Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China-stamcel- en translationeel onderzoek [subsidienummer 2016YFA0102300 (aan Jun Yang)];de Nature Science Foundation of China [subsidienummer 81870051, 81670054 (aan Jun Yang)]; het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [subsidienummer 2016-I2M-4-003 (aan Jun Yang)]; de PUMC Youth Found en de Fundamental Research Funds voor de Central Universities [subsidienummer 2017310013 (aan Fang Zhou)].

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Research Ethics Committee van de Zhejiang University school of medicine.
1. Whole-mount in situ hybridisatie
<ol><li>De lijnhouderij en de reproductie van zebravissen<ol>
<li>Voer en verhoog alle volwassen zebravissen bij 26-28 °C in een recirculerend aquacultuursysteem met 14 uur licht/10 uur donkere cyclus voor elke dag. Gebruik AB (wild-type) zebravis lijnen voor de volgende procedures.</li>
		<li>Leg een laag steentjes in de bodem v...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Dit protocol paste een verbeterd whole-mount in situ RNA analyseplatform toe voor zebravissen en buisvormingstesten op iPSC-ECs afkomstig van een HHT-patiënt. De traditionele ISH-methode vereist een langere experimentele cyclus met extra experimentele stappen. Het protocol heeft een aantal belangrijke verbeteringen, het gebruik van onafhankelijke dubbele Z-sondes en iPSC's afkomstig van een patiënt met HHT die respectievelijk werden toegepast in WISH-tests en buisvorming. Deze verfijningen zijn cruciaal voor het verbet...

Een enkele mutatie op eng (CD105) is gemeld bij patiënten met HHT. De mutatie leidt tot een grotere proliferatie van de EG en tot een verminderde doorstroom gemedieerde EG-verlenging1,2. Het is ook eerder gemeld dat ENG-deficiëntie de expressie van endotheelmarkeringen vermindert (d.w.z. kdrl, cdh5, hey2) bij zebravis3. Endoglin, voornamelijk uitgedrukt in endotheelcellen, is een transmembrane glycoproteïne en functioneert als een co-receptor voor het transformeren van groeifactor β (TGF-β) familieleden. Het stuurt BMP9 binding op het celoppervlak te reguleren downstream gen, met inbegrip van Id1 expressie, om stamcel differentiatie te induceren in de richting van ECs4. Zo speelt het eng-gen een belangrijke rol bij vasculogenese en menselijke vasculaire aandoeningen5,6. We hebben eerder de effecten onderzocht van endoglin knockdown op de vorming van bloedvaten in zebravisembryo's, gevolgd door een analyse van door iPSCs afgeleide ECs die is verkregen van een HHT-patiënt met een eng-mutatie 7. Dit protocol toont de effecten aan van ENG-deficiëntie op endotheelverermarkeringsexpressie en buisvorming, een kwantificeerbare methode voor het meten van in vitro angiogenese.
Om ruimtelijke eng-expressie te bestuderen, wordt WISH gebruikt om genexpressie in vivo8te detecteren. In situ hybridisatie (ISH) is een methode voor het gebruik van gelabelde sondes met complementsequenties van doelkernzuren (DNA of mRNA) om doelkernzuurhybriden in een vast monster te detecteren en te visualiseren. Het proces versterkt genexpressiesignalen in vivo en wordt gebruikt om de expressie van genen door microscopie te detecteren. WISH is op grote schaal gebruikt in verschillende modeldieren, vooral in zebravis9. Het wordt ook gebruikt om de volgende gegevens te verwerven: 1) gen ruimtelijke / temporele expressie patronen, die informatie over genfunctie en classificatie; en 2) specifiek uitgedrukte genmarkers die worden gebruikt bij high-throughput drug of mutant screening10.
Chromogene sondes worden gemakkelijk afgebroken met traditionele chromosoom in situ hybridisatie (CISH), wat resulteert in hoge achtergrondgeluid en niet-specifieke signalen11,12. De WISH-methode maakt gebruik van twee onafhankelijke dubbele Z-sondes, die zijn ontworpen om te hybridiseren om RNA-sequenties te targeten. Elke sonde bevat een 18-25 sequentie complementair aan het doel RNA en een 14 base staart sequentie (geconceptualiseerd als Z). De doelsondes worden gebruikt in een paar (dubbel Z). De twee staartsequenties vormen samen een 28 base hybridisatie site voor de voorversterker, die 20 bindingsplaatsen voor de versterker bevat. De versterker bevat op zijn beurt 20 bindingsplaatsen voor de labelsonde en kan in theorie tot 8.000 labels opleveren voor elke doelRNA-sequentie.
Deze geavanceerde technologie vergemakkelijkt gelijktijdige signaalversterking en achtergrondonderdrukking om visualisatie van één molecuul te bereiken met behoud van weefselmorfologie13. Verdere wijziging van de WISH-methoden is gebaseerd op eerder onderzoek14, inclusief extra fixatie en DAB-kleuring. Hier is een verbeterde WISH protocol dat kan werken, zelfs als het doel RNA is gedeeltelijk verlaagd of gedegradeerd. Voordelen zijn onder meer dat het kan worden voltooid in 24 uur zonder RNase-vrije voorwaarden. Signalen kunnen ook gelijktijdig worden gedetecteerd via meerdere kanalen van meerdere doelen, en de resultaten zijn consistent en compatibel met resultaten van verschillende high-throughput automatiseringsplatforms.
Resultaten van diermodellen zijn niet nodig en weerspiegelen hetzelfde fenomeen dat bij de mens voorkomt. ENG bevat twee paren geconserveerde cysteines, C30-C207 en C53-C182, die disulfide bruggen vormen in weesgebieden. Om de rol van eng bij HHT-patiënten verder te bestuderen, zijn buisvormingstesten uitgevoerd met iPSC's afkomstig van HHT-patiënten in cellen zonder/met engmutaties (Cys30Arg, C30R)15. Nadat Kubota et al. voor het eerst het buisvormingsexperiment16rapporteerde, is de test op verschillende manieren ontwikkeld. Het is gebruikt om angiogene of antiangiogene factoren te identificeren, de signaleringstrajecten in angiogenese te definiëren en genen te identificeren die angiogenese17reguleren.
Voorafgaand aan de beschikbaarheid van door patiënten afgeleide iPSC-IC's gebruikten onderzoekers voornamelijk gekweekte ECs om angiogensis16te bestuderen. Voor endotheelcellen is het echter een technische uitdaging om exogene genen met een virus te transduceren, vanwege het beperkte passageaantal dat EC's kunnen ondergaan. Dit komt omdat er nauwelijks genoeg cellulair materiaal te verzamelen uit menselijke vaten, hetzij uit een operatie of gematched goedgekeurde donoren. Met de uitvinding van de iPSC generatie techniek door Shinya Yamanaka, menselijke ECs afgeleid van iPSCs kan betrouwbaar worden gebruikt in in vitro experimenten, zoals eerder gemeld18.
Het gebruik van viraal getransduceerde ECs's met beperkte aantallen en passages kan voldoende zijn voor signaleringsstudies, maar voor functionele studies is het beter om gemuteerde pluripotente stamcellijnen te genereren (iPSCs of CRISPER/Cas9-gerichte hESCs), en ze vervolgens te differentiëren in ECs voor angiogenesestudies die gebruik maken van buisvormingsanalyses19. Buisvorming kan worden gebruikt om de functie van endotheelcellen met mutaties te evalueren. Dit protocol beschrijft ook buisvorming op een μ-slide angiogeneseplaat, wat een eenvoudige, kosteneffectieve en reproduceerbare methode is.
Het onderstaande protocol biedt een betrouwbare en systemische methode voor het bestuderen van de rol van specifieke genen in vasculaire vorming, samen met details voor in vivo expressiepatroon en in vitro functionele kwantificering voor het modelleren van menselijke ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

Vasculaire ontwikkeling wordt bepaald door de sequentiële expressie van specifieke genen, die kan worden bestudeerd door het uitvoeren van in situ hybridisatietesten bij zebravissen tijdens verschillende ontwikkelingsstadia. Om de rol van endoglin(eng) in de vorming van bloedvaten tijdens de ontwikkeling van erfelijke hemorragische telangiectasia (HHT) te onderzoeken, worden morfoino-gemedieerde gerichte knockdown van eng in zebravissen gebruikt om de temporele expressie en bijbehorende functies te bestuderen. Hier wordt whole-mount in situ RNA hybridisatie (WISH) gebruikt voor de analyse van eng en zijn downstream genen in zebravis embryo's. Ook worden buisvormingstesten uitgevoerd in HHT-geïnduceerde pluripotente stamcelgedifferentieerde endotheelcellen eng (iPSC-ECs; met engmutaties). Een specifiek signaalversterkend systeem met behulp van de hele hoeveelheid In Situ Hybridization – WISH biedt een hogere resolutie en lagere achtergrondresultaten in vergelijking met traditionele methoden. Om een beter signaal te verkrijgen, wordt de post-fixatietijd aangepast tot 30 min na de hybridisatie van de sonde. Omdat fluorescentievlekken niet gevoelig zijn in zebravisembryo's, wordt deze hier vervangen door diaminobezidine (DAB) vlekken. In dit protocol worden HHT-door patiënten afgeleide iPSC-lijnen die een engmutatie bevatten, gedifferentieerd in endotheelcellen. Na het coaten van een plaat met keldermembraanmatrix voor 30 min bij 37 °C, worden iPSC-IC's als monolaag in putten gezaaid en 3 uur lang op 37 °C gehouden. Vervolgens worden de buislengte en het aantal takken berekend aan de hand van microscopische afbeeldingen. Met dit verbeterde WISH-protocol wordt dus aangetoond dat verminderde eng-expressie de enotheliale voorlopervorming in zebravisembryo's beïnvloedt. Dit wordt verder bevestigd door buisvormingstesten met behulp van iPSC-ECs afkomstig van een patiënt met HHT. Deze testen bevestigen de rol voor eng in de vroege vasculaire ontwikkeling.

Hele mount in situ hybridisatie is gebaseerd op een principe vergelijkbaar met fluorescentie resonantie energieoverdracht. Het is ontworpen om zowel de gevoeligheid en specificiteit in zebravissen ISH te verbeteren als doelspecifieke signalen te versterken zonder het achtergrondsignaal te beïnvloeden.
In 24 hpf zebrafish embryo's, endoglin is sterk uitgedrukt in de achterste kardinaal ader (PCV), intersegmentale bloedv...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hier gepresenteerd is een protocol voor whole-mount in situ RNA hybridisatie analyse in zebravis en buisvorming test in patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen om de rol van endoglin in vasculaire vorming te bestuderen.

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

De hele mount, in situ hybridisatie, WISH, biedt een hoge resolutie en een laag achtergrondresultaat in vergelijking met traditionele methoden. Ook U-slide platen verbeteren van de focus op dezelfde brandpuntsafstand met behulp van minder WISH kan worden toegepast op muis embryo's, Drosophila embryo's en andere weefsel moeilijk te hanteren. De buisvormingstest kan worden toegepast op stamcel gedifferentieerde androgeencellen.WISH maakt het gemakkelijk om de functionele betekenis van mutatiecorrectie te begrijpen. De persoon die de procedure zal aantonen is Yong Wang, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium. Onder een microscoop werkend, gebruikt u het FemtoJet-systeem om twee nanogrammen Morpholinos en 500 picogrammen van MRNA in ééncellige embryo's te injecteren.Oefen de microinjectie van Morpholinos vele malen totdat je het injecteren in cellen met succes en houd de integriteit van de eieren. Broed de zygotes tot ze gedechorioneerd zijn en bereik de staat van ontwikkeling die overeenkomt met het beoogde experiment. Zoals beschreven in tabel een van het manuscript.Gebruik vervolgens een plastic pipet om 20 tot 40 embryo's over te brengen naar een buis van 1,5 milliliter. Voeg een milliliter vers bereide 4%PFA-oplossing toe bij kamertemperatuur. Na het bevestigen, wassen en dehydrateren van de embryo's zoals beschreven in het manuscript, plaats de embryo's in een zeef met nylon gaas aan de onderkant.Hydrateer de embryo's door ze achtereenvolgens te wassen in 75%50% en 25% methanol gedurende elk vijf minuten. Voeg na het wassen van de embryo's met PBST 50 microliter proteinase K toe aan de buis met de embryo's. Verwijder na de spijsvertering de proteinase K en was de embryo's met PBST telkens drie keer gedurende vijf minuten.Voeg 50 tot 100 microliter gemengde doelsondes toe aan elke buis met de embryo's. Broed de embryo's 's nachts op 40 graden Celsius. Na het wassen van de embryo's zoals beschreven in het manuscript, gebruik 4%paraformaldehyde om de embryo's gedurende 30 minuten op kamertemperatuur te fixeren.Was vervolgens de embryo's in 2x SSCT oplossing drie keer gedurende 15 minuten elke keer op kamertemperatuur. Verwijder de SSCT-oplossing en vervang deze door 50 microliters van Amp 1. Broed de embryo's vervolgens uit op 40 graden Celsius.Na 30 minuten was je de embryo's drie keer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 2x SSCT-oplossing. Verwijder de SSCT-oplossing en voeg 50 microliters van Amp 2 toe. Na 15 minuten uitbroeden en het embryo wassen zoals eerder gedaan, voeg 50 microliter van Amp 3 toe en tik voorzichtig op de buis.Broed de embryo's uit op 40 graden Celsius. Na 30 minuten was je de embryo's zoals eerder beschreven. Voeg vervolgens 50 microliter van Amp 4 dropwise toe en tik voorzichtig op de buis.Vervolgens broeden de embryo's op 40 graden Celsius gedurende 15 minuten en was ze drie keer met SSCT. Gebruik na het voorbereiden van de embryo's voor beeldvorming zoals beschreven in het manuscript een DAB peroxidase substraatkit om het monster te bevlekken. Voeg 50 microliter elk van kleur reagentia A, B en C aan een milliliter gedestilleerd water.En meng goed om een complete DAB werkvloeistof te verkrijgen. Voeg de vloeistof toe aan het monster en bedek gedurende tien minuten. Na het grondig wassen van de exemplaren, gebruik maken van een optische microscoop om ze beeld.Om te beginnen met het kweken en controleren van HHT iPSCs, voeg kelder membraan matrix aan zes goed cel cultuur platen aan de onderkant van de putten te dekken. Broed de platen een uur lang in bij 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens de gebruikte keldermembraanmatrixoplossing uit de putten en voeg twee milliliter mTesr 1-medium toe aan elke put.Dan plaat de iPSCs geoogst uit de laatste passage op ongeveer een keer tien tot de zes cellen per goed. Na het kweken van de iPSC's voor ongeveer vier dagen, uitwisseling van de cel cultuur medium met aangevuld BEL medium. Laat de cellen drie dagen groeien om mesodermcellen te genereren.Om vasculaire endotheelcellen uit te breiden, vervang het medium gedurende vier dagen door het bijgevulde BEL-medium. En behandel de cellen dan nog drie tot vier dagen met hetzelfde medium en dezelfde cultuur. Zuiveren van de volwassen vasculaire endotheelcellen met behulp van CD31 Dynabeads volgens de kit instructies.Verzamel vervolgens de CD31 positieve cellen door elutie buffer. Onderhoud en breid de gezuiverde endotheelcellen in EC-SFM medium met VEGF165, bFGF en FBS. Om de endotheelcellen te plaat, beginnen met het toevoegen van 10 microliter van kelder membraan matrix per goed aan de angiogenese platen.Broed de platen 30 minuten op 37 graden Celsius. Oogst de endotheelcellen en resuspend ze in endotheel groeimedium 2 door herhaaldelijk te pipetten. Voeg 50 microliter van deze celsuspensie toe aan de gestolde matrix in elke put en broed de cellen vervolgens uit op 37 graden Celsius.Gebruik na drie tot vijf uur incubatie een microscoop met hoge resolutie om de vorming van endotheelbuis te beoordelen. Maak beelden van ten minste tien gebieden voor elke groep. Inspecteer de totale buislengte, buisnummer en vertakkingspunten.CISH en WISH werden uitgevoerd om de expressie van endoglin te bepalen in 24-uurs post-fertilization embryo's. Een hemogene endotheelmarkering en een endotheelverermarkering werden gebruikt om het effect van endoglin uitschakeling te onderzoeken. De rode pijlen geven gebieden aan waar de expressie van deze markeringen, aplnrna en npr1a, aanzienlijk is afgenomen.De endotheel buisvormingstest werd uitgevoerd op de endoglin mutant en controle iPSC-afgeleide endotheelcellen. Buisvorming werd na drie uur beoordeeld en gefotografeerd. Buislengte, buisnummer en vertakking werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.Gemuteerde endotheelcellen vormden minder takken dan controle endotheelcellen. En takken in gemuteerde endotheelcellen aanzienlijk toegenomen na stimulatie met vasculaire endotheel groeifactor. Deze methode kan ook worden gebruikt voor iPS generatie van perifeer bloed.En door de methode verduidelijkt de rol van endocriene in vasculaire vorming in vitro en in vivo. Wetende dat het corrigeren van de mutatie een verschil kan maken in angiogenese, is het mogelijk om de cellen terug te transplanteren in patiënten voor mogelijke stamceltherapie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...