Name: electromechanical assessment of optogenetically modulated cardiomyocyte activity
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity at JoVE.com

Vi takker Stefanie Perez-Feliz for fremragende teknisk bistand, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Tyskland) for at levere pUC57-GtACR1 plasmid, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) for adenovirus produktion og Dr. Anastasia Khokhlova (Ural Federal University) for at dele sin ekspertise til at forbedre cellen isolation protokol og re-design pipette bending setup. Projektet blev finansieret af Den Tyske Forskningsfond (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether stipendium: SCHN1486/2-1) og ERC Advanced Grant CardioNECT.

<ol>
	<li>Harz, H., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin-regulated+calcium+currents+in+Chlamydomonas.">Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas.</a> Nature. 351, 489-491 (1991).</li><li>Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+electric+potential+in+the+phototaxis+of+the+alga+Haematococcus+pluvialis.">Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis.</a> Nature. 271, 476-478 (1978).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+A+Light-Gated+Proton+Channel+in+Green+Algae.">Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo.">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li><li>Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriorhodopsin:+a+light-driven+proton+pump+in+Halobacterium+Halobium.">Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium.</a> Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).</li><li>Schobert, B., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halorhodopsin+is+a+light-driven+chloride+pump.">Halorhodopsin is a light-driven chloride pump.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).</li><li>Inoue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-driven+sodium+ion+pump+in+marine+bacteria.">A light-driven sodium ion pump in marine bacteria.</a> Nature Communications. 4, 1678 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Light+Sensitivity+Optical+Neural+Silencer:+Development+and+Application+to+Optogenetic+Control+of+Non-Human+Primate+Cortex.">A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties,+substrate+specificity+and+optogenetic+potential+of+the+engineered+light-driven+sodium+pump+eKR2.">Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2.</a> Scientific Reports. 8, 9316 (2018).</li><li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel.">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li><li>Berndt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Guided+Transformation.">Structure-Guided Transformation.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li><li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+light-gated+anion+channels:+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics.">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li><li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins.">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103 (2017).</li><li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Neuronal+Silencing+in+Drosophila+during+Visual+Processing.">Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing.</a> Scientific Reports. 7, 13823 (2017).</li><li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics.">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530 (2016).</li><li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels.">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806 (2018).</li><li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes.">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanics+of+rat+cardiomyocytes+under+isometric,+unloaded,+and+physiologically+loaded+conditions.">Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).</li><li>Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials,+ion+channel+currents+and+transverse+tubule+density+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes+maintained+for+6+days+in+cell+culture.">Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).</li><li>Burton, R. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolae+in+Rabbit+Ventricular+Myocytes:+Distribution+and+Dynamic+Diminution+after+Cell+Isolation.">Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation.</a> Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Janssen, P. M., Hunter, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force,+not+sarcomere+length,+correlates+with+prolongation+of+isosarcometric+contraction.">Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction.</a> The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).</li><li>Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+force+decline+from+calcium+decline+by+preload+in+isolated+rabbit+myocardium.">Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).</li><li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca+2+-permeable+channelrhodopsin+CatCh.">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li><li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+light+to+fight+atrial+fibrillation.">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li><li>Bernal Sierra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channel-based+optogenetic+silencing.">Potassium channel-based optogenetic silencing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4611 (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9 (1), 3949 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Mens optogenetiske værktøjer muliggør modulering af ophidsende celleelektrofysiologi på en ikke-invasiv måde, har de brug for grundig karakterisering i forskellige celletyper (f.eks. CM), så man kan vælge det bedste tilgængelige værktøj til et specifikt eksperimentelt design. Plaster-clamp-teknikken er en standardmetode til vurdering af cellulær elektrofysiologi. I hele cellekonfigurationen gør det muligt at optage fotoaktiverede strømme på tværs af plasmamembranen eller tidsmæssige ændringer i membranspændingen efter lysstimulering/hæmning. Optogenetic manipulation af elektrisk excitation påvirker også CM sammentrækninger. Vi bruger sarcomere tracking og kulfiber-assisteret kraft målinger til at kvantificere virkningerne af optisk forhør på den mekaniske aktivitet af myocytter.
Vi beskriver en protokol til at karakterisere de grundlæggende virkninger af en lys-gated chlorid kanal, GtACR1, i CM. Som modelsystem valgte vi kanin-CM, da deres elektrofysiologiske egenskaber (f.eks. AP-form og ildfast periode) ligner dem, der observeres i humant CM, tættere end gnaver-CM. Desuden kan kanin CM dyrkes i flere dage, længe nok til adennoviral levering og udtryk for GtACR1-eGFP. Især isolerede CM ændre deres strukturelle egenskaber i kultur over tid, herunder afrunding af celleendelser og gradvis tab af cross-striation, T-rørformede system og caveolae23,24. I overensstemmelse med dette, funktionelle ændringer er blevet rapporteret i kulturbeherdet CM: depolarisering af hvilemembranen potentiale, forlængelse af AP og ændringer i cellulære Ca2 + håndtering. For gennemgang af cellulære tilpasninger i kultur, se Louch et al.25. Supplerende figur 2 viser eksemplariske AP- og sammentrækningsmålinger af friskisoleret CM til sammenligning med dem, der er observeret i dyrket CM (Figur 6, figur 7) ved hjælp af den fremlagte protokol her.
Patch-clamp-optagelser med hele celler muliggør direkte målinger af fotostrømsegenskaber (f.eks. amplituder og kinetik) og lysinducerede ændringer i membranpotentialet eller AP-egenskaber ved høj tidsmæssig opløsning. Men sådanne optagelser har flere begrænsninger: For det første erstattes cytosolen af pipetteopløsningen i helcelleoptagelser, hvilket er fordelagtigt at kontrollere ioniske elektrokemiske gradienter, men har den iboende ulempe ved at vaske cellulære organeller, proteiner og andre forbindelser, hvilket potentielt påvirker cellulære elektriske reaktioner. For det andet er bivirkninger som aktivering af yderligere ionkanaler som følge af ikke-fysiologisk lang depolarisering (f.eks. langsomme tidskonstanter af lyslukkede ionkanaler) vanskelige at vurdere, da vores metode kun gør det muligt at registrere ændringer i APD, men ikke at foretage direkte målinger af ioniske koncentrationer i elektrofysiologisk relevante cellerum. Dette kan gøres med fluorescerende indikatorer (f.eks Ca2+ sensorer) eller ionselektive elektroder. Yderligere karakterisering kan omfatte lysintensitettitreringer, bestemmelse af pH-afhængighed, fotostrømskinetik ved forskellige membranpotentialer og genfindingskinetik under gentagen lysstimulering.
I modsætning til patch-clamp optagelser, encellede kraft målinger muliggøre analyse af cellulære sammentrækninger af intakte myocytter uden at påvirke deres intracellulære miljø. Sekundære virkninger på ionkoncentrationer (f.eks.Ca. 2+) kan indirekte vurderes ved at bestemme genereret kraftamplitude og dynamik (f.eks. maksimal hastighed for sammentrækning og afslapning; her ikke analyseret). Kraftmålinger med kulfiberteknikken har en fordel i forhold til frit ordregivende celler, da de giver direkte oplysninger om passive og aktive kræfter i forudindlæste celler (dvs. under forhold, der er mere lig in situ- eller in vivo-indstillingerne). Mekanisk forladning er især vigtigt, når man analyserer cellulære kontraktilitet, som stretch påvirker kraft produktion og afslapning26,27.
Optogenetiske tilgange giver mulighed for spatiotemporally præcis manipulation af cellulære membran potentiale, både i enkelt CM og intakt hjertevæv. Klassisk er ChR2, en lysgated kation ikke-selektiv kanal, blevet anvendt til depolarisering af membranpotentialet, mens lysdrevne proton- og/eller kloridpumper blev anvendt til membranhyperpolarisering. Begge grupper af optogenetiske aktuatorer kræver høje udtryksniveauer, da ChR2 er kendetegnet ved en iboende lav single-channel ledningsevne28 og lysdrevne pumper transporterer maksimalt en ion pr. absorberet foton. Desuden kan langvarig aktivering af ChR2 i CM føre til Na+ og/ eller Ca2+ overbelastning, og lysdrevne pumper kan ændre trans-sarcolemmal H+ eller Cl- gradienter29,30. På jagt efter alternative værktøjer til optogenetisk kontrol af CM aktivitet, vi for nylig testet den naturlige anion channelrhodopsin GtACR1, karakteriseret ved en overlegen single-kanals ledningsevne og højere lysfølsomhed i forhold til kation ChR såsom ChR2. Vi fandt, at GtACR1 aktivering depolarizes CM og kan bruges til optisk pacing og hæmning, afhængigt af lyset puls timing og varighed. En yderligere fordel ved at bruge ACR i stedet for kation ChR kunne være den mere negative vending potentiale Cl- sammenlignet med Na+, reducere kunstigt indførte ionstrømme. Som vi tidligere har vist, optisk pacing med GtACR1 kan føre til AP forlængelse som følge af den langsomme komponent af GtACR1 kanal lukning, som kunne overvindes ved hjælp af hurtigere GtACR1 mutanter19. Men AP forlængelse er langt mindre udtalt, når du bruger en lavere, mere fysiologisk intracellulære Cl- koncentration (se figur 6). Desuden resulterer GtACR1-medieret hæmning ved langvarig belysning i dyb membrandepolarisering, som igen kunne aktivere sekundær Na+ og Ca2+ tilstrømning, hvorved aktiviteten af spændingslukkede kanaler ændres. I vores målinger finder vi, at AP og sammentrækningsparametre ne kommer sig til baseline inden for 40 s efter en let induceret hæmning i 1 min (se Kopton et al. 2018, figur 6, figur 7). Lysgatede K+ kanaler er et potent alternativ til lyddæmpning af CM uden at påvirke cm'ets hvilemembranpotentiale31.
I fremtiden vil vi gerne kvantitativt sammenligne forskellige optogenetiske værktøjer for deres potentiale til at hæmme hjerteaktivitet. Til dette formål tester vi en række lys-gated ion kanaler, herunder ACR, ChR2 og rød-flyttet ChR varianter32,samt hyperpolariserende aktuatorer såsom halorhodopsin eller lyset gated adenylyl cyclase bPAC i kombination med kalium kanalen SthK (PAC-K)31.
Den her præsenterede protokol kan bruges til dybdegående karakterisering af de elektromekaniske egenskaber af CM. Det gælder hovedsagelig også for CM fra andre arter, og for CM isoleret fra syge myocardium. Optisk stimulation giver en til tempo CM ved forskellige frekvenser, og forskellige preloads kan testes under kulfiber sammentrækning eksperimenter. Et interessant eksperiment ville være at bruge lav intensitet belysning til subthreshold depolarisering, at efterligne gradvis stigning i hvilemembranen potentiale, som kan observeres under udviklingen af hjertevæv remodeling under sygdomsprogression. Endelig kan funktionelle målinger kombineres med Ca2+ billeddannelse for yderligere indsigt i excitation-sammentrækningskobling eller med farmakologiske indgreb for at vurdere virkningerne af forskellige lægemidler på CM-aktivitet.

ChR-medieret fotostrømme blev først registreret i eyespot af encellede grønne alger1,2. Kort efter genetisk kloning og heterolog ekspression af Chlamydomonas reinhardtii ChR1 og ChR2, ChR blev brugt som redskaber til at ændre membranpotentiale i Xenopus oocytter og pattedyrceller ved lys3,4. Kation ikke-selektiv ChR depolarisere membranen af celler med en hvilende membran potentiale, der er negativ til tilbageførsel potentiale ChR. De kan således bruges til at fremkalde AP i ophidselige celler, herunder neuroner og CM, så optisk pacing5,6.
Som supplement til kation ChR, lysdrevet proton, chlorid og natrium pumper7,8,9 er blevet brugt til at hæmme neuronal aktivitet10,11,12. Sidstnævnte har dog begrænsninger, der kræver høje lysintensiteter og vedvarende belysning, da en ion transporteres pr. absorberet foton. I 2014 beskrev to uafhængige undersøgelser af Wietek et al. og Berndt et al. omdannelsen af kationledende ChR til ACR via mutationer i kanalen pore13,14. Et år senere, naturlige ACR blev opdaget i cryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Som manipuleret ACR viste resterende kation ledningsevne, blev de erstattet af naturlige ACR, karakteriseret ved en stor enkelt-kanals ledningsevne og høj lysfølsomhed15. GtACR blev anvendt til at lukke munden på neuronal aktivitet ved at polarisere membranpotentialet i retning af kloridstilbageførselspotentiale16,17. Govorunova et al. anvendt GtACR1 til kultiveret rotte ventrikulær CM og viste effektiv fotoinhibition ved lav lysintensitet niveauer, der ikke var tilstrækkelige til at aktivere tidligere tilgængelige hæmning værktøjer, såsom proton pumpe Arch18. Vores gruppe for nylig rapporteret, at GtACR1-medieret fotoinhibition af CM er baseret på depolarisering, og at GtACR1 også kan bruges, derfor til optisk pacing af CM19.
Her præsenterer vi en protokol til undersøgelse af de elektrofysiologiske og mekaniske virkninger af GtACR1 fotoaktivering på kultiveret kanin ventrikulær CM. Vi beskriver først celleisolation, dyrkning og transduktion. Elektrofysiologiske effekter måles ved hjælp af hele celle patch-clamp optagelser. Lysmedierede strømme ved en given membranspænding vurderes i V-clamp-tilstand. Membran potentielle dynamik måles, mens elektrisk eller optisk pacing CM (I-clamp mode). Optisk hæmning af elektrisk udløst AP testes ved hjælp af vedvarende lysapplikation. Mekaniske effekter måles ved hjælp af kulfibre i kombination med billedbaseret sporing af sarcomere længde. For at gøre dette, optisk paceable celler er mekanisk præinstalleret ved at knytte to kulfibre til plasmamembranen nær modsatte celleender. Sarcomere længde ændringer registreres under optisk eller elektrisk pacing. Endelig måles fotoinhibition under elektrisk feltstimulation af cellerne, og genererede kræfter analyseres.
Protokollen omfatter følgende trin, der er vist i rutediagrammet i figur 1:kanindyb anæstesi, thiopental overdosisinjektion, hjerteexcision, Langendorff-perfusion og vævsfordøjelse, mekanisk dissociation af vævet til frigivelse af celler, mikroskopisk analyse af CM-udbytte, dyrkning af CM, transduktion med adenovirustype 5 efterfulgt af inkubation og funktionelle eksperimenter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> Figur 1: Rutediagram over den protokol, der anvendes til at opnå elektrisk og optisk tempofyldt CM. Hjerter er fjernet fra kaniner 9-10 uger gammel, og hjertevæv er fordøjet, mens der gennemtrænges ved hjælp af en Langendorff setup. Celler frigives ved mekanisk omrøring. CM-udbyttet tælles under et mikroskop. CM dyrkes, transduceret med adenovirus type 5 og funktionelle eksperimenter udføres 48-72 timer efter transduktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-X Adenoviral System 3 CMV</td>
			<td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td></td>
			<td>4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips &#248; 16 mm, Thickness No. 0</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>631-0151</td>
			<td>Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm</td>
			<td>Samuel Findings, London, UK</td>
			<td>TSGBL3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Sch&#246;nenbuch, Switzerland</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff-perfusion set-up</td>
			<td>Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&#228;serei, Freiburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff-pump</td>
			<td>Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Z&#252;rich, Switzerland</td>
			<td>ISM444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh: Nylon Monodur filter cloth</td>
			<td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td>
			<td></td>
			<td>800 &#181;m holes, 1 m wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>717806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit, New Zealand White</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BC774R</td>
			<td>Bauchdeckenschere ger. 18cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment - Patch-clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplfier</td>
			<td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip &#248; 50 mm, Thickness No. 1</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>631-0178</td>
			<td>Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer Axon Digidata</td>
			<td>Molecular Devices, San Jos&#233;, CA, United States</td>
			<td>1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (530/20)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513878</td>
			<td>BZ:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (630/20)</td>
			<td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td>
			<td>227155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface</td>
			<td>Scientifica, Uckfield, UK</td>
			<td>1U Rack, 352036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 525 nm</td>
			<td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States</td>
			<td>PT-120-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control software</td>
			<td>Essel Research and Development, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control system</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverted</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorised Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica, Uckfield, UK</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Thorlabs, Newton, NJ, United States</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease</td>
			<td>RS Components, Corby, UK</td>
			<td>494-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>A-M Systems, Sequim, WA, United States</td>
			<td>787500</td>
			<td>Silver, Bare 0.015&#39;&#39;, Coated 0.0190&#39;&#39;, Length 25 Feet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass capillaries</td>
			<td>Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark</td>
			<td>160213 BRIS, ISO12772</td>
			<td>1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axon pClamp</td>
			<td>Molecular Devices, San Jos&#233;, CA, United States</td>
			<td>Version 10.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software MatLab2017</td>
			<td>The MathWorks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td>
			<td>1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment - Carbon fiber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fibers</td>
			<td>provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec</td>
			<td></td>
			<td>BZ:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer Axon Digidata</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States</td>
			<td>1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (530/20)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (630/20)</td>
			<td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td>
			<td>227155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface</td>
			<td>IonOptix, Milton, MA United States</td>
			<td>FSI-800</td>
			<td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer System</td>
			<td>Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada</td>
			<td>406A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries for force measurements</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States</td>
			<td>GC200F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface National Instruments</td>
			<td>National Instruments, Budapest, Hungary</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 525 nm</td>
			<td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States</td>
			<td>PT-120-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control box</td>
			<td>Essel Research and Development, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control system</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Parallax Inc., Rocklin, California, United States</td>
			<td>Propeller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverted</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S camera</td>
			<td>IonOptix, Dublin, Ireland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S camera Power</td>
			<td>IonOptix, Milton, MA, United States</td>
			<td>MCS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer Field Stimulator</td>
			<td>IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States</td>
			<td>MYP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo Motor</td>
			<td>Physik Instrumente (PI) GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>E-501.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease</td>
			<td>RS Components, Corby, UK</td>
			<td>494-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axon pClamp</td>
			<td>Molecular Devices, San Jos&#233;, CA, United States</td>
			<td>Version 10.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software IonWizard</td>
			<td>IonOptix, Dublin, Ireland</td>
			<td>Version 6.6.10.125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software MatLab2017</td>
			<td>The MathWorks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td>
			<td>1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A9251-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>21114-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>C9500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2, 315 U/mg</td>
			<td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>C0780-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine-&#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL</td>
			<td>Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>PZN-07829486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin 50 mg/mL</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15750-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL</td>
			<td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>PZN-03029843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>I6634-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A6558-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>26764.260</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>35113-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199-Medium</td>
			<td>Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A9187-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>63069-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK</td>
			<td>10428420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-L&#246;sung 0.9%</td>
			<td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>3200950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A6579</td>
			<td>without Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvat</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>P2256-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma, Poole, UK</td>
			<td>192066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>T0625-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental Inresa 0.5 g</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>PZN-11852249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride, Rompun 2%</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>PZN-01320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electromechanical assessment of optogenetically modulated cardiomyocyte activity

I løbet af de sidste to årtier, optogenetiske værktøjer er blevet etableret som potente midler til at modulere celle-type specifik aktivitet i overgearet væv, herunder hjertet. Mens Channelrhodopsin-2 (ChR2) er et fælles værktøj til at depolarisere membranpotentialet i kardiomyocytter (CM), har der potentielt manglet handlingspotentialer (AP), et effektivt værktøj til pålidelig hæmning af CM-aktivitet. Det er blevet foreslået at bruge anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetiske hæmning. Her beskriver vi en protokol til vurdering af virkningerne af at aktivere den naturlige ACR GtACR1 fra Guillardia theta i kultiveret kanin CM. Primære udlæsninger er elektrofysiologiske patch-clamp optagelser og optisk sporing af CM sammentrækninger, begge udføres samtidig med at anvende forskellige mønstre af lys stimulation. Protokollen omfatter CM isolation fra kanin hjerte, såning og dyrkning af cellerne i op til 4 dage, transduktion via adenovirus kodning for lys-gated chlorid kanal, udarbejdelse af patch-clamp og kulfiber opsætninger, dataindsamling og analyse. Ved hjælp af patch-clamp teknik i hele celle konfiguration gør det muligt at registrere lys-aktiverede strømme (i spænding-clamp mode, V-clamp) og AP (nuværende-clamp mode, I-clamp) i realtid. Ud over patch-clamp eksperimenter, gennemfører vi kontraktilitet målinger for funktionel vurdering af CM aktivitet uden at forstyrre det intracellulære miljø. For at gøre dette, celler er mekanisk forudindlæste ved hjælp af kulfibre og sammentrækninger registreres ved at spore ændringer i sarcomere længde og kulfiber afstand. Dataanalyse omfatter vurdering af AP-varighed en e-type fra I-clamp-optagelser, spidsbelastningsstrømme fra V-clamp-optagelser og kraftberegning ud fra kulfibermålinger. Den beskrevne protokol kan anvendes til afprøvning af biofysiske virkninger af forskellige optogenetiske aktuatorer på CM aktivitet, en forudsætning for udviklingen af en mekanistisk forståelse af optogenetiske eksperimenter i hjertevæv og hele hjerter.

GtACR1-eGFP blev udtrykt i kultiveret kanin-CM(Figur 6-skær), og fotostrømme blev målt med plaster-clamp-teknikken. Fotoaktivering af GtACR1 viser store indadrettede strømme på -74 mV. I figur 6eren spidsstrøm (IP) ved 4 mW/mm2 2 245 pA. AP blev udløst enten elektrisk (Figur 6B) eller optisk (Figur 6C) med strøminjektioner, der var 1,5 gange tærsklen, eller korte depolariserende lysimpulser på henholdsvis 10 ms. Analyse af APD-værdier, elektrisk tempo CM viser en APD 20 på 0,24 ± 0,08 s og en APD 90 på 0,75 ± 0,17 s, cm med optisk tempo viser en APD 20 på 0,31 ± 0,08 s og en APD 90 på 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, i det her præsenterede eksempel APD 20elektrisk = 0,17 s; APD 20optisk = 0,27 s og APD 90elektrisk = 0,61 s; APD 90optisk = 0,68 s; Figur 6D). Optisk tempo CM viser en langsommere AP debut (Figur 6D). CM-aktivering blev hæmmet ved vedvarende belysning (for 64 s, 4 mW/mm2) ved at polarisere membranpotentialet mod klorids tilbageførselspotentiale her -58 mV (figur 6E). Højere strøminjektioner end 1,5 gange tærsklen fremkalder ikke AP-generering (figur 6F). Genererede spidsbelastninger blev bestemt ud fra kulfiberbøjning (Figur 7B,C,E). Cm'et genererede 232 μN/mm2 ved elektrisk pacing (figur 7B) og 261 μN/mm2 efter optisk pacing (figur 7C). Langvarige grønlysimpulser hæmmer sammentrækninger (Figur 7E). Efter optisk hæmning i 64 s genererer tilbagevendende sammentrækninger en lavere kontraktilekraft, og kraftværdier genvindes mod baseline efter ~ 10 sammentrækninger (pacing ved 0,25 Hz, Figur 7D) i overensstemmelse med diastolisk calciumtab fra kanin-CM.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> Figur 6: Repræsentative patch-clamp-optagelser af elektrisk og optisk tempo/hæmmet CM. (A) Repræsentativ fotostrøm ved -74 mV med en lysimpuls på 300 ms, 4 mW/mm2. IP angiver spidsstrømmen. Indsatsen viser en GtACR1-eGFP-positiv celle. (B) Repræsentant AP optagelse på 0 pA ved hjælp af en nuværende rampe på 10 ms, 0,6 nA til elektrisk tempo CM. (C) Repræsentant AP optagelse på 0 pA ved hjælp af lysimpulser på 10 ms, 0,4 mW /mm2. (D) Topgrafen viser overlejringen af den 10th AP af elektrisk (blå) og optisk (grøn) aktiveret CM. AP blev justeret af den maksimale ændring i membranpotentiale (dV/ dt max). Nederste graf viser forskellen mellem membranpotentiale mellem optisk og elektrisk udløst AP (Eoptisk-Eelektrisk). (E) Elektrisk udløst AP blev hæmmet under vedvarende lys på 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP hæmmes af højere strøminjektioner end 1,5 gange tærsklen (fra 0,7 nA i trin på 0,1 nA til 2,2 nA) under vedvarende lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> Figur 7: Repræsentative data fra kulfiberoptagelser af optisk og elektrisk tempo/hæmmet CM. (A) Display i dataacquisition software. Billede (I) viser det målte CM med vinduet til beregning af sarcomerelængde. Cellebredden er mærket med orange. 1) Rækkevidde af relevante frekvenser. (2) FFT-effektspektrum viser hyppigheden af sarcomereafstanden på cellen. Den gennemsnitlige sarcomere længde beregnes ud fra peak frekvens. (3) Sarcomere længde tracking vindue. (4) Intensitetspor. (5) Intensiteten spor ganget med en Hamming vindue er windowed intensitet spor. Skema (II) viser cellens elliptiske tværsnit. Bredde i orange og tykkelse i stiplet blå. Billede (III) viser placeringen af kulfibre med de respektive detektionsbokse, venstre i rødt og højre i grøn. (6) Intensitetspor. (7) Første afledte af intensitet spor (se dataindsamling software manual). (B)Repræsentative spor af elektrisk fremkaldte sammentrækninger. Panel (I) viser sarcomere længde afkortning, panel (II) afstanden mellem de to kulfibre. (C) Repræsentativt spor af optisk fremkaldte sammentrækninger (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarcomere længde afkortning, panel (II) afstanden mellem de to kulfibre. (D) Genereret peak kraft fra sammentrækning 1 til 11 efter en pause forårsaget af hæmning af AP generation. (E) Repræsentativt spor af optisk hæmning af sammentrækninger under vedvarende belysning (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarcomere længde afkortning, panel (II) længden mellem de to kulfibre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Område</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acr</td>
			<td>anion kanalrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ap</td>
			<td>handlingspotentiale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apd</td>
			<td>handling potentiel varighed</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cfu</td>
			<td>koloni danneenhed</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr</td>
			<td>channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cm</td>
			<td>kardiomyocyte</td>
		</tr>
<tr>
<td>eGFP</td>
			<td>forbedret grønt fluorescerende protein</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esd</td>
			<td>ende systolisk celledeformation</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eu</td>
			<td>endotoksinenheder</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>Kraft</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fft</td>
			<td>hurtig Fourier transformering</td>
		</tr>
<tr>
<td>GtACR delte et link.</td>
			<td>Guillardia theta anion channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gui</td>
			<td>grafisk brugergrænseflade</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-klemme</td>
			<td>strømklemme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ie</td>
			<td>internationale enheder</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moi</td>
			<td>mangfoldighed af infektion</td>
		</tr>
<tr>
<td>poly-HEMA</td>
			<td>poly(2-hydroxyethyl methacrylat)</td>
		</tr>
<tr>
<td>V-klemme</td>
			<td>spænding-klemme</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 5: Liste over forkortelser.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> Supplerende figur 1: Lysintensitetsmålinger med optisk effektmåler. (A) Måling af 10 ms lysimpulser ved 4 mW/mm2. (B) Måling af vedvarende belysning på 64 s ved 4 mW/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> Supplerende figur 2: Egenskaber af frisk isoleret CM og deres strukturelle tilpasning i kultur. (A) AP-registrering af et nyisoleret CM (APD 20 af 1,11 ± 0,34 s, APD 90 på 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Gennemsnitligt hvilemembranpotentiale på -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Kulfiberregistrering af et friskisoleret CM i elektrisk tempo. Gennemsnitlig maksimalkraft på 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). c) Konfokale billeder af et nyisoleret CM (I) (II) og transduceret (III) CM efter 48 timer i kultur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende materiale: MatLab script til at bestemme APD og hvile membran potentiale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity at JoVE.com

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Vi præsenterer en protokol til evaluering af de elektromekaniske virkninger af GtACR1 aktivering i kanin kardiomyocytter. Vi giver detaljerede oplysninger om celleisolation, dyrkning og adenoviral transduktion og om funktionelle eksperimenter med patch-clamp og kulfiberteknikker.

Elektromekanisk vurdering af optogenetisk moduleret kardiomyocyt aktivitet

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Ved hjælp af protokollen som en biofysisk effekt af forskellige optogenetiske aktuatorer på kardiomyocyt aktivitet kan testes for at støtte i udviklingen af optogenetiske eksperimenter i hjertevæv og hele hjerter. Ved at kombinere patch clamp teknik med sarcomere tracking og kulfiber assisteret kraft målinger, kan vi studere virkningerne af GtACR1 fotoaktivering på el og mekanik af ventrikulære kardiomyocytter. Optogenetisk hæmning kan potentielt anvendes til optisk defibrillering.GtACR1 er et optogenetisk værktøj, der muliggør lyddæmpning af hjerteaktivitet. Denne teknik er fuldt ud anvendelig til andre forskningsområder såsom glat og encellede muskel celle undersøgelser. Selv om denne protokol ikke kan bruges til høj gennemløb screening, det giver et middel til omfattende analyse af cardiomyocyte elektrisk og mekanisk funktion.Så som man siger, et billede siger mere end tusind ord. Hvor meget mere information kan vi komme over i video? Nogle af vores værktøjer og teknikker, der er involveret i enkelt myocyte stretching og i sonde forberedelse er meget indviklet, og det er meget lettere at formidle dem i en video i forhold til en beskrivelse.Efter blodet er blevet vasket ud af saltvand perfundaerede hjerte fra en ni til 10-uger gamle New Zealand hvid kanin, skifte perfusate til en lav-calcium, høj-kalium opløsning og perfem hjertet i yderligere to minutter efter hjertet holder op med at slå. Se enzymopløsningen, start recirkulere enzymopløsningen tilbage i reservoiret efter to minutters fordøjelse, og sæn neder hastigheden til 16 milliliter i minuttet efter fem minutters fordøjelse. Når vævet ser blødt ud efter 40-50 minutters fordøjelse, skær hjertet af kanylen og anse straks hjertet i blokerende opløsning.Tilsæt blokerende opløsning, indtil vævet er fuldt dækket. Skær højre hjertekammer og septum og adskille venstre hjertekammer. Fjern papillære muskler og bruge fine kraftbefæstelse og en pipette til forsigtigt at trække fra hinanden vævet til at frigive cellerne ved mekanisk dissociation.Cellesuspensionen filtreres gennem en maske med en millimeter kvadrerede porer, og cellerne filtreres ved centrifugering. Derefter resuspend den cardiomyocyte pellet i frisk blokerende opløsning. For en patch clamp eksperiment, pels autoklaveret coverslips i en petriskål med 100 mikrogram pr. milliliter laminin umiddelbart før cellekultur.Til kulfibereksperiment, pels petriskåle med 0,12 gram pr. milliliter Poly-HEMA i en 95-til-fem ethanol-til-vand opløsning. Ti til 15 minutter efter resuspending af kardiomyocytter, fjerne supernatant og resuspend cellerne i kultur medium. Efter optælling, frø cellerne på en dækslæb i en petriskål på et mål tæthed på 1,75 gange 10 til de fire celler pr milliliter.Inkuber kulturerne i tre til fire timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Ved inkubationens afslutning erstattes mediet fra dæksletkulturer med frisk medium indeholdende adenovirustype fem kodning for GtACR1-eGFP ved en mangfoldighed af infektion på 75. Vend kulturerne tilbage til vækstvøsen i 48 timer.For at udføre en patch clamp eksperiment, skal du bruge en mikropipette puller til at trække 1,7 til 2,5 megaohm patch pipetter fra soda lime glas kapillærer og initialisere dataindsamling software. Placer en dækslæd med celler i målekammeret, der indeholder ekstern opløsning, og vælg kardiomyocytten baseret på dens eGFP fluorescens. Dernæst fylde en patch pipette med intern opløsning og fastgør pipetten til pipetteholderen, der indsætter sølvchloridlakeret sølvoptagelsestråd i den interne opløsning.Membrantesten skal anvendes til at anvende 10 millivoltimpulser i 15 millisekunder med en baseline på nul millivolt. Når du har nået den celledemul er tilknyttet, skal du skifte til helcelletilstand med et holdepotentiale på minus 60 millivolt i dataindsættelsessoftwaren. Derefter forsigtigt anvende undertryk for at få adgang til hele celle konfigurationen ved at briste membranen.En vellykket brud vil blive dokumenteret ved en øjeblikkelig stigning i den målte kapacitans. Optag fotoaktivationsprotokoller i spændingsklemmertilstand ved minus 74 millivolt med lysimpulser på 300 millisekunder eller handlingspotentialer i den aktuelle klemmetilstand ved nul picoampere. For at producere kulfiber, først montere pipetten på pipette holdere af puller.Træk glaskapillærerne i to pipetter med en samlet tilspidset længde på ca. 11 millimeter og en endelig indre diameter på ca. 30 mikrometer. Brug derefter et stereomikroskop til at justere en kapillær i orienteringscirklen og bøj det med op til 45 grader ved at trykke ned på spidsen af kapillæren med en bender. Varm glødetråden op, indtil kapillæren opretholder 45 graders vinkel, selv efter at benderen er fjernet.Efter bøjning kapillær, bruge fine kraftærgninger udstyret med bløde slanger til at tage en kulfiber ud af røret og passer det ind i den fine spids af kapillær. Skub fiberen i kapillæren op til svinget. Skær kulfibre, så de projicere to milliliter fra spidsen af kapillær og bruge cyanoacrylat lim til at fastsætte fibrene til den forreste del af hver kapillær.For at kalibrere fibrene fastgøres en kapillær til en holder, der styres af en mikromanipulator og en piezomotor. Flyt kapillæren mod sensoren, og juster den i forhold til sensoren. Sæt fiberspidsen i kontakt med kraftsensoren uden at frembringe nogen kraft.Den samlede bevægelse af piezomotoren er 60 mikrometer. Flyt piezomotoren i seks 10 mikrometertrin mod kraftsensoren. Sensoren har en følsomhed på 0,05 millinewtons pr volt og en kraftområde på nul til 0,5 millinewtons.Læs den målte spænding for hvert trin og fjern kulfiberen fra sensoren. For at registrere styrken af ordregivende kardiomyocytter, pels overfladen af et dækglas med Poly-HEMA og placere den i målekammeret. Fyld kammeret med ekstern bad løsning.Fastgør både kulfiberbelastede kapillærer til scenen mikromanipulator og justere dem i en vinkel, således at kulfibrene er nær vandret til overfladen af målekammeret. For at kontrollere, om fibrene er korrekt justeret, fokusere på overfladen af målekammeret, sænke den første fiber, og flytte fiber vandret. Spidsen af fiberen skal glide på overfladen af målekammeret.Følg den samme procedure for den anden fiber. Når lyset er slukket, tilsættes et par dråber kultiveret celleaffjedring til kammeret og anvende korte grønne lysimpulser for at vælge celler, der kontrakt som reaktion på det grønne lys stimulation. For at fastgøre den første fiber, forsigtigt komprimere cellen ved at sænke fiberen derefter frigive trykket.Fastgør den anden fiber parallelt med den første i den anden ende af kardiomyocyt for at have et maksimalt antal sarcomeres mellem de to fibre. Når begge fibre er fastgjort, løft fibrene, så cellen ikke længere er i kontakt med kammeroverfladen. Bring sarcomeres i fokus, indstille sarcomere længde tracking vindue mellem fibrene, og bruge kanten detektionsmodulet til at spore fiber bøjning.Indstil detektionsområderne med de røde og grønne vinduer, og definer en tærskel ved det første derivat af lysintensitetssporingen. Optisk tempo cellen, mens sporing sarcomere længde og fiber bøjning. I dette tilfælde, vi tempo på 0,25 hertz.Efter optagelse af mindst 15 optisk fremkaldte sammentrækninger, felt stimulere cellen elektrisk. Find tærsklen for at fremkalde sammentrækninger og anvende 1,5 gange tærsklen spænding for elektrisk pacing. For en hæmning protokol, anvende elektriske stimuli til fremkalde sammentrækninger og derefter udsætte cellen til en vedvarende lys puls på forskellige lysintensiteter.Optag mindst 15 sammentrækninger efter lys-induceret hæmning. GtACR1 udtrykkes i kultiverede kaninkardiomyocytter. GtACR1 fotoaktivering ved en lysintensitet på fire milliwatt pr. millimeter kvadreret i 300 millisekunder resulterer i store indadgående strømme på minus 74 millivolt med en målt topstrøm på 245 picoampere.I dette repræsentative eksperiment blev handlingspotentialer udløst enten elektrisk med strømindsprøjtninger 1,5 gange tærsklen eller optisk med 10 millisekundlyselyrimpulser. Optisk tempo kardiomyocytter viste en langsommere handling potentiale debut. Elektrisk udløste handlingspotentialer blev hæmmet under vedvarende lys.Højere strøminjektninger og 1,5 gange tærsklen under den vedvarende lysapplikation fremkalder heller ikke handlingspotentialer. Den cardiomyocyte genereret en sammentrækning kraft på 232 mikronewtons per millimeter kvadreret på elektrisk pacing og 261 mikronewtons per millimeter kvadreret efter optisk pacing. Langvarig grønt lys pulser hæmmet sammentrækninger med post-hæmning tilbagevendende sammentrækninger genererer en lavere kontraktile kraft i overensstemmelse med diastolisk calcium tab fra kanin kardiomyocytter.Vi anbefaler at øve teknikkerne, før du udfører et eksperiment, især da positionering af mikrosonder i mørke kan være udfordrende. er meget vigtigt, når man analyserer kardiomyocyt kontraktilitet, da det kan påvirke kraft produktion og afslapning. Forskellige efterloads kan også anvendes til isotonic og auxotonic sammentrækning analyse.Disse teknikker gør det muligt at karakterisering af de biofysiske virkninger af aktivering af nyudviklede optogenetiske aktuatorer i kardiomyocytter, hvilket er afgørende for at vælge det bedst egnede optogenetiske værktøj til hvert eksperiment. Vær opmærksom på, at adenovirustransuktion og alle trin efter transduktionen skal udføres under biosikkerhedsniveau II-betingelser.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering af cardiomyocyte Kerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

A Novel Application of Musculoskeletal Ultrasound Imaging

A Novel Anvendelse af Muskuloskeletal Ultralydbilleddannelse

Ultrasound is an attractive modality for imaging muscle and tendon  motion during dynamic tasks and can provide a complementary methodological  approach ...

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Ultralydsvurdering af Myocardial Microstructure

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan vurdering af nyrefunktionen i bevidste Gnavere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Sammentrækninger af menneske-iPSC-afledt Cardiomyocyte Syncytia målt med et Ca-følsomme fluorescerende farvestof i temperatur-kontrollerede 384-godt plader

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Non-invasiv vurdering af Dorsiflexor muskelfunktion i mus

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Ultrasonographic Assessment During Cardiopulmonary Resuscitation

Ultralydvurdering under genoplivning af kardiopulmonal genoplivning

The US-CAB (Ultrasound, Circulation/Airway/Breathing) protocol integrates several sonographic techniques into a structured assessment of the circulation, ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Model af iskæmisk hjertesygdom og video-baseret sammenligning af Cardiomyocyte sammentrækning ved hjælp af hiPSC-afledte kardiomyocytter

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Providing Visual Biofeedback Using Brightness Mode Ultrasound During a Golf Swing

Giver visuel biofeedback ved hjælp af ultralyd i lysstyrketilstand under et golfsving

Using ultrasound biofeedback in conjunction with verbal cueing can increase muscle thickness more than verbal cueing alone and may augment traditional ...