werden durch blaue Pfeile angezeigt, die Perlen werden in einem der Bilder durch einen orangefarbenen Pfeil hervorgehoben. Das graue Feld (untere rechte Ecke) trennt die beiden Bilder, die Bewegung und Position im Erfassungsbereich darstellen, der bruchförmige Kreis hebt den Erfassungsbereich hervor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig6alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60489/60489fig7a.jpg"> Abbildung 7: Kalibrierkurven aus Immunoassays, die auf EWOD-Chip mit der DMF-Plattform durchgeführt werden. Wie bereits berichtet6 werden die Ausgangsspannungen (mV) im Vergleich zu Konzentrationen angezeigt für: (A) Humanes Serumalbumin, die verwendet wird, um die Wirkung der Konjugat-Antikörperkonzentration [C] und der Inkubationszeit zu untersuchen, tinc, gemessen von der Vermischung der Perlen mit bekanntem Analyt bis zur Extraktion LUO, (B) B. atrophaeus (BG) Sporen, die die Reproduzierbarkeit des Immunoassays zeigen, (C) MS2-Bakteriophage-Immunoassay und (D) E. coli. Abkürzungen: koloniebildende Einheiten (cfu), Plaque-bildende Einheiten (pfu), Anzahl unabhängiger Experimente (N), Laboreinheitsbetrieb (LUO). Abbildung geändert aus vorheriger Veröffentlichung6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/60489fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Vollständige Sequenz zum Ausführen der DMF-Plattform für den automatisierten ELISA-Test mit Neutravidin-HRP als Konjugat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/APPENDIX_A.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Die GUI für die Chemilumineszenzmessung und ein Beispiel aus einer Messung mit der Software werden angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60489/APPENDIX_B.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Elektrowetting-basierte digitale Mikrofluidic ist eine Technik, die eine spannungsgetriebene Änderung des scheinbaren Kontaktwinkels eines Mikroliter-Volumentröpfchens nutzt, um seine Manipulation zu erleichtern. Die Kombination mit funktionalisierten Magnetperlen ermöglicht die Integration mehrerer Laboreinheiten zur Probenvorbereitung und Identifizierung von Krankheitserregern mittels Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Elektrowetting-basierte Digital Microfluidics Plattform für automatisierte enzymgebundene Immunsorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Durch die Automatisierung der Aktivierung einzelner Tröpfchen können komplexe Sequenzen eines Laborgerätebetriebs in einen Chip gebracht werden. Unsere digitale mikrofluidische Plattform befasst sich mit der schnellen spezifischen Entdeckung von Viruserregern im Feld. Diese Methode basiert auf dem quantitativen Nachweis spezifischer Antigene mit EWOD-basierter digitaler Mikrofluidik in Kombination mit magnetischer Immunpräzipitation.In diesem Beitrag wird das Verfahren anhand von Proben bewertet, die verschiedene Konzentrationen von Bakterien, Sporen, Viren und Proteinen enthalten. Dieser Prozess ist vollautomatisiert, sequenziell, skalierbar und vielseitig. Die Reihenfolge und das Tröpfchenvolumen können an die Anforderungen eines bestimmten Protokolls angepasst werden.Die digitale Mikrofluidik-Plattform, die die Antikörper-basierte Sensorik vollständig ausblenden kann, könnte zu einer potenziellen Anwendung aufbauen, die auf aptamer Biosensing basiert, bei der die magnetischen Perlen spezifische Aptamer zur Erfassung und Detektion von Nukleotidsequenzen tragen. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, ist es wichtig, die Art des Tensids zu berücksichtigen und zu berücksichtigen, wie es mit Ihrer Wahl der Biochemie und der hydrophoben Polymerbeschichtung interagiert. Beginnen Sie, indem Sie den Magneten aus der digitalen Mikrofluidik oder DMF-Plattform entfernen und auf der Bank platzieren.Legen Sie eine saubere Betätigungsplatte auf die rotierende Bühne mit dem Nachoben zeigenden Chrom, wobei die Platte mit der oberen linken Ecke der Einbaustufe ausgerichtet wird. Klemmen Sie die Betätigungsplatte von oben mit der Platte mit den 47 Kontaktstiften, die die Platte an Ort und Stelle befestigen und die Ausrichtung mit den Kontaktstiften erleichtern. Dann den 0,5-Millimeter-Shim und den Zwei-Millimeter-PMMA-Abscheider auf die rotierende Stufe aufschreiben, um einen kontrollierten Spalt zwischen betätigungs- und Abdeckplatten zu schaffen.Um die Tröpfchen auf die vorgeschlagenen Ladepads zu laden, werden vier 2,5-Mikroliter-Tröpfchen aus dem Laufpuffer mit einem Tröpfchen pro Pad auf die B-, A-, R- und E-Belegpads geladen. Dann aliquot 2,5 Mikroliter Luminol Wasserstoffperoxid-Lösung auf dem E bezeichnet Pad. Als nächstes, aliquot 2,5 Mikroliter Neutravidin konjugiert zu HRP biotinylierten sekundären Antikörper und Mikroperlen auf die F, G, und ich bezeichnet Pads jeweils.Schließlich aliquot 2,5 Mikroliter der unbekannten Probe auf dem C bezeichnet pad. Legen Sie die Abdeckplatte auf die Oberfläche des Rigs neben dem runden Ausnehmbereich und schieben Sie sie seitlich in die Aussparung und auf die Betätigungsplatte. Setzen Sie den Permanentmagneten auf die Abdeckplatte und sichern Sie ihn, indem Sie die beiden Riegel schieben, drehen Sie dann die Bühne um 180 Grad und prüfen Sie sie visuell, um sicherzustellen, dass die geladenen Tröpfchen noch an Ort und Stelle sind.Überprüfen Sie, ob die Ladeposition für jedes Tröpfchen mit der programmierten Betätigungssequenz in der Software übereinstimmt. Positionieren Sie die abgeschirmte Fotodetektordose in den Schlitz der rotierenden Stufe und schließen Sie das Kabel an. Legen Sie den Deckel über die DMF-Plattform und starten Sie die Programmsequenz über die Softwareschnittstelle.Die Tröpfchenposition wird über kapazitive Erfassung aufgezeichnet und kann dann auf der Benutzeroberfläche beobachtet werden. Die Programmsequenz fordert Meldungen auf, die an der Schnittstelle angezeigt werden, um den Bediener darüber zu informieren, dass das Luminol-Tröpfchen bereit ist, die extrahierten Magnetperlen zu sammeln, oder dass das Detektionströpfchen bereit ist, an die Erkennungsstelle verschoben zu werden. In beiden Fällen ist eine Bestätigung des Betreibers erforderlich, um fortzufahren.Die Lichtintensität, die durch die chemilumineszierende Reaktion erzeugt wird, wird vom Photodetektor gelesen und in Echtzeit aufgezeichnet. Um im visuellen Modus zur Optimierung von Protokollen zu arbeiten, starten Sie die Programmsequenz über die Softwareschnittstelle. Die automatisierte Tröpfchenbetätigung kann auf dem Chip für jeden der kritischen Assay-Schritte visualisiert werden, wie magnetische Extraktion der Perlen, Perlen-Resuspension und Mischen.Wenn Sie dazu aufgefordert werden, montieren Sie die abgeschirmte Fotodetektordose in den Schlitz der rotierenden Stufe. Schließen Sie das Kabel des Photodetektors siebbar an, indem Sie die Stifte in die Buchse einlegen. Legen Sie den Deckel über die DMF-Plattform und setzen Sie den Test fort.Tröpfchen werden mittels kapazitiver Sensorik überwacht und können auf der Benutzeroberfläche beobachtet werden. Um das Gerät zu reinigen, öffnen Sie den DMF-Plattformdeckel und drehen Sie die Bühne um 180 Grad. Entpacken Sie das Magnetgehäuse und entfernen Sie den Magneten aus der rotierenden Stufe.Entfernen Sie den Siliziumwafer mit einer Pinzette aus dem Schlupf und spülen Sie ihn mit destilliertem Wasser ab. Dann trocknen Sie es mit Druckluft und legen Sie es in eine Petrischale, wo der Wafer gelagert und wiederverwendet werden kann. Verwenden Sie eine Mikropipette, um den flüssigen Abfall aus dem Pad zu entfernen, ohne die Oberfläche zu berühren, und reinigen Sie die Oberfläche, indem Sie die Flüssigkeit mit saugfähigem Papier von der Betätigungsplatte ableiten.Um den Aufprall auf die Betätigungsspannung zu untersuchen, wurde ein Tröpfchen aus dem Puffer mit verschiedenen Betätigungsspannungen angetrieben und seine Bewegung aufgezeichnet. Es wurde eine Korrelation zwischen Vrms und der durchschnittlichen Geschwindigkeit nachgewiesen und nach einem bestimmten Vrms-Wert ein Geschwindigkeitsplateau beobachtet. Die Langlebigkeit der Betätigungsplatte wurde bei Verwendung hoher Werte für Vrms verringert.Für den Betrieb der Extraktionslaboreinheit wurde das Tröpfchen mit den Schwebeperlen zur Trennstelle in der Mitte der Mischzone getrieben. Dann wurde der Magnet automatisch aktiviert, um sich dem Chip zu nähern und die Perlen zu fokussieren. Als nächstes wurde das Tröpfchen in Richtung Abfallpolster bewegt, so dass die Perlen.Die Extraktions- und Mischlaborgeräte am EWOD-Chip ermöglichten eine miniaturisierte schnelle und reproduzierbare Probenverarbeitung mit konsekutivem Nachweis der Krankheitserreger in 6 bis 10 Minuten. Inkubationszeiten und Konjugatkonzentrationen wurden variiert, um die optimalen Bedingungen für den Assay zu finden. Es wurde festgestellt, dass die Inkubationszeit von 160 Sekunden und die Konjugatkonzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter das beste Signal-Rausch-Verhältnis erreichten.Variationen im Protokoll können eingeführt werden, um die gewünschte Automatisierungsniveaus zu erreichen. Der achtstufige ELISA wurde verwendet, um verschiedene Antigene wie Bacillus atrophaeus sporen und das MS2 Bakteriophage zu erkennen. In der Zwischenzeit wurde das 10-Stufige Protokoll verwendet, um E.coli zu quantifizieren.Es ist wichtig, dass die angelegten Spannungen, die Konzentrationen von Analyten und Reagenzien für die Aktivierung der Tröpfchen und eine erfolgreiche magnetische Trennung auf dem Chip optimal sind. Um eine genaue Messung zu erreichen, sollte eine Perlenbindungskapazität berücksichtigt werden und es könnten serielle Verdünnungen der Analyten erforderlich sein. Durch den Austausch der Art des Antikörpers konnte man verschiedene Krankheitserreger als den im Ergebnisbereich gemeldeten erkennen.Das Verfahren könnte beispielsweise auch für die Biomarker-Erkennung oder point-of-Care-Diagnostik angewendet werden. Zusätzlich zu den bereits vorgestellten Anwendungen wurde das System unter Berücksichtigung des Vor-Ort-Nachweises von Luftregern entwickelt. DMF ist eine ideale Plattform für diese Anwendung, da das Tröpfchenvolumen mit der Ausgabe anderer Sampler übereinstimmt, die wir kürzlich entwickelt haben.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Forschung

Biotechnik

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT: eine automatisierte Plattform für Biomasse Enzym-Entdeckung und Cocktail-Optimierung

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Zellzusammendrücken als Robust, Mikrofluidik Intrazelluläre Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...