Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר ופיתוח של המפתח הלאומי של סין, תאי גזע ומחקר טרנסלtional [מספר 2016YFA0102300 (כדי יוני יאנג)]; הקרן למדעי הטבע של סין [גרנט מספר 81870051, 81670054 (ליוני יאנג)]; קרן חדשנות מצלמות למדעי הרפואה (CIFMS) [גרנט מספר 2016-I2M-4-003 (כדי יוני יאנג)]; הנוער PUMC נמצא ואת קרנות המחקר הבסיסי של האוניברסיטאות המרכזיות [מספר 2017310013 (לפאנג ג'ואו)].

כל ניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת האתיקה המחקר של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג.
1. כל הר היברידיזציה באתרו
<ol><li>גידול ורבייה של קו הדגים<ol>
<li>להאכיל ולהעלות את כל מבוגרים דג זברה ב 26-28 ° c בתוך מערכת מידגה מחזורי עם 14 h אור/10 h מחזור כהה עבור כל יום. השתמש ב...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה הוחל שיפור משופר הר הפלטפורמה באתרו של ה-RNA פלטפורמת היווצרות שפופרת של דג ומערכת צינור על iPSC-ECs נגזר מחולה HHT. שיטת ISH המסורתית מחייבת מחזור ניסיוני ארוך יותר עם צעדים ניסיוניים נוספים. הפרוטוקול יש כמה שיפורים חשובים, השימוש של בדיקה עצמאית כפולה Z ו iPSCs נגזר ממטופל עם hht שהוחלו ב...

מוטציה אחת ב eng (CD105) דווחה בחולים עם hht. המוטציה מובילה התפשטות EC מוגברת ומופחתת זרימה-1תיווך ECהתארכות 1,2. כמו כן דווח בעבר כי מחסור ב-ENG מפחית את הביטוי של סמנים אנדותל (כלומר, kdrl, cdh5, hey2) ב דג זברה3. אנדוגלין, המתבטא בעיקר בתאי האנדותל, היא גליקופרוטאין טרנסרפינת ופונקציות כקולטן לשינוי גורם הגדילה β (tgf-β) בני משפחה. הוא מכוון BMP9 קשירה על משטח התא כדי לווסת את הגן במורד הזרם, כולל Id1 ביטוי, כדי לגרום לבידול תא גזע לכיוון ecs4. כך, הגן eng משחק תפקידים חשוביםבתוךvasculogenesis ומחלות כלי דם אנושיים 5,6. בדקנו בעבר את ההשפעות של אנדוגלין מלמטה על היווצרות הספינה בעוברי דגים דג זברה, ואחריו ניתוח של ecs iPSCs-נגזר שנרכשו מחולה hht נושאת מוטציה eng 7. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של המחסור ב-ENG על ביטוי סמן של מחולל קדמון והיווצרות שפופרת, שהיא שיטה הניתנות לכימות למדידת האנגיוגנזה של מבחנה.
כדי ללמוד eng מרחבית הביטוי הזמני, המשאלה מועסק כדי לזהות ביטוי גנים ב vivo8. באתרו היברידיזציה (ISH) היא שיטה של שימוש בבדיקות עם תוויות עם רצפים משלימים של חומצות גרעין היעד (DNA או mRNA) כדי לזהות ולהמחיש את היעד חומצות גרעין כלאיים בדגימה קבועה. התהליך מגביר אותות ביטוי גנים ב vivo והוא משמש כדי לזהות את הביטוי של גנים על ידי מיקרוסקופ. המשאלה היתה בשימוש נרחב בחיות מודל שונות, במיוחד ב דג זברה9. הוא משמש גם כדי לרכוש את הנתונים הבאים: 1) ביטויים מרחביים/זמני גנים, אשר מספקים מידע על פונקציה גנטית וסיווג; ו-2) הביע במפורש סמנים גנים המשמשים בשימוש בתפוקה גבוהה או בסינון מוטציה10.
בדיקות כרומוגניים מושפל בקלות עם כרומוזום מסורתי היברידיזציה באתרו (cish), אשר מביא רעש רקע גבוהואותות לאספציפיים,12. שיטת המשאלה משתמשת בשני בדיקה עצמאית כפולה Z, אשר נועדו לhybridize היעד רצפי RNA. כל בדיקה מכילה רצף 18-25 המשלים ל-RNA היעד ו 14 בסיס הזנב רצף (המשדר כ Z). בבדיקות היעד נעשה שימוש בזוג (כפול Z). שני רצפי הזנב יחד טופס 28 הכלאה בסיס האתר עבור מגבר הקדם, אשר מכיל 20 אתרי מחייב עבור המגבר. המגבר, בתורו, מכיל 20 אתרי קשירה עבור בדיקה התווית והוא יכול תיאורטית להניב עד 8,000 תוויות עבור כל מטרה RNA רצף.
טכנולוגיה מתקדמת זו מאפשרת הגברה זמנית של אותות ודיכוי רקע כדי להשיג הדמיה חד-מולקולות תוך שמירה על מורפולוגיה של רקמות13. שינוי נוסף של שיטות המשאלה מבוסס על מחקר הקודם14, כולל קיבעון נוסף וכתמים מכתים. בתנאי כאן הוא פרוטוקול משאלה משופרת שיכול לעבוד גם אם RNA היעד הוא ירד או מושפל חלקית. היתרונות כוללים כי ניתן להשלימה 24 שעות ללא RNase-ללא תנאים. ניתן גם לזהות אותות בו באמצעות ערוצים מרובים מיעדים מרובים, והתוצאות עקביות ותואמות לתוצאות של פלטפורמות אוטומציה שונות בתפוקה גבוהה.
תוצאות מדגמי בעלי חיים אינם נחוצים לשיקוף התופעה המתרחשת אצל בני האדם. ב-ENG מצויים שני זוגות של ציסטרינס, C30-C207 ו-C53-C182, היוצרים גשרים דיגוניים באזורים היתומים. כדי ללמוד עוד יותר את התפקיד של eng ב-hht חולים, היווצרות tube בחני עם iPSCs נגזר מהחולים hht בוצעו בתאים ללא/עם מוטציות eng (Cys30Arg, C30R)15. לאחר שקוביטה ואח ' דיווח תחילה על היווצרות הצינור בניסוי16, המבנה פותח במספר דרכים. הוא משמש כדי לזהות גורמים אנגיוגנטיים או אנטי-אנגיוגנטיים, להגדיר את מסלולים איתות באנגיוגנזה, ולזהות גנים המסדירים אנגיוגנזה17.
לפני הזמינות של iPSC-ECs המטופל, החוקרים השתמשו ECs תרבותי בעיקר כדי ללמוד angiogensis16. עם זאת, עבור תאי האנדותל, זהו אתגר טכני כדי לשנות גנים אקסוגני עם וירוס, בגלל מספר מעבר מוגבל ECs יכול לעבור. הסיבה לכך היא בקושי מספיק חומר הסלולר כדי לאסוף מכלי הדם או מהניתוח או תורמים שאושרו בהתאמה. עם ההמצאה של טכניקת הדור iPSC ידי שינא יאמאנאקה, ECs האדם נגזר iPSCs יכול לשמש באופן אמין בניסויים מבחנה, כפי שדווח בעבר18.
שימוש ב-ecs התמרה ויראלי עם מספרים מוגבלים ומעברים עשוי להיות מספיק עבור מחקרים איתות, אבל עבור מחקרים פונקציונליים, עדיף ליצור שורות של תא גזע המוטציות pluripotent (או iPSCs או כריסי/Cas9-ממוקד hESCs), ואז להבדיל אותם ל-ecs למחקרים אנגיוגנזה להשתמשבחניהיווצרות שפופרת היווצרות צינור ניתן להשתמש כדי להעריך את הפונקציה של תאים אנדותל הנושאת מוטציות. פרוטוקול זה מתאר גם את היווצרות הצינורית על צלחת האנגיוגנזה של μ-שקופית, המהווה שיטה קלה, חסכונית ומתוכבת.
הפרוטוקול המופיע להלן מספק שיטה אמינה ומערכתית ללימוד התפקיד של גנים ספציפיים במערך כלי הדם, יחד עם פרטים על תבנית ביטוי vivo ובכמת מחוץ לגוף לצורך דוגמנות מחלות אנושיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

התפתחות כלי הדם נקבעת על ידי הביטוי הרציף של גנים ספציפיים, אשר ניתן ללמוד על ידי ביצוע היברידיזציה באתרו הכלאה במהלך שלבים התפתחותיים שונים. כדי לחקור את התפקיד של אנדוגלין (eng) במערך הספינה במהלך ההתפתחות של telangiectasia מדמם תורשתי (hht), המוזולסטינו בתיווך ממוקדת ממוקד של eng ב-דג זברה משמשים לחקר הביטוי הזמני שלה פונקציות משויכות. כאן, כל הר של היברידיזציה באתרו (מאחל) הוא מועסק לניתוח של eng ואת הגנים שלה במורד הזרם של עוברי דג דג זברה. כמו כן, היווצרות צינור הרכבת מבוצעים החולה HHT-נגזר המושרה הנגרמת לתאי גזע מובחנים תאים אנדותל (iPSC-ECs; עם מוטציות eng ). אות ספציפית מערכת הגברה באמצעות הסכום כולו היברידיזציה באתרו – משאלה מספקת ברזולוציה גבוהה יותר ותוצאות הרקע התחתון בהשוואה לשיטות המסורתיות. כדי להשיג אות טוב יותר, הזמן לאחר הקיבעון מותאם ל 30 דקות לאחר הכלאה בדיקה. מכיוון שצביעת הקרינה הפלואורסצנטית אינה רגישה בעוברי הדגים, הוא מוחלף בכתמים משובצת יהלומים. בפרוטוקול זה, HHT המטופל נגזר הקווים iPSC המכיל מוטציה eng מובחנים לתאי האנדותל. לאחר ציפוי צלחת עם מטריקס קרום המרתף עבור 30 דקות ב 37 ° c, ipsc-ecs הם שנזרע כמו דופלקס לתוך בארות ושמרו על 37 ° c עבור 3 h. לאחר מכן, אורך הצינור ומספר הענפים מחושבים באמצעות תמונות מיקרוסקופיים. כך, עם הפרוטוקול המשופר הזה משאלה, זה מראה כי מופחתת ביטוי eng משפיע על היווצרות מחולל שורש בתוך העוברים בדגים. זה מאומת נוספת על ידי היווצרות צינור שפופרת באמצעות iPSC-ECs נגזר מטופל עם HHT. האלה מאשרים לאשר את התפקיד עבור eng בפיתוח כלי דם מוקדם.

כל הר היברידיזציה באתרו מבוסס על עיקרון דומה העברת אנרגיה התהודה הפלואורסצנטית. הוא נועד לשפר את הרגישות והספציפיות ביותר בדגים, כמו גם להגביר אותות ספציפיים למטרה מבלי להשפיע על אות הרקע.
בשנת 24 העוברים עוברי דגים, אנדוגלין מתבטא ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

ההר כולו, בהכלאה situ, WISH, מספק רזולוציה גבוהה ותוצאת רקע נמוכה בהשוואה לשיטות מסורתיות. כמו כן, לוחות U-slide לשפר את המיקוד באותו אורך מוקד באמצעות פחות WISH ניתן להחיל על עוברי עכבר, עוברי Drosophila ורקמות אחרות קשה להתמודד. ניתן להחיל את ההתמדה היווצרות הצינור על תאי גזע מובחנים תאי אנדרוגן.WISH מקלה על הבנת המשמעות התפקודית של תיקון מוטציה. האדם שידגים את ההליך הוא יונג וונג, עוזר מחקר מהמעבדה שלי. עבודה תחת מיקרוסקופ, להשתמש במערכת FemtoJet להזריק שני ננוגרם של Morpholinos ו 500 picograms של MRNA לעוברים של תא אחד.תרגול microinjection של Morpholinos פעמים רבות עד שאתה יכול להזריק אותו לתאים בהצלחה ולשמור על שלמות הביצים. להדק את הזיגוטים עד שהם dechorionated ולהגיע למצב הפיתוח שמתאים לניסוי המיועד. כמתואר בטבלה אחד של כתב היד.לאחר מכן, השתמש פיפטה פלסטיק להעביר 20 עד 40 עוברים לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו מיליליטר אחד של תוסף 4%PFA טרי בטמפרטורת החדר. לאחר תיקון, כביסה ומייבש את העוברים כמתואר בכתב היד, מניחים את העוברים במסמרן עם רשת ניילון בתחתית.לחות את העוברים על ידי שטיפת רציף אותם ב 75%50% ו 25% מתנול במשך חמש דקות כל אחד. לאחר שטיפת העוברים עם PBST, להוסיף 50 microliters של proteinase K לתוך הצינור עם העוברים. לאחר העיכול, להסיר את proteinase K ולשטוף את העוברים עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל פעם.הוסף 50 עד 100 מיקרוליטרים של בדיקות מטרה מעורבות לתוך כל צינור עם העוברים. דגירה העוברים לילה ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת העוברים כמתואר בכתב היד, השתמשו ב-4% paraformaldehyde כדי לתקן את העוברים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן לשטוף את העוברים בתתבר SSCT 2x שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון SSCT ולהחליף אותו עם 50 microliters של Amp 1. ואז לה הדגירה העוברים ב 40 מעלות צלזיוס.לאחר 30 דקות, לשטוף את העוברים בתתבר 2x SSCT שלוש פעמים במשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. הסר את פתרון SSCT והוסף 50 מיקרוליטרים של Amp 2. לאחר הדגירה במשך 15 דקות ושטיפת העובר כפי שנעשה בעבר, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של Amp 3 ומקשים על הצינור בעדינות.דגירה העוברים ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות לשטוף את העוברים כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של Amp 4 dropwise והקש בזהירות על הצינור.ואז להדגר את העוברים ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם SSCT. לאחר הכנת העוברים להדמיה כמתואר בכתב היד, השתמש בערכת מצע של DAB peroxidase כדי להכתים את הדגימה. הוסיפו 50 מיקרוליטרים לכל אחד מהריגנסים צבעוניים A, B ו-C למיליליטר אחד של מים מזוקקים.ומערבבים היטב כדי להשיג נוזל עבודה DAB מלא. מוסיפים את הנוזל לדגימה ומכסים במשך עשר דקות. לאחר שטיפת הדגימות ביסודיות, יש להשתמש במיקרוסקופ אופטי כדי לדמיין אותן.כדי להתחיל culturing ושליטה של IPSCs HHT, להוסיף מטריצת קרום מרתף לשש צלחות תרבות התא גם כדי לכסות את החלק התחתון של הבארות. דגירה הצלחות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את פתרון מטריצת קרום המרתף המשמש מה בארות, והוסף שני מיליליטר של mTeSR 1 בינוני לתוך כל באר.ואז צלחת iPSCs שנקטפו מן המעבר האחרון בערך פעם אחת עשרה עד ששת התאים ל הבאר. לאחר culturing iPSCs במשך כארבעה ימים, להחליף את מדיום תרבות התא עם מדיום BEL בתוספת. לגדל את התאים במשך שלושה ימים כדי ליצור תאים mesoderm.כדי להרחיב את תאי אנדותל כלי הדם, להחליף את המדיום עם מדיום BEL בתוספת במשך ארבעה ימים. ואז לטפל בתאים עם אותו מדיום ותרבות לעוד שלושה עד ארבעה ימים. לטהר את תאי אנדותל כלי הדם הבוגרים באמצעות CD31 Dynabeads על פי הוראות קיט.לאחר מכן אסוף את התאים החיוביים של CD31 באמצעות מאגר אלוטיון. שמור והרחב את תאי ה אנדותל מטוהרים במדיום EC-SFM המכיל VEGF165, bFGF ו- FBS. כדי צלחת התאים אנדותל, להתחיל על ידי הוספת 10 microliters של מטריצת קרום מרתף לגם לצלחות אנגיוגנזה.הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לקצור את תאי ה אנדותל ולתלות אותם מחדש בצמיחה אנדותל בינוני 2 על ידי צינורות שוב ושוב. הוסף 50 microliters של מתלי תא זה למטריצה מוצקה בכל באר ולאחר מכן דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר שלוש עד חמש שעות של דגירה, השתמש במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה כדי להעריך היווצרות צינור אנדותל. לכוד תמונות של עשרה אזורים לפחות עבור כל קבוצה. בדוק את אורך הצינור הכולל, מספר הצינור ונקודות הענף.CISH ו- WISH בוצעו כדי לקבוע את הביטוי של אנדוגלין בעוברים לאחר ההפריה 24 שעות ביממה. סמן אנדותל המוגני וסמן אב אנדותל שימשו לבחינת ההשפעה של השתק אנדוגלין. החצים האדומים מציינים אזורים שבהם הביטוי של סמנים אלה, aplnrna ו- npr1a, ירד באופן משמעותי.ההקמה של צינור אנדותל בוצעה על מוטנט אנדוגלין ושליטה בתאי אנדותל שמקורם ב- iPSC. היווצרות הצינור נבדקה וצולמה לאחר שלוש שעות. אורך הצינור, מספר הצינור וההסתעפות כומתו באמצעות תוכנת ImageJ.תאי אנדותל מוטנטים יצרו פחות ענפים מאשר תאי אנדותל שולטים. וענפים בתאי אנדותל מוטנטים גדלו באופן משמעותי לאחר גירוי עם גורם גדילה אנדותל כלי הדם. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור ייצור iPS מדם היקפי.ועל ידי השיטה מבהיר את התפקיד של אנדוקרינית היווצרות כלי דם במבחנה ו vivo. בידיעה כי תיקון המוטציה יכול לעשות את ההבדל אנגיוגנזה, ניתן להשתיל את התאים בחזרה לחולים לטיפול בתאי גזע פוטנציאליים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...