Name: electromechanical assessment of optogenetically modulated cardiomyocyte activity
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity at JoVE.com

Vi takker Stefanie Perez-Feliz for utmerket teknisk assistanse, Dr. Jonas Wietek (Humboldt-University, Berlin, Tyskland) for å gi pUC57-GtACR1 plasmid, Prof. Dr. Michael Schupp (Charité- Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, Berlin) for adenovirusproduksjonen og Dr. Anastasia Khokhlova (Ural Federal University) for å dele sin ekspertise for å forbedre celleisolasjonsprotokollen og å re-designe pipettebøyingsoppsettet. Prosjektet ble finansiert av German Research Foundation (SPP1926: SCHN 1486/1-1; Emmy-Noether fellesskap: SCHN1486/2-1) og ERC Advanced Grant CardioNECT.

<ol>
	<li>Harz, H., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin-regulated+calcium+currents+in+Chlamydomonas.">Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas.</a> Nature. 351, 489-491 (1991).</li><li>Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+electric+potential+in+the+phototaxis+of+the+alga+Haematococcus+pluvialis.">Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis.</a> Nature. 271, 476-478 (1978).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+A+Light-Gated+Proton+Channel+in+Green+Algae.">Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo.">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li><li>Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriorhodopsin:+a+light-driven+proton+pump+in+Halobacterium+Halobium.">Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium.</a> Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).</li><li>Schobert, B., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halorhodopsin+is+a+light-driven+chloride+pump.">Halorhodopsin is a light-driven chloride pump.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).</li><li>Inoue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-driven+sodium+ion+pump+in+marine+bacteria.">A light-driven sodium ion pump in marine bacteria.</a> Nature Communications. 4, 1678 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Light+Sensitivity+Optical+Neural+Silencer:+Development+and+Application+to+Optogenetic+Control+of+Non-Human+Primate+Cortex.">A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+properties,+substrate+specificity+and+optogenetic+potential+of+the+engineered+light-driven+sodium+pump+eKR2.">Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2.</a> Scientific Reports. 8, 9316 (2018).</li><li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel.">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), 409-412 (2014).</li><li>Berndt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Guided+Transformation.">Structure-Guided Transformation.</a> Science. 344 (6182), 420-424 (2014).</li><li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+light-gated+anion+channels:+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics.">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li><li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins.">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103 (2017).</li><li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Neuronal+Silencing+in+Drosophila+during+Visual+Processing.">Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing.</a> Scientific Reports. 7, 13823 (2017).</li><li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics.">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530 (2016).</li><li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels.">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806 (2018).</li><li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes.">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+slices:+preparation,+handling,+and+successful+optical+mapping.">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+mechanics+of+rat+cardiomyocytes+under+isometric,+unloaded,+and+physiologically+loaded+conditions.">Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).</li><li>Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials,+ion+channel+currents+and+transverse+tubule+density+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes+maintained+for+6+days+in+cell+culture.">Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).</li><li>Burton, R. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolae+in+Rabbit+Ventricular+Myocytes:+Distribution+and+Dynamic+Diminution+after+Cell+Isolation.">Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation.</a> Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Janssen, P. M., Hunter, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force,+not+sarcomere+length,+correlates+with+prolongation+of+isosarcometric+contraction.">Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction.</a> The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).</li><li>Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+force+decline+from+calcium+decline+by+preload+in+isolated+rabbit+myocardium.">Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).</li><li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca+2+-permeable+channelrhodopsin+CatCh.">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li><li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+light+to+fight+atrial+fibrillation.">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li><li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li><li>Bernal Sierra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channel-based+optogenetic+silencing.">Potassium channel-based optogenetic silencing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4611 (2018).</li><li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson.">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9 (1), 3949 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Mens optogenetiske verktøy muliggjør modulering av excitable celle elektrofysiologi på en ikke-invasiv måte, de trenger grundig karakterisering i ulike celletyper (f.eks CM) for å tillate en å velge det beste tilgjengelige verktøyet for en bestemt eksperimentell design. Patch-clamp teknikken er en standard metode for å vurdere cellulær elektrofysiologi. I hele cellekonfigurasjonen gjør det mulig for en å registrere fotoaktiverte strømmer over plasmamembranen eller temporale endringer i membranspenning etter lysstimulering/hemming. Optogenetisk manipulering av elektrisk eksitasjon påvirker også CM-sammentrekninger. Vi bruker sarkomersporing og karbonfiberassisterte kraftmålinger for å kvantifisere effekten av optisk avhør på den mekaniske aktiviteten til myocytter.
Vi beskriver en protokoll for å karakterisere de grunnleggende effektene av en lys-gated klorid kanal, GtACR1, i CM. Som modellsystem valgte vi kanin CM, da deres elektrofysiologiske egenskaper (f.eks. AP-form og ildfast periode) ligner de som observeres i menneskelig CM nærmere enn gnager CM. Dessuten kan kan kan inrabbit CM dyrkes i flere dager, lenge nok til adenoviral levering og uttrykk for GtACR1-eGFP. Spesielt, isolert CM endre sine strukturelle egenskaper i kultur over tid, inkludert avrunding av celle avslutninger og gradvis tap av kryss-striation, T-rørformet system og caveolae23,24. I tråd med dette har funksjonelle endringer blitt rapportert i kultivert CM: depolarisering av hvilemembranpotensialet, forlengelse av AP og endringer i cellulær Ca2 + håndtering. For gjennomgang av cellulære tilpasninger i kultur, vennligst se Louch et al.25. Supplerende figur 2 viser eksemplariske AP- og sammentrekningsmålinger av nyisolert CM for sammenligning med de som er observert i kultivert CM (Figur 6, Figur 7) ved hjelp av den her presenterte protokollen.
Helcellede patch-clamp opptak muliggjør direkte målinger av fotostrømmer egenskaper (f.eks amplituder og kinetikk) og lysinduserte endringer i membranpotensial eller AP-egenskaper ved høy temporal oppløsning. Imidlertid har slike opptak flere begrensninger: For det første erstattes cytosolet av pipetteløsningen i helcelleopptak, noe som er fordelaktig å kontrollere ioniske elektrokjemiske gradienter, men har den indre ulempen med å vaske ut cellulære organeller, proteiner og andre forbindelser, og dermed potensielt påvirke cellulære elektriske responser. For det andre er bivirkninger som aktivering av flere ionekanaler som følge av ikke-fysiologisk lang depolarisering (f.eks. langsomme tidskonstanter av lys-gated ionkanaler) vanskelig å vurdere, da vår metode bare tillater en å oppdage endringer i APD, men ikke å gjennomføre direkte målinger av ioniske konsentrasjoner i elektrofysiologisk relevante cellerom. Dette kan gjøres med fluorescerende indikatorer (f.eks. ca2+ sensorer) eller ionselektive elektroder. Ytterligere karakterisering kan omfatte lysintensitetstitreringer, bestemmelse av pH-avhengighet, fotostrømkinetikk ved ulike membranpotensialer, og utvinning kinetikk under repeterende lysstimulering.
I motsetning til patch-clamp opptak, gjør encellede kraftmålinger analyse av cellulære sammentrekninger av intakte myocytter uten å påvirke deres intracellulære miljø. Sekundære effekter på ionkonsentrasjoner (f.eks.ca. 2+) kan indirekte vurderes ved å bestemme generert kraftamplitude og dynamikk (f.eks. maksimal hastighet på sammentrekning og avslapning; her ikke analysert). Kraftmålinger med karbonfiberteknikken har en fordel over fritt kontraherende celler, da de gir direkte informasjon om passive og aktive krefter i forhåndslastede celler (dvs. under forhold som ligner mer på in situ- eller in vivo-innstillingene). Mekanisk forhåndslasting er spesielt viktig når du analyserer cellulær kontraktilitet, da stretch påvirker kraftproduksjon og avslapning26,27.
Optogenetiske tilnærminger tillater spatiotempoally presis manipulering av cellulær membran potensial, både i enkelt CM og intakt hjertevev. Klassisk, ChR2, en lys-gated kation ikke-selektiv kanal, har blitt brukt for depolarisering av membranpotensialet, mens lysdrevne proton- og/eller kloridpumper ble brukt til membranhyperpolarisering. Begge grupper av optogenetiske aktuatorer krever høye uttrykksnivåer, da ChR2 er preget av en iboende lav enkanalsledning28 og lysdrevne pumper som maksimalt transporterer en ion per absorbert foton. Videre kan langvarig aktivering av ChR2 i CM føre til Na+ og/ eller Ca2 + overbelastning, og lysdrevne pumper kan endre trans-sarcolemmal H+ eller Cl- gradienter29,30. I søk etter alternative verktøy for optogenetisk kontroll av CM aktivitet, vi nylig testet den naturlige anion channelrhodopsin GtACR1, preget av en overlegen enkeltkanals ledningsevne og høyere lysfølsomhet sammenlignet med kation ChR som ChR2. Vi fant at GtACR1 aktivering depolariserer CM og kan brukes til optisk tempo og hemming, avhengig av lys puls timing og varighet. En ekstra fordel med å bruke ACR i stedet for kation ChR kan være det mer negative reverseringspotensialet til Cl- sammenlignet med Na+, noe som reduserer kunstig introduserte ionstrømmer. Som vi tidligere har vist, kan optisk tempo med GtACR1 føre til AP-forlengelse som følge av den langsomme komponenten av GtACR1-kanallukking, som kan overvinnes ved hjelp av raskere GtACR1 mutanter19. Ap-forlengelse er imidlertid mye mindre uttalt når du bruker en lavere, mer fysiologisk intracellulær Cl- konsentrasjon (se figur 6). Videre gtacr1-mediert hemming av langvarig belysning resulterer i dyp membran depolarisering, som igjen kan aktivere sekundær Na+ og Ca2 + tilstrømning, og dermed endre aktiviteten til spenningsstyrte kanaler. I våre målinger finner vi at AP- og sammentrekningsparametre gjenoppretter til baseline innen 40 s etter en lysindusert hemming i 1 min (se Kopton et al. 2018, Figur 6, Figur 7). Lys-gated K+ kanaler tilbyr et potent alternativ for å dempe CM uten å påvirke CM hvilemembran potensial31.
I fremtiden ønsker vi å kvantitativt sammenligne ulike optogenetiske verktøy for deres potensial til å hemme hjerteaktivitet. For dette formål tester vi en rekke lys-gated ion kanaler inkludert ACR, ChR2 og rød-forskjøvet ChR varianter32, samt hyperpolariserende aktuatorer som halorhodopsin eller lyset gated adenylyl cyclase bPAC i kombinasjon med kaliumkanalen SthK (PAC-K)31.
Her presenteres protokollen kan brukes for grundig karakterisering av de elektromekaniske egenskapene til CM. Det gjelder hovedsakelig også for CM fra andre arter, og til CM isolert fra syk myokardiet. Optisk stimulering gjør det mulig å tempo CM ved forskjellige frekvenser, og forskjellige preloader kan testes under karbonfiber sammentrekning eksperimenter. Et interessant eksperiment ville være å bruke lavintensitetsbelysning for subterskeldepolarisering, for å etterligne gradvis økning i hvilemembranpotensialet, som kan observeres under utviklingen av hjertevevsmodellering under sykdomsprogresjon. Til slutt kan funksjonelle målinger kombineres med Ca2+ avbildning for ytterligere innsikt i eksitasjon-sammentrekningskobling, eller med farmakologiske intervensjoner for å evaluere effekten av ulike legemidler på CM-aktivitet.

ChR-medierte fotostrømmer ble først registrert i øyeflekken av encellet grønne alger1,2. Kort tid etter genetisk kloning og heterologous uttrykk for Chlamydomonas reinhardtii ChR1 og ChR2, ChR ble brukt som verktøy for å endre membranpotensialet i Xenopus oocytes og pattedyr celler av lys3,4. Kasjon ikke-selektiv ChR depolariserer membranen av celler med et hvilemembranpotensial som er negativt for reverseringspotensialet til ChR. De kan dermed brukes til å fremkalle AP i spennende celler, inkludert nevroner og CM, slik at optisk pacing5,6.
Komplementære til kation ChR, lysdrevet proton, klorid og natriumpumper7,8,9 har blitt brukt til å hemme nevronal aktivitet10,11,12. Sistnevnte har imidlertid begrensninger, som krever høy lysintensitetog vedvarende belysning, da en ion transporteres per absorbert foton. I 2014 beskrev to uavhengige studier av Wietek et al. og Berndt et al. konvertering av kation-ledende ChR til ACR via mutasjoner i kanalen pore13,14. Ett år senere ble naturlig ACR oppdaget i kryptophyte Guillardia theta (GtACR)15. Som konstruert ACR viste gjenværende kation ledningsevne, ble de erstattet av naturlig ACR, preget av en stor enkanals ledningsevne og høy lysfølsomhet15. GtACR ble brukt til å dempe nevronal aktivitet ved å polarisere membranpotensialet mot reverseringspotensialet til klorid16,17. Govorunova et al. brukte GtACR1 til kultivert rotte ventrikulær CM og viste effektiv fotohemming ved lave lysintensitetsnivåer som ikke var tilstrekkelige til å aktivere tidligere tilgjengelige hemmingsverktøy, for eksempel protonpumpen Arch18. Vår gruppe rapporterte nylig at GtACR1-mediert fotohemming av CM er basert på depolarisering og at GtACR1 også kan brukes, derfor for optisk tempo på CM19.
Her presenterer vi en protokoll for å studere de elektrofysiologiske og mekaniske effektene av GtACR1 fotoaktivering på kultivert kanin ventrikulær CM. Vi beskriver først celleisolasjon, kuling og transduksjon. Elektrofysiologiske effekter måles ved hjelp av helcellepatchklemmeopptak. Lysmedierte strømmer med en gitt membranspenning vurderes i V-klemmemodus. Membran potensiell dynamikk måles mens elektrisk eller optisk pacing CM (I-clamp modus). Optisk hemming av elektrisk utløst AP testes ved hjelp av vedvarende lysapplikasjon. Mekaniske effekter måles ved hjelp av karbonfibre i kombinasjon med bildebasert sporing av sarkomerlengde. For å gjøre dette er optisk fartsbare celler mekanisk forhåndslastet ved å feste to karbonfibre til plasmamembranen nær motsatte celleender. Sarcomere lengde endringer registreres under optisk eller elektrisk tempo. Til slutt måles fotohemming under elektrisk feltstimulering av cellene, og genererte krefter analyseres.
Protokollen inneholder følgende trinn vist i flytskjemaet i figur 1:kanin dyp anestesi, thiopental overdose injeksjon, hjerte eksisjon, Langendorff-perfusjon og vev fordøyelse, mekanisk dissosiasjon av vevet for å frigjøre celler, mikroskopisk analyse av CM utbytte, kulturing av CM, transduksjon med adenovirus type 5, etterfulgt av inkubasjon og funksjonelle eksperimenter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> Figur 1: Flytskjema for protokollen som brukes til å oppnå elektrisk og optisk fartsbar CM. Hjerter blir skåret ut fra kaniner 9-10 uker gammel, og hjertevev fordøyes mens de blir perfundert ved hjelp av et Langendorff-oppsett. Celler frigjøres av mekanisk agitasjon. CM-utbyttet telles under et mikroskop. CM er kultivert, transduced med adenovirus type 5 og funksjonelle eksperimenter utføres 48-72 timer etter transduksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment - Cell isolation/Culturing/Transduction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adeno-X Adenoviral System 3 CMV</td>
			<td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td></td>
			<td>4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips &#248; 16 mm, Thickness No. 0</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>631-0151</td>
			<td>Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Griffin Silk, Black, 2 m Length, Size 3, 0.5 mm</td>
			<td>Samuel Findings, London, UK</td>
			<td>TSGBL3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>New Brunswick, Eppendorf, Sch&#246;nenbuch, Switzerland</td>
			<td>Galaxy 170S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff-perfusion set-up</td>
			<td>Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&#228;serei, Freiburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff-pump</td>
			<td>Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Z&#252;rich, Switzerland</td>
			<td>ISM444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh: Nylon Monodur filter cloth</td>
			<td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td>
			<td></td>
			<td>800 &#181;m holes, 1 m wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>717806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit, New Zealand White</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td>
			<td>BC774R</td>
			<td>Bauchdeckenschere ger. 18cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter, 0.22 &#181;m</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment - Patch-clamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplfier</td>
			<td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip &#248; 50 mm, Thickness No. 1</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>631-0178</td>
			<td>Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer Axon Digidata</td>
			<td>Molecular Devices, San Jos&#233;, CA, United States</td>
			<td>1550A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (530/20)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513878</td>
			<td>BZ:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (630/20)</td>
			<td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td>
			<td>227155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage</td>
			<td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td>
			<td>CV203BU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface</td>
			<td>Scientifica, Uckfield, UK</td>
			<td>1U Rack, 352036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 525 nm</td>
			<td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States</td>
			<td>PT-120-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control software</td>
			<td>Essel Research and Development, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control system</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td>
			<td>PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverted</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorised Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica, Uckfield, UK</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Thorlabs, Newton, NJ, United States</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease</td>
			<td>RS Components, Corby, UK</td>
			<td>494-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>A-M Systems, Sequim, WA, United States</td>
			<td>787500</td>
			<td>Silver, Bare 0.015&#39;&#39;, Coated 0.0190&#39;&#39;, Length 25 Feet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime glass capillaries</td>
			<td>Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark</td>
			<td>160213 BRIS, ISO12772</td>
			<td>1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axon pClamp</td>
			<td>Molecular Devices, San Jos&#233;, CA, United States</td>
			<td>Version 10.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software MatLab2017</td>
			<td>The MathWorks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td>
			<td>1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment - Carbon fiber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon fibers</td>
			<td>provided from Prof. Jean-Yves Le Guennec</td>
			<td></td>
			<td>BZ:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer Axon Digidata</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States</td>
			<td>1550B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (530/20)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>11513878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (630/20)</td>
			<td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td>
			<td>227155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence System Interface</td>
			<td>IonOptix, Milton, MA United States</td>
			<td>FSI-800</td>
			<td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer System</td>
			<td>Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada</td>
			<td>406A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries for force measurements</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, United States</td>
			<td>GC200F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface National Instruments</td>
			<td>National Instruments, Budapest, Hungary</td>
			<td>BNC-2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED 525 nm</td>
			<td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States</td>
			<td>PT-120-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control box</td>
			<td>Essel Research and Development, Toronto, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED control system</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller</td>
			<td>Parallax Inc., Rocklin, California, United States</td>
			<td>Propeller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope inverted</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S camera</td>
			<td>IonOptix, Dublin, Ireland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoCam-S camera Power</td>
			<td>IonOptix, Milton, MA, United States</td>
			<td>MCS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyoPacer Field Stimulator</td>
			<td>IonOptix Cooperation, Milton, MA, United States</td>
			<td>MYP100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo Motor</td>
			<td>Physik Instrumente (PI) GmbH &#38; Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>E-501.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease</td>
			<td>RS Components, Corby, UK</td>
			<td>494-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Axon pClamp</td>
			<td>Molecular Devices, San Jos&#233;, CA, United States</td>
			<td>Version 10.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software IonWizard</td>
			<td>IonOptix, Dublin, Ireland</td>
			<td>Version 6.6.10.125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software MatLab2017</td>
			<td>The MathWorks, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td>
			<td>1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A9251-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>21114-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Carnitine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>C9500-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2, 315 U/mg</td>
			<td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>C0780-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine-&#946;-D-arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>C1768-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany</td>
			<td>3054.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esketamine hydrochloride, Ketanest S 25 mg/mL</td>
			<td>Pfizer Pharma PFE GmbH, Berlin, Germany</td>
			<td>PZN-07829486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin 50 mg/mL</td>
			<td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15750-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin-Sodium, 5,000 IU/mL</td>
			<td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>PZN-03029843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>I6634-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-aspartate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A6558-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td>
			<td>26764.260</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td>
			<td>35113-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199-Medium</td>
			<td>Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>A9187-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>63069-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK</td>
			<td>10428420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl-Solution 0.9%, Isotone Kochsalz-L&#246;sung 0.9%</td>
			<td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td>
			<td>3200950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A6579</td>
			<td>without Ca2+/Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvat</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>P2256-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)</td>
			<td>Sigma, Poole, UK</td>
			<td>192066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td>
			<td>T0625-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental Inresa 0.5 g</td>
			<td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td>
			<td>PZN-11852249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride, Rompun 2%</td>
			<td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td>
			<td>PZN-01320422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electromechanical assessment of optogenetically modulated cardiomyocyte activity

I løpet av de siste to tiårene har optogenetiske verktøy blitt etablert som potente midler for å modulere celle-type spesifikk aktivitet i spennende vev, inkludert hjertet. Mens Channelrhodopsin-2 (ChR2) er et vanlig verktøy for å depolarisere membranpotensialet i kardiomyocytter (CM), har potensielt utløsende virkningspotensialer (AP), et effektivt verktøy for pålitelig deaktivering av CM-aktivitet manglet. Det har blitt foreslått å bruke anion channelrhodopsins (ACR) for optogenetisk hemming. Her beskriver vi en protokoll for å vurdere effekten av å aktivere den naturlige ACR GtACR1 fra Guillardia theta i kultivert ekan cm. Primære avlesninger er elektrofysiologiske patch-klemme opptak og optisk sporing av CM sammentrekninger, begge utført mens du bruker ulike mønstre av lysstimulering. Protokollen inkluderer CM isolasjon fra kanin hjerte, seeding og kuling av cellene i opptil 4 dager, transduksjon via adenovirus koding for lys-gated klorid kanal, utarbeidelse av patch-klemme og karbonfiber oppsett, datainnsamling og analyse. Ved hjelp av patch-clamp teknikken i hele cellen konfigurasjon gjør at man kan registrere lysaktiverte strømmer (i spenning-klemme modus, V-klemme) og AP (strøm-klemme modus, I-clamp) i sanntid. I tillegg til patch-clamp eksperimenter, gjennomfører vi kontraktilitetsmålinger for funksjonell vurdering av CM-aktivitet uten å forstyrre det intracellulære miljøet. For å gjøre dette registreres celler mekanisk forhåndslastet ved hjelp av karbonfibre og sammentrekninger registreres ved å spore endringer i sarkomlengde og karbonfiberavstand. Dataanalyse inkluderer vurdering av AP-varighet fra I-clamp-opptak, toppstrømmer fra V-klemmeopptak og kraftberegning fra karbonfibermålinger. Den beskrevne protokollen kan brukes på testing av biofysiske effekter av forskjellige optogenetiske aktuatorer på CM-aktivitet, en forutsetning for utvikling av en mekanistisk forståelse av optogenetiske eksperimenter i hjertevev og hele hjerter.

GTACR1-eGFP ble uttrykt i kultivert kanin CM (Figur 6 innsats) og fotostrømmer ble målt med patch-clamp teknikken. Photoactivation av GtACR1 viser store innover regisserte strømmer på -74 mV. I figur 6En toppstrøm (IP) ved 4 mW/mm2 er 245 pA. AP ble utløst enten elektrisk (Figur 6B) eller optisk (Figur 6C) med gjeldende injeksjoner 1,5 ganger terskelen, eller korte depolariserende lyspulser på henholdsvis 10 ms. Analysere APD-verdier, elektrisk tempo CM viser en APD 20 av 0,24 ± 0,08 s og en APD 90 på 0,75 ± 0,17 s, mens optisk tempo CM viser en APD 20 av 0,31 ± 0,08 s og en APD 90 av 0,81 ± 0,19 s (SE, n = 5, N = 2, her presentert eksempel APD 20elektrisk = 0,17 s; APD 20optisk = 0,27 s og APD 90elektrisk = 0,61 s; APD 90optisk = 0,68 s; Figur 6D). Optisk tempo CM viser en langsommere AP-innsettende (figur 6D). CM-aktivering ble hemmet ved vedvarende belysning (for 64 s, 4 mW/mm2) ved å polarisere membranpotensialet mot reverseringspotensialet til klorid, her -58 mV (figur 6E). Høyere strøminjeksjoner enn 1,5 ganger terskelen ikke fremkaller AP-generering (figur 6F). Genererte toppkrefter ble bestemt av karbonfiberbøyning (Figur 7B,C,E). CM genererte 232 μN/mm2 ved elektrisk tempo (figur 7B) og 261 μN/mm2 etter optisk tempo (figur 7C). Langvarige pulser med grønt lys hemmer sammentrekninger (figur 7E). Etter optisk hemming for 64 s, reoccurring sammentrekninger generere en lavere kontraktile kraft, og kraftverdier gjenopprette mot baseline etter ~ 10 sammentrekninger (pacing på 0,25 Hz, figur 7D)i tråd med diastolisk kalsium tap fra kanin CM.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> Figur 6: Representative patch-clamp opptak av elektrisk og optisk tempo / hemmet CM. (A) Representativ fotostrøm ved -74 mV med en lyspuls på 300 ms, 4 mW/mm2. IP indikerer toppstrømmen. Innsatsen viser en positiv gtacr1-eGFP-celle. (B) Representativ AP-opptak ved 0 pA ved hjelp av en strømrampe på 10 ms, 0,6 nA for å elektrisk tempo cm. (C) Representativ AP-opptak ved 0 pA ved hjelp av lyspulser på 10 ms, 0,4 mW/mm2. (D) Toppgrafen viser overlegget av 10th AP elektrisk (blå) og optisk (grønn) aktivert CM. AP ble justert med maksimal endring i membranpotensial (dV / dt maks). Bunngrafen viser forskjellen på membranpotensial mellom optisk og elektrisk utløst AP (Eoptisk-Eelektrisk). (E) Elektrisk utløst AP ble hemmet under vedvarende lys på 64 s, 4 mW/mm2. (F) AP hemmes av høyere strøminjeksjoner enn 1,5 ganger terskelen (fra 0,7 nA i trinn på 0,1 nA til 2,2 nA) under vedvarende lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> Figur 7: Representative data fra karbonfiberopptak av optisk og elektrisk tempo/hemmet CM. (A) Vis i datainnsamlingsprogramvaren. Bilde (I) viser den målte CM med vinduet for beregning av sarkomerlengde. Cellebredden er merket i oransje. (1) Rekkevidde av relevante frekvenser. (2) FFT effektspekteret viser frekvensen av sarkomeravstanden på cellen. Den gjennomsnittlige sarkomlengden beregnes fra toppfrekvensen. (3) Sarkomer lengde sporing vindu. (4) Intensitetssporing. (5) Intensitetssporingen multiplisert med et Hamming-vindu er vindusintensitetssporingen. Ordningen (II) viser elliptiske tverrsnitt et av cellen. Bredde i oransje og tykkelse i stiplet blå. Bilde (III) viser plasseringen av karbonfibrene med de respektive deteksjonsboksene, igjen i rødt og høyre i grønt. (6) Intensitetssporing. (7) Første derivat av intensitetssporing (se datainnsamlingsprogramvarehåndbok). (B) Representativspor av elektrisk fremkalte sammentrekninger. Panel (I) viser sarkomerlengde forkortelse, panel (II) avstanden mellom de to karbonfibrene. (C) Representativspor av optisk fremkalte sammentrekninger (525 nm, 0,25 Hz, 10 ms, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarkomerlengde forkortelse, panel (II) avstanden mellom de to karbonfibrene. (D) Generert toppkraft fra sammentrekning 1 til 11 etter en pause forårsaket av hemming av AP-generering. (E) Representativ spor av optisk hemming av sammentrekninger under vedvarende belysning (525 nm, 64 s, 6 mW/mm2). Panel (I) viser sarkomerlengde forkortelse, panel (II) lengden mellom de to karbonfibrene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Området</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acr</td>
			<td>anion channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ap</td>
			<td>handling potensial</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apd (andre kan foregå</td>
			<td>handling potensiell varighet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cfu</td>
			<td>koloni forming enhet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr</td>
			<td>kanalrhodopsin (andre er i gang med</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cm</td>
			<td>kardiomyocyte</td>
		</tr>
<tr>
<td>eAvis eI00</td>
			<td>forbedret grønt fluorescerende protein</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esd</td>
			<td>avslutte systolisk celledeformasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eu</td>
			<td>endotoksinenheter</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>Kraft</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fft</td>
			<td>rask Fourier transform</td>
		</tr>
<tr>
<td>GtaCR (andre kan være på</td>
			<td>Guillardia theta anion channelrhodopsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gui</td>
			<td>grafisk brukergrensesnitt</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-klemme</td>
			<td>strømklemme</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ie</td>
			<td>internasjonale enheter</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moi</td>
			<td>mangfold av infeksjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>poly-HEMA</td>
			<td>poly (2-hydroksyety metakrylat)</td>
		</tr>
<tr>
<td>V-klemme</td>
			<td>spenning-klemme</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 5: Liste over forkortelser.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> Tilleggsfigur 1: Lysintensitetsmålinger med optisk effektmåler. (A) Måling av 10 ms lyspulser ved 4 mW/mm2. (B) Måling av vedvarende belysning på 64 s ved 4 mW/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> Supplerende figur 2: Egenskaper av nyisolert CM og deres strukturelle tilpasning i kultur. (A) AP-opptak av en nyisolert CM (APD 20 av 1,11 ± 0,34 s, APD 90 av 1,96 ± 0,32 s, n = 7, N = 2). Gjennomsnittlig hvilemembranpotensial på -79,3 ± 0,8 mV (n = 7, N = 2). (B) Karbonfiberopptak av en elektrisk tempo, nyisolert CM. Gjennomsnittlig toppkraft på 205 ± 78 μN/mm2 (n = 7, N = 2). (C) Konfokale bilder av en nyisolert CM (I); utransdusert (II) og transdusert (III) CM etter 48 timer i kulturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsmateriale: MatLab-skript for å bestemme APD- og hvilemembranpotensialet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity at JoVE.com

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

Vi presenterer en protokoll for evaluering av de elektromekaniske effektene av GtACR1 aktivering i kanin kardiomyocytter. Vi gir detaljert informasjon om celleisolasjon, kuling og adenoviral transduksjon, og om funksjonelle eksperimenter med patch-clamp og karbonfiber teknikker.

Elektromekanisk vurdering av optogenetisk modulert kardiomycyttaktivitet

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

Ved hjelp av protokollen som en biofysisk effekt av forskjellige optogenetiske aktuatorer på kardiomyocyttaktivitet kan testes for å hjelpe til med utviklingen av optogenetiske eksperimenter i hjertevev og hele hjerter. Ved å kombinere patch klemme teknikk med sarcomere sporing og karbonfiber assistert kraft målinger, kan vi studere effekten av GtACR1 fotoaktivering på elektriske og mekanikk av ventrikulære kardiomyocytter. Optogenetisk hemming kan potensielt brukes til optisk defibrillering.GtACR1 er et optogenetisk verktøy som gjør det mulig å dempe hjerteaktiviteten. Denne teknikken er fullt anvendelig for andre forskningsfelt som glatt og encellede muskelcellestudier. Selv om denne protokollen ikke kan brukes til høy gjennomstrømning screening, det gir et middel for omfattende analyse av kardiomyocyte elektrisk og mekanisk funksjon.Så som det sies, sier et bilde mer enn tusen ord. Hvor mye mer informasjon kan vi komme over i video? Noen av våre verktøy og teknikker involvert i enkelt myocyte stretching og i sonde forberedelse er svært intrikate, og det er mye lettere å formidle dem i en video i forhold til en beskrivelse.Etter at blodet har blitt vasket ut av saltvannet perfused hjerte fra en ni til 10 uker gammel New Zealand hvit kanin, bytte perfusate til en lav-kalsium, høy kalium løsning og perfuse hjertet i to minutter etter at hjertet slutter å slå. Perfuse enzymløsningen, begynn å resirkulere enzymoppløsningen tilbake i reservoaret etter to minutter med fordøyelse, og reduser hastigheten til 16 milliliter per minutt etter fem minutter med fordøyelse. Når vevet vises mykt etter 40-50 minutter med fordøyelsen, kutt hjertet av kanylen og legg umiddelbart hjertet i blokkerende løsning.Tilsett blokkeringsløsning til vevet er fullt dekket. Klipp av høyre ventrikkel og septum og skill venstre ventrikkel. Fjern papillære muskler og bruk fine tang og en pipette for å forsiktig trekke fra hverandre vevet for å frigjøre cellene ved mekanisk dissosiasjon.Filtrer cellefjæringen gjennom et nett med en millimeter kvadrerte porer og sedimenter cellene ved sentrifugering. Deretter resuspend cardiomyocyte pellet i fersk blokkering løsning. For et patch clamp eksperiment, pels autoklavert dekkerlips i en petriskål med 100 mikrogram per milliliter laminin umiddelbart før cellekultur.For karbonfibereksperiment, coat Petri retter med 0,12 gram per milliliter poly-HEMA i en 95-til-fem etanol-til-vann løsning. Ti til 15 minutter etter resususpending cardiomyocytes, fjern supernatant og resuspend cellene i kultur medium. Etter telling, frø cellene på en coverslip i en petriskål med en måltetthet på 1,75 ganger 10 til de fire cellene per milliliter.Inkuber kulturene i tre til fire timer ved 37 grader Celsius og 5%karbondioksid. På slutten av inkubasjonen erstatter du mediet fra dekkslipkulturene med friskt medium som inneholder adenovirus type fem koding for GtACR1-eGFP ved et mangfold av infeksjon på 75. Returner kulturene til inkubatoren i 48 timer.For å utføre et patch klemmeeksperiment, bruk en mikropipetteavtrekker til å trekke 1,7 til 2,5 megaohm patch pipetter fra brus lime glass kapillærer og initialisere datainnsamlingsprogramvaren. Plasser en dekkslip med celler i målekammeret som inneholder ekstern løsning og velg kardiomyocytten basert på eGFP-fluorescensen. Fyll deretter en patchpipette med intern oppløsning og fest pipetten til pipetteholderen som setter inn den sølvkloridbelagte sølvopptaksledningen i den indre løsningen.Sett membrantesten til å bruke 10 millivoltpulser i 15 millisekunder med en grunnlinje på null millivolt. Når du har nådd den celletilkoblede konfigurasjonen, bytter du til hele cellemodus med et holdingpotensial på minus 60 millivolt i datainnsamlingsprogramvaren. Deretter påfør forsiktig negativt trykk for å få tilgang til hele cellekonfigurasjonen ved å rupturme membranen.Et vellykket brudd vil bli dokumentert av en umiddelbar økning i den målte kapasitansen. Registrer fotoaktiveringsprotokoller i spenningsklemmemodus ved minus 74 millivolt med lyspulser på 300 millisekunder eller handlingspotensialer i gjeldende klemmemodus ved null picoampere. For å produsere karbonfibrene, monter pipetten først på pipetteholderne på avtrekkeren.Trekk glasskapillærer i to pipetter med en total konisk lengde på ca. 11 millimeter og en endelig indre diameter på ca. 30 mikrometer. Deretter bruker du et stereomikroskop til å justere en kapillær i orienteringssirkelen og bøye det med opptil 45 grader ved å skyve ned på spissen av kapillæren med en bender. Varm opp filamentet til kapillæren opprettholder 45 graders vinkel selv etter at bøyeren er fjernet.Etter å ha bøyd kapillæren, bruk fine tang utstyrt med myke slanger for å ta en karbonfiber ut av røret og sett den inn i den fine spissen av kapillæren. Skyv fiberen i kapillæren opp til svingen. Klipp karbonfibrene slik at de projiserer to milliliter fra spissen av kapillæren og bruk cyanoacrylatlim for å fikse fibrene til den fremre delen av hver kapillær.For å kalibrere fibrene, fest en kapillær til en holder kontrollert av en mikromanipulator og en piezomotor. Flytt kapillæren mot sensoren og juster den i forhold til sensoren. Plasser tuppen av fiberen i kontakt med kraftsensoren uten å produsere noen kraft.Den totale bevegelsen av piezo motoren er 60 mikrometer. Flytt piezomotoren i seks 10 mikrometertrinn mot kraftsensoren. Sensoren har en følsomhet på 0,05 millinewtons per volt og et kraftområde på null til 0,5 millinewtons.Les ut den målte spenningen for hvert trinn og fjern karbonfiberen fra sensoren. For å registrere kraften i kontraherende kardiomyocytter, belegge overflaten av et dekkglass med Poly-HEMA og plasser den i målekammeret. Fyll kammeret med ekstern bad løsning.Fest begge karbonfiberbelastede kapillærer til scenen mikromanipulator og justere dem i en vinkel slik at karbonfibrene er nær horisontal til overflaten av målekammeret. For å sjekke om fibrene er riktig justert, fokuser på overflaten av målekammeret, senk den første fiberen og flytt fiberen horisontalt. Tuppen av fiberen skal gli på overflaten av målekammeret.Følg samme prosedyre for den andre fiberen. Med lysene av, legg til noen dråper kultivert cellefjæring til kammeret og bruk korte grønne lyspulser for å velge celler som kontrakt som svar på grønn lysstimulering. For å feste den første fiberen, komprimer forsiktig cellen ved å senke fiberen og slipp deretter trykket.Fest den andre fiberen parallelt med den første i den andre enden av kardiomyocytten for å ha maksimalt antall sarkomer mellom de to fibrene. Etter at begge fibrene er festet, løft fibrene slik at cellen ikke lenger er i kontakt med kammeroverflaten. Sett sarkomene i fokus, sett det sarcomere lengde sporingsvinduet mellom fibrene, og bruk kantdeteksjonsmodulen til å spore fiberbøyingen.Sett deteksjonsområdene med de røde og grønne vinduene og definer en terskel ved første derivat av lysintensitetssporingen. Optisk tempo cellen mens du sporer sarcomere lengde og fiber bøying. I dette tilfellet, vi tempoet på 0,25 hertz.Etter å ha spilt inn minst 15 optisk fremkalte sammentrekninger, stimulerer feltet cellen elektrisk. Finn terskelen for å eliciting sammentrekningene og bruke 1,5 ganger terskelspenningen for elektrisk tempo. For en hemmingsprotokoll, bruk elektriske stimuli for å fremkalle sammentrekninger og deretter utsette cellen for en vedvarende lyspuls ved ulike lysintensiteter.Registrer minst 15 sammentrekninger etter lysindusert hemming. GtACR1 uttrykkes i kultiverte kaninkardiomyocytter. GtACR1 fotoaktivering med en lysintensitet på fire milliwatt per millimeter kvadrert for 300 millisekunder resulterer i store innoverrettede strømmer på minus 74 millivolt med en målt toppstrøm på 245 picoampere.I dette representative eksperimentet ble handlingspotensialer utløst enten elektrisk med nåværende injeksjoner 1,5 ganger terskelen eller optisk med 10 millisekundlyspulser. Optisk tempo cardiomyocytes viste en langsommere virkningspotensial utbruddet. Elektrisk utløste virkningspotensialer ble hemmet under vedvarende lys.Høyere strøminjeksjoner og 1,5 ganger terskelen under vedvarende lyssøknad fremkaller heller ikke handlingspotensialer. Kardiomyocytten genererte en sammentrekningskraft på 232 mikronewtons per millimeter firkantet ved elektrisk tempo og 261 mikronewtonn per millimeter kvadrert etter optisk tempo. Langvarige grønne lyspulser hemmet sammentrekningene med etterinhiberingssammentrekningene som genererer en lavere kontraktil kraft i tråd med diastolisk kalsiumtap fra kaninkardiomyocytter.Vi anbefaler at det kan være utfordrende å praktisere teknikkene før du gjennomfører et eksperiment, spesielt ettersom det kan være utfordrende å plassere mikroprobene i mørket. er svært viktig når du analyserer kardiomyocytt kontraktilitet som det kan påvirke kraftproduksjon og avslapning. Ulike etterbelastninger kan også brukes for isotonisk og auxotonisk sammentrekningsanalyse.Disse teknikkene tillater karakterisering av de biofysiske effektene av å aktivere nyutviklede optogenetiske aktuatorer i kardiomyocytter som er avgjørende for å velge det mest passende optogenetiske verktøyet for hvert eksperiment. Vær oppmerksom på at adenovirustransduksjon og alle trinnene etter transduksjonen skal utføres under biosikkerhetsnivå II forhold.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

A Novel Application of Musculoskeletal Ultrasound Imaging

A Novel Anvendelse av Muskel ultralyd Imaging

Ultrasound is an attractive modality for imaging muscle and tendon  motion during dynamic tasks and can provide a complementary methodological  approach ...

Ultrasonic Assessment of Myocardial Microstructure

Ultralyd vurdering av myokard mikrostruktur

Echocardiography is a widely accessible imaging modality that is commonly used to noninvasively characterize and quantify changes in cardiac structure and ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transkutan vurdering av nyrefunksjonen hos bevisste Gnagere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Contractions of Human-iPSC-derived Cardiomyocyte Syncytia Measured with a Ca-sensitive Fluorescent Dye in Temperature-controlled 384-well Plates

Sammentrekninger av Human-iPSC-avledet Cardiomyocyte Syncytia målt med et Ca-sensitive fluorescerende fargestoff i temperaturkontrollerte 384-vel plater

Spontaneously contracting syncytia of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) are a useful model of human cardiac ...

Non-invasive Assessment of Dorsiflexor Muscle Function in Mice

Ikke-invasiv vurdering av Dorsiflexor muskel funksjon i mus

Assessment of skeletal muscle contractile function is an important measurement for both clinical and research purposes. Numerous conditions can negatively ...

Ultrasonographic Assessment During Cardiopulmonary Resuscitation

Ultrasonografisk vurdering under hjerte-lungeredning

The US-CAB (Ultrasound, Circulation/Airway/Breathing) protocol integrates several sonographic techniques into a structured assessment of the circulation, ...

Model of Ischemic Heart Disease and Video-Based Comparison of Cardiomyocyte Contraction Using hiPSC-Derived Cardiomyocytes

Modell av iskemisk hjertesykdom og videobasert sammenligning av kardiomyocytter sammentrekning ved hjelp av hiPSC-avledede kardiomyocytter

Ischemic heart disease is a significant cause of death worldwide. It has therefore been the subject of a tremendous amount of research, often with ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Providing Visual Biofeedback Using Brightness Mode Ultrasound During a Golf Swing

Gi visuell biofeedback ved hjelp av lysstyrkemodus ultralyd under en golfsving

Using ultrasound biofeedback in conjunction with verbal cueing can increase muscle thickness more than verbal cueing alone and may augment traditional ...