Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [grant number 2016YFA0102300 (to Jun Yang)];the Nature Science Foundation of China [grant number 81870051, 81670054 (to Jun Yang)]; le Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (CIFMS) [numéro de subvention 2016-I2M-4-003 (à Jun Yang)]; le PUMC Youth Found and the Fundamental Research Funds for the Central Universities [numéro de subvention 2017310013 (à Fang Zhou)].

Toutes les expériences animales décrites ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche de l’École de médecine de l’Université du Zhejiang.
1. Hybridation in situ à monture entière
<ol><li>Élevage et reproduction de lignes de poissons zèbres<ol>
<li>Nourrir et élever tous les poissons zèbres adultes à 26-28 oC dans un système aquacole recirculant avec 14 h de lumière/10 h cycle sombre pour chaque jour. Utilisez des lignes de poissons zèbres AB (de type s...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. 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K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Ce protocole a appliqué une plate-forme d’analyse in situ améliorée de l’ARN à montage entier pour les essais de formation de poissons zèbres et de tubes sur iPSC-ECs dérivés d’un patient HHT. La méthode ISH traditionnelle nécessite un cycle expérimental plus long avec des étapes expérimentales supplémentaires. Le protocole a quelques améliorations importantes, l’utilisation de sondes Z doubles indépendantes et iPSCs dérivés d’un patient présentant HHT qui ont été appliqués dans les essais ...

Une mutation simple sur eng (CD105) a été rapportée dans les patients présentant HHT. La mutation conduit à une prolifération accrue de la CE et à une réduction de l’allongement de l’EC négocié par le flux1,2. Il a également été précédemment signalé que l’insuffisance ENG réduit l’expression des marqueurs endothéliaux (c.-à-d., kdrl, cdh5, hey2) dans le poisson zèbre3. Endoglin, principalement exprimée dans les cellules endothéliales, est une glycoprotéine transmémbrane et fonctionne comme un co-récepteur pour transformer le facteur de croissance (TGF-MD) membres de la famille. Il ordonne bMP9 liaison sur la surface cellulaire pour réguler le gène en aval, y compris l’expression Id1, pour induire la différenciation des cellules souches vers les CE4. Ainsi, le gène eng joue des rôles importants dans la vasculogenèse et la maladie vasculaire humaine5,6. Nous avons déjà examiné les effets de l’endoglin knockdown sur la formation de vaisseaux dans les embryons de poissons zèbres, suivie par l’analyse des CPE dérivés d’iPSC acquis à partir d’un patient HHT portant une mutation eng 7. Ce protocole démontre les effets de l’insuffisance d’ENG sur l’expression et la formation de marqueur d’ancêtre endothélial, qui est une méthode quantifiable pour mesurer l’angiogenèse in vitro.
Pour étudier l’expression spatiale et temporelle, WISH est utilisé pour détecter l’expression des gènes in vivo8. L’hybridation in situ (ISH) est une méthode d’utilisation de sondes étiquetées avec des séquences complètes d’acides nucléiques cibles (ADN ou ARNM) pour détecter et visualiser les hybrides d’acide nucléique cible dans un spécimen fixe. Le processus amplifie les signaux d’expression génique in vivo et est utilisé pour détecter l’expression des gènes par microscopie. WISH a été largement utilisé dans divers animaux modèles, en particulier dans le poisson zèbre9. Il est également utilisé pour acquérir les données suivantes : 1) les modèles d’expression spatiale/temporelle des gènes, qui fournissent des informations sur la fonction et la classification des gènes; et 2) ont expressément exprimé des marqueurs génétiques qui sont utilisés dans le dépistage de drogue ou de mutant à haut débit10.
Les sondes chromogéniques sont facilement dégradées avec l’hybridation in situ chromosomique traditionnelle (CISH), ce qui entraîne un bruit de fond élevé et des signaux non spécifiques11,12. La méthode WISH utilise deux sondes doubles Z indépendantes, qui sont conçues pour s’hybrider pour cibler les séquences d’ARN. Chaque sonde contient une séquence de 18-25 complémentaire à l’ARN cible et une séquence de queue de base de 14 (conceptualisée comme Z). Les sondes cibles sont utilisées en paire (double Z). Les deux séquences de queue ensemble forment un site d’hybridation de base de 28 pour le préamplificateur, qui contient 20 sites de liaison pour l’amplificateur. L’amplificateur, à son tour, contient 20 sites de liaison pour la sonde d’étiquette et peut théoriquement donner jusqu’à 8.000 étiquettes pour chaque séquence d’ARN cible.
Cette technologie de pointe facilite l’amplification simultanée du signal et la suppression de fond pour réaliser la visualisation d’une seule molécule tout en préservant la morphologie des tissus13. D’autres modifications des méthodes WISH sont basées sur des recherches antérieures14, y compris la fixation supplémentaire et la coloration DAB. Il est prévu ici un protocole WISH amélioré qui peut fonctionner même si l’ARN cible est partiellement diminué ou dégradé. Les avantages incluent qu’il peut être complété en 24 h sans conditions sans RNase. Les signaux peuvent également être détectés simultanément par plusieurs canaux à partir de plusieurs cibles, et les résultats sont cohérents et compatibles avec les résultats de différentes plates-formes d’automatisation à haut débit.
Les résultats des modèles animaux ne reflètent pas nécessaire le même phénomène qui se produit chez l’homme. ENG contient deux paires de cystéines conservées, C30-C207 et C53-C182, qui forment des ponts de disulfide dans les régions orphelines. Pour étudier plus en plus le rôle de l’eng dans les patients HHT, les essais de formation de tube avec des iPSCs dérivés des patients de HHT ont été exécutés dans des cellules sans/avec des mutations d’eng (Cys30Arg, C30R)15. Après Kubota et coll. ont d’abord rapporté l’expérience de formation de tube16, l’essai a été développé de plusieurs façons. Il a été utilisé pour identifier les facteurs angiogéniques ou antiangiogéniques, définir les voies de signalisation dans l’angiogenèse, et identifier les gènes régulant l’angiogenèse17.
Avant la disponibilité des iPSC-ECs d’origine patiente, les chercheurs utilisaient principalement des EC cultivés pour étudier l’angiogénèse16. Cependant, pour les cellules endothéliales, il s’agit d’un défi technique de transduire des gènes exogènes avec un virus, en raison du nombre de passage limité que les CE peuvent subir. C’est parce qu’il n’y a guère assez de matériel cellulaire pour être recueilli à partir de vaisseaux humains soit de la chirurgie ou des donneurs approuvés appariés. Avec l’invention de la technique de génération iPSC par Shinya Yamanaka, ECs humains dérivés d’iPSC peuvent être utilisés de manière fiable dans des expériences in vitro, comme indiqué précédemment18.
L’utilisation de CPE transduits viralement avec un nombre et des passages limités peut être suffisante pour les études de signalisation, mais pour les études fonctionnelles, il est préférable de générer des lignées de cellules souches pluripotentes mutantes, (iPSCs ou CRISPER/Cas9-ciblé hESCs), puis les différencier en ECs pour les études d’angiogenèse qui utilisent des essais de formation de tube19. La formation de tube peut être employée pour évaluer la fonction des cellules endothéliales portant des mutations. Ce protocole décrit également la formation de tubes sur une plaque d’angiogenèse à glissement de diapositive, qui est une méthode facile, rentable et reproductible.
Le protocole ci-dessous fournit une méthode fiable et systémique pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans la formation vasculaire, ainsi que des détails pour le modèle d’expression in vivo et la quantification fonctionnelle in vitro pour la modélisation des maladies humaines.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

Le développement vasculaire est déterminé par l’expression séquentielle de gènes spécifiques, qui peuvent être étudiés en effectuant des essais d’hybridation in situ dans le poisson zèbre au cours de différents stades de développement. Pour étudier le rôle de l’endoglin (eng) dans la formation des navires pendant le développement de la telangiectasia hémorragique héréditaire (HHT), le renversement ciblé morpholino-négocié de l’eng dans le poisson zèbre sont utilisés pour étudier son expression temporelle et les fonctions associées. Ici, l’hybridation in situ de l’ARN à monture entière (WISH) est utilisée pour l’analyse de l’eng et de ses gènes en aval chez les embryons de poissons zèbres. En outre, les essais de formation de tube sont exécutés dans les cellules pluripotentes pluripotentes induites de HHT-dérivées d’endothéliale d’endothelial (iPSC-ECs ; avec des mutations d’eng). Un système spécifique d’amplification du signal utilisant la quantité entière d’hybridation In Situ - WISH fournit une résolution plus élevée et des résultats de fond inférieurs par rapport aux méthodes traditionnelles. Pour obtenir un meilleur signal, le temps de post-fixation est ajusté à 30 min après l’hybridation de la sonde. Parce que la coloration de fluorescence n’est pas sensible dans les embryons de poissons zèbres, elle est remplacée par la diaminobezidine (DAB) colorant ici. Dans ce protocole, les lignes iPSC hHT-dérivées du patient contenant une mutation d’eng sont différenciées en cellules endothéliales. Après avoir recouvert une plaque de matrice de membrane du sous-sol pendant 30 min à 37 oC, les iPSC-ECs sont ensemencés en monolayer dans des puits et conservés à 37 oC pendant 3 h. Ensuite, la longueur du tube et le nombre de branches sont calculés à l’aide d’images microscopiques. Ainsi, avec ce protocole WISH amélioré, il est démontré que l’expression réduite eng affecte la formation d’ancêtres endothéliaux dans les embryons de poissons zèbres. Ceci est encore confirmé par les essais de formation de tube utilisant iPSC-ECs dérivés d’un patient présentant HHT. Ces essais confirment le rôle de l’eng dans le développement vasculaire précoce.

L’hybridation in situ de montage entière est basée sur un principe semblable au transfert d’énergie de résonance de fluorescence. Il est conçu pour améliorer à la fois la sensibilité et la spécificité dans le poisson zèbre ISH ainsi que d’amplifier les signaux spécifiques à la cible sans affecter le signal de fond.
Dans 24 embryons de poissons zèbres hpf, l’endoglin est fortement exprimé dans la v...

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Présenté ici est un protocole pour l’analyse in situ entière d’hybridation d’ARN in situ dans le poisson zèbre et l’essai de formation de tube dans les cellules endothéliales pluripotentes induites par le patient pour étudier le rôle de l’endoglin dans la formation vasculaire.

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

L’hybridation in situ de l’ensemble de la monture, WISH, offre une haute résolution et un faible résultat de fond par rapport aux méthodes traditionnelles. En outre, les plaques u-slide améliorent la mise au point à la même longueur focale en utilisant moins wish peut être appliqué sur les embryons de souris, embryons de Drosophile et d’autres tissus difficiles à manipuler. L’analyse de formation de tube peut être appliquée aux cellules souches des cellules androgènes différenciées.WISH permet de comprendre facilement le sens fonctionnel de la correction de la mutation. La personne qui démontrera la procédure est Yong Wang, un assistant de recherche de mon laboratoire. Au microscope, utilisez le système FemtoJet pour injecter deux nanogrammes de Morpholinos et 500 picogrammes de MRNA dans des embryons à cellules unique.Pratiquez la microinjection de Morpholinos plusieurs fois jusqu’à ce que vous puissiez l’injecter dans les cellules avec succès et garder l’intégrité des œufs. Incuber les zygotes jusqu’à ce qu’ils soient déchorionés et atteindre l’état de développement qui correspond à l’expérience prévue. Tel que décrit dans le tableau un du manuscrit.Ensuite, utilisez une pipette en plastique pour transférer de 20 à 40 embryons dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de solution 4% PFA fraîchement préparée à température ambiante. Après avoir fixé, lavé et déshydraté les embryons tels que décrits dans le manuscrit, placez les embryons dans un tamis avec maille en nylon au fond.Hydrater les embryons en les lavant séquentiellement à 75%50% et 25% de méthanol pendant cinq minutes chacun. Après avoir lavé les embryons avec PBST, ajouter 50 microlitres de proteinase K dans le tube avec les embryons. Après la digestion, retirer la proteinase K et laver les embryons avec PBST trois fois pendant cinq minutes à chaque fois.Ajouter 50 à 100 microlitres de sondes cibles mixtes dans chaque tube avec les embryons. Incuber les embryons pendant la nuit à 40 degrés Celsius. Après avoir lavé les embryons comme décrit dans le manuscrit, utilisez 4% de paraformaldéhyde pour fixer les embryons pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, lavez les embryons en solution 2x SSCT trois fois pendant 15 minutes à chaque fois à température ambiante. Retirez la solution SSCT et remplacez-la par 50 microlitres d’Amp 1. Puis incuber les embryons à 40 degrés Celsius.Après 30 minutes, laver les embryons en solution 2x SSCT trois fois pendant 15 minutes à chaque fois à température ambiante. Retirez la solution SSCT et ajoutez 50 microlitres d’Amp 2. Après avoir couvé pendant 15 minutes et lavé l’embryon comme cela a été fait précédemment, ajouter 50 microlitres d’Amp 3 et appuyez doucement sur le tube.Incuber les embryons à 40 degrés Celsius. Après 30 minutes laver les embryons comme décrit précédemment. Ajouter ensuite 50 microlitres d’Amp 4 dans le sens de la goutte et appuyez soigneusement sur le tube.Puis incuber les embryons à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes et les laver trois fois avec SSCT. Après avoir préparé les embryons à l’imagerie tel que décrit dans le manuscrit, utilisez une trousse de substrat de peroxydée DAB pour tacher l’échantillon. Ajouter 50 microlitres chacun des reagents de couleur A, B et C à un millilitre d’eau distillée.Et bien mélanger pour obtenir un fluide de travail DAB complet. Ajouter le liquide à l’échantillon et couvrir pendant dix minutes. Après avoir soigneusement lavé les spécimens, utilisez un microscope optique pour les imager.Pour commencer la culture et le contrôle des iPSCs HHT, ajoutez la matrice membranaire du sous-sol à six plaques de culture cellulaire de puits pour couvrir le fond des puits. Incuber les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez la solution de matrice membranaire du sous-sol utilisée des puits et ajoutez deux millilitres de mTeSR 1 milieu dans chaque puits.Ensuite, plaque les iPSCs récoltés à partir du dernier passage à environ une fois dix pour les six cellules par puits. Après avoir cultivé les iPSCs pendant environ quatre jours, échangez le milieu de culture cellulaire avec le milieu bel complété. Faire croître les cellules pendant trois jours pour générer des cellules mésodérm.Pour développer les cellules endothéliales vasculaires, remplacer le milieu par un milieu BEL complété pendant quatre jours. Et ensuite traiter les cellules avec le même milieu et la culture pendant encore trois à quatre jours. Purifier les cellules endothéliales vasculaires matures à l’aide de Dynabeads CD31 selon les instructions du kit.Puis collecter les cellules CD31 positives par tampon d’élitution. Maintenir et étendre les cellules endothéliales purifiées dans le milieu EC-SFM contenant VEGF165, bFGF et FBS. Pour plaquer les cellules endothéliales, commencez par ajouter 10 microlitres de matrice membranaire sous-sol par puits aux plaques d’angiogenèse.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Récoltez les cellules endothéliales et résuspendez-les dans le milieu de croissance endothélial 2 en pipetting à plusieurs reprises. Ajouter 50 microlitres de cette suspension cellulaire à la matrice solidifiée dans chaque puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius.Après trois à cinq heures d’incubation, utilisez un microscope à haute résolution pour évaluer la formation de tubes endothéliales. Capturez des images d’au moins dix zones pour chaque groupe. Inspecter la longueur globale du tube, le numéro de tube et les points de branche.CISH et WISH ont été exécutés pour déterminer l’expression de l’endogline dans les embryons post-fertilisation 24 heures. Un marqueur endothélial hémogenic et un marqueur endothélial d’ancêtre ont été utilisés pour examiner l’effet du silencing d’endoglin. Les flèches rouges indiquent les régions où l’expression de ces marqueurs, aplnrna et npr1a, a considérablement diminué.L’essai endothélial de formation de tube a été exécuté sur le mutant d’endoglin et les cellules endothéliales iPSC-dérivées de contrôle. La formation de tube a été évaluée et photographiée après trois heures. La longueur du tube, le numéro de tube et la ramification ont été quantifiés à l’aide du logiciel ImageJ.Les cellules endothéliales mutantes formaient moins de branches que les cellules endothéliales de contrôle. Et les branches dans les cellules endothéliales mutantes ont augmenté de manière significative après stimulation avec le facteur vasculaire de croissance endothéliale. Cette méthode peut également être utilisée pour la génération iPS à partir de sang périphérique.Et par la méthode clarifie le rôle de l’endocrinien dans la formation vasculaire in vitro et in vivo. Sachant que la correction de la mutation peut faire une différence dans l’angiogenèse, il est possible de transplanter les cellules de nouveau dans les patients pour la thérapie potentielle de cellules souches.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

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