Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

इस काम को चीन-स्टेम सेल और ट्रांसलेशनल रिसर्च [ग्रांट नंबर 2016YFA0102300(जून यांग के लिए) के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था]; चीन का नेचर साइंस फाउंडेशन [अनुदान संख्या ८१८७००५१, ८१६७००५४ (जून यांग के लिए)]; सीएएमएस इनोवेशन फंड फॉर मेडिकल साइंसेज (सीआईएफएमएस) [ग्रांट नंबर 2016-आई2एम-4-003 (जून यांग तक)]; PUMC युवा पाया और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष [अनुदान संख्या २०१७३१००१३ (फेंग झोउ के लिए)] ।

वर्णित सभी पशु प्रयोगों को झेजियांग विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन की रिसर्च एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी ।
1. सीटू संकरण में पूरे माउंट
<ol><li>जेब्राफिश लाइन पशुपालन और प्रजनन<ol>
<li>प्रत्येक दिन...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल ने एचएचटी रोगी से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस पर जेब्राफिश और ट्यूब गठन परखों के लिए सीटू आरएनए विश्लेषण मंच में एक बेहतर पूरे माउंट लागू किया। पारंपरिक ईश विधि अतिरिक्त प्रयोगात्मक चरणों के...

एचएचटी वाले मरीजों में इंजी (सीडी105) पर सिंगल म्यूटेशन की जानकारी दी गई है। उत्परिवर्तन से ईसी प्रसार में वृद्धि होती है और प्रवाह-मध्यस्थता ईसी विस्तार1,2कम हो जाता है । यह भी पहले बताया गया है कि ENG की कमी जेब्राफिश3में एंडोथेलियल मार्कर अभिव्यक्ति (यानी, केडीआरएल, सीडीएच5, हे2)को कम करती है। एंडोग्लिन,मुख्य रूप से एंडोथेलियल कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, एक ट्रांसम्मेथग्कोप्रोटीन है और विकास कारक (टीजीएफ-ए) परिवार के सदस्यों को बदलने के लिए एक सह-रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है। यह ICs4की ओर स्टेम सेल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए Id1 अभिव्यक्ति सहित डाउनस्ट्रीम जीन को विनियमित करने के लिए सेल की सतह पर BMP9 बाध्यकारी निर्देश देता है । इस प्रकार, इंग्लैंड जीन वाकुलोजेनेसिस और मानव संवहनी रोग5,6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमने पहले जेब्राफिश भ्रूण में पोत गठन पर एंडोग्लिन नॉकडाउन के प्रभावों की जांच की है, जिसके बाद एक एचएचटी रोगी से प्राप्त आईपीएससी-व्युत्पन्न ईसी का विश्लेषण किया गया है जो एक eng उत्परिवर्तन7असर करते हैं । यह प्रोटोकॉल एंडोथेलियल प्रोजेनिटर मार्कर अभिव्यक्ति और ट्यूब गठन पर ENG की कमी के प्रभाव को दर्शाता है, जो इन विट्रो एंजियोजेनेसिस को मापने के लिए एक मात्रात्मक विधि है।
इंग्लैंड स्थानिक और लौकिक अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए, इच्छा वीवो8में जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए नियोजित है । सीटू संकरण (ईश) में एक निश्चित नमूने में लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड संकर का पता लगाने और कल्पना करने के लिए लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड (डीएनए या एमआरएनए) के पूरक दृश्यों के साथ लेबल जांच का उपयोग करने की एक विधि है। यह प्रक्रिया वीवो में जीन अभिव्यक्ति संकेतों को बढ़ाती है और इसका उपयोग माइक्रोस्कोपी द्वारा जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है। इच्छा व्यापक रूप से विभिन्न मॉडल जानवरों में इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से जेब्राफिश9में । इसका उपयोग निम्नलिखित डेटा प्राप्त करने के लिए भी किया जाता है: 1) जीन स्थानिक/लौकिक अभिव्यक्ति पैटर्न, जो जीन समारोह और वर्गीकरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं; और 2) विशेष रूप से जीन मार्कर है कि उच्च थ्रूपुट दवा या उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग10में उपयोग किया जाता है व्यक्त की ।
गुणसूत्र जांच आसानी से सीटू संकरण (सीआईश) में पारंपरिक गुणसूत्र के साथ अपमानित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि शोर और गैर विशिष्ट संकेत11,12होते हैं । इच्छा विधि दो स्वतंत्र डबल जेड जांच का उपयोग करती है, जो आरएनए दृश्यों को लक्षित करने के लिए संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। प्रत्येक जांच में लक्ष्य आरएनए के पूरक 18-25 अनुक्रम और 14 आधार पूंछ अनुक्रम (जेड के रूप में संकल्पित) शामिल हैं। लक्ष्य जांच एक जोड़ी (डबल जेड) में उपयोग किया जाता है। दो पूंछ दृश्यों एक साथ preamplifier के लिए एक 28 आधार संकरण साइट है, जो एम्पलीफायर के लिए 20 बाध्यकारी साइटों में शामिल है फार्म । एम्पलीफायर, बदले में, लेबल जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें शामिल हैं और सैद्धांतिक रूप से प्रत्येक लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के लिए 8,000 लेबल तक उपज कर सकते हैं।
यह उन्नत तकनीक ऊतक आकृति विज्ञान13को संरक्षित करते हुए एकल अणु दृश्य को प्राप्त करने के लिए एक साथ संकेत प्रवर्धन और पृष्ठभूमि दमन की सुविधा प्रदान करती है। इच्छा विधियों का आगे संशोधन पिछले शोध14पर आधारित है, जिसमें अतिरिक्त निर्धारण और डीएबी धुंधला शामिल है। बशर्ते यहां एक बेहतर इच्छा प्रोटोकॉल है जो काम कर सकता है भले ही लक्ष्य आरएनए आंशिक रूप से कम हो या अपमानित हो। फायदे में शामिल है कि यह RNase मुक्त शर्तों के बिना 24 घंटे में पूरा किया जा सकता है । सिग्नल ों को एक साथ कई लक्ष्यों के कई चैनलों के माध्यम से भी पता लगाया जा सकता है, और परिणाम विभिन्न उच्च-थ्रूपुट स्वचालन प्लेटफार्मों के परिणामों के अनुरूप और संगत हैं।
पशु मॉडल से परिणाम आवश्यक नहीं है कि मनुष्यों में होता है एक ही घटना को प्रतिबिंबित करते हैं । ENG संरक्षित cysteines, C30-C207 और C53-C182, जो अनाथ क्षेत्रों में disulfide पुलों के रूप में दो जोड़े शामिल हैं । एचएचटी रोगियों में इंग्लैंड की भूमिका का आगे अध्ययन करने के लिए, एचएचटी रोगियों से प्राप्त आईपीएससी के साथ ट्यूब गठन परखों को बिना-इंग्लैंड म्यूटेशन (Cys30Arg, C30R)15के साथ कोशिकाओं में किया गया है । Kubota एट अल के बाद पहली बार ट्यूब गठन प्रयोग16की सूचना दी, परख कई मायनों में विकसित किया गया है । इसका उपयोग एंजियोजेनिक या एंटीएंजियोजेनिक कारकों की पहचान करने, एंजियोजेनेसिस में सिग्नलिंग रास्तों को परिभाषित करने और एंजियोजेनेसिस17को विनियमित करने वाले जीन की पहचान करने के लिए किया गया है।
रोगी से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस की उपलब्धता से पहले, शोधकर्ताओं ने एंजियोजेनसिस16का अध्ययन करने के लिए मुख्य रूप से सुसंस्कृत ईसी का उपयोग किया। हालांकि, एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए, ईसीएस द्वारा गुजरने वाली सीमित मार्ग संख्या के कारण, वायरस के साथ एक्सोजेनस जीन को स्थानांतरित करना एक तकनीकी चुनौती है। इसका कारण यह है कि वहां शायद ही पर्याप्त सेलुलर सामग्री के लिए या तो सर्जरी या मिलान अनुमोदित दाताओं से मानव जहाजों से एकत्र किया जाना है । शिन्या यामानाका द्वारा आईपीएससी उत्पादन तकनीक के आविष्कार के साथ, आईपीएससी से प्राप्त मानव ईसीएस का उपयोग इन विट्रो प्रयोगों में मज़बूती से किया जा सकता है, जैसा कि पहले18की रिपोर्ट दी गई थी।
सीमित संख्या और मार्ग के साथ वायरल ट्रांसड्यूड ईसी का उपयोग संकेत अध्ययनों के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन कार्यात्मक अध्ययनों के लिए, म्यूटेंट प्लूरीपोटस्टेम सेल लाइनें उत्पन्न करना बेहतर है, (या तो आईपीएससी या CRISPER/Cas9-लक्षित hESCs), फिर उन्हें एंजियोजेनेसिस अध्ययन के लिए ईसीएस में अंतर करें जो ट्यूब गठन का उपयोग करते हैं19। ट्यूब गठन का उपयोग उत्परिवर्तन वाले एंडोथेलियल कोशिकाओं के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एक माइक्रो-स्लाइड एंजियोजेनेसिस प्लेट पर ट्यूब गठन का भी वर्णन करता है, जो एक आसान, लागत प्रभावी और प्रजनन योग्य विधि है।
नीचे प्रोटोकॉल संवहनी गठन में विशिष्ट जीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय और प्रणालीगत विधि प्रदान करता है, साथ ही वीवो अभिव्यक्ति पैटर्न में विवरण और मानव रोग मॉडलिंग के लिए इन विट्रो कार्यात्मक परिमाणीकरण के साथ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

संवहनी विकास विशिष्ट जीन की अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है, जिसका विभिन्न विकासात्मक चरणों के दौरान जेब्राफिश में सीटू संकरण परख में प्रदर्शन करके अध्ययन किया जा सकता है। वंशानुगत रक्तस्रावी टेलांगिया (एचएचटी) के विकास के दौरान पोत गठन में एंडोग्लिन (इंग्लैंड) की भूमिका की जांच करने के लिए, जेब्राफिश में एंजी के मॉर्फोलिन-मध्यस्थता लक्षित नॉकडाउन का उपयोग इसकी लौकिक अभिव्यक्ति और संबद्ध कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यहां, सीटू आरएनए संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट को ज़ेब्राफिश भ्रूण में इंग्लैंड और उसके डाउनस्ट्रीम जीन के विश्लेषण के लिए नियोजित किया जाता है। इसके अलावा, एचएचटी रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लीरिटेंट स्टेम सेल-विभेदित एंडोथेलियल कोशिकाओं (आईपीएससी-ईसी; इंग्लैंड म्यूटेशन के साथ) में ट्यूब गठन परख ें की जाती हैं। सीटू संकरण में पूरी राशि का उपयोग करके एक विशिष्ट सिग्नल एम्पलिंग सिस्टम - इच्छा पारंपरिक तरीकों की तुलना में उच्च संकल्प और कम पृष्ठभूमि परिणाम प्रदान करती है। बेहतर संकेत प्राप्त करने के लिए, निर्धारण के बाद का समय जांच संकरण के बाद 30 min में समायोजित किया जाता है। क्योंकि फ्लोरेसेंस धुंधला ज़ेब्राफिश भ्रूण में संवेदनशील नहीं है, यह diaminobezidine (DAB) यहां धुंधला के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, एचएचटी रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी लाइनें जिनमें एक eng उत्परिवर्तन होते हैं, को एंडोथेलियल कोशिकाओं में अंतर किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ एक प्लेट कोटिंग करने के बाद, आईपीएससी-ईसीएस कुओं में मोनोलेयर के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। फिर, ट्यूब की लंबाई और शाखाओं की संख्या सूक्ष्म छवियों का उपयोग करके गणना की जाती है। इस प्रकार, इस बेहतर इच्छा प्रोटोकॉल के साथ, यह दिखाया गया है कि कम eng अभिव्यक्ति जेब्राफिश भ्रूण में एंडोथेलियल प्रोजेनिटर गठन को प्रभावित करती है। एचएचटी के साथ एक मरीज से प्राप्त आईपीएससी-ईसीएस का उपयोग करके ट्यूब गठन परख द्वारा इसकी पुष्टि की जाती है। ये परख जल्दी संवहनी विकास में इंग्लैंड के लिए भूमिका की पुष्टि करते हैं ।

सीटू संकरण में पूरे माउंट फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के समान सिद्धांत पर आधारित है। यह पृष्ठभूमि संकेत को प्रभावित किए बिना जेब्राफिश ईश में संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ-साथ ल...

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

यहां प्रस्तुत संवहनी गठन में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लूरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं में जेब्राफिश और ट्यूब गठन परख में सीटू आरएनए संकरण विश्लेषण में पूरे माउंट के लिए एक प्रोटोकॉल है।

पूरे माउंट में सीटू संकरण में जेब्राफिश भ्रूण और ट्यूब गठन परख में iPSC-ECs में परख संवहनी विकास में एंडोग्लिन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

पूरे माउंट, सीटू संकरण, इच्छा में, पारंपरिक तरीकों की तुलना में एक उच्च संकल्प और कम पृष्ठभूमि परिणाम प्रदान करता है। इसके अलावा, यू-स्लाइड प्लेटें कम इच्छा का उपयोग करके एक ही फोकल लंबाई पर ध्यान केंद्रित करने में सुधार माउस भ्रूण, ड्रोसोफिला भ्रूण और अन्य ऊतकों को संभालने के लिए मुश्किल पर लागू किया जा सकता है । ट्यूब गठन परख स्टेम सेल विभेदित एंड्रोजन कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है।इच्छा उत्परिवर्तन सुधार के कार्यात्मक अर्थ को समझना आसान बनाती है। जो व्यक्ति प्रक्रिया का प्रदर्शन करेगा, वह मेरी प्रयोगशाला से एक अनुसंधान सहायक योंग वांग है । एक माइक्रोस्कोप के तहत काम कर रहे हैं, एक सेल भ्रूण में Morpholinos के दो नैनोग्राम और एमआरएना के ५०० पिकोग्राम इंजेक्ट करने के लिए FemtoJet प्रणाली का उपयोग करें ।मॉर्फोलिनोस के माइक्रोइंजेक्शन का अभ्यास कई बार तब तक करें जब तक आप इसे सफलतापूर्वक कोशिकाओं में इंजेक्ट न कर सकें और अंडों की अखंडता को बनाए रख सकें। जब तक वे डिकेरियोनेटेड न हों और विकास की स्थिति तक न पहुंच जाए जो इच्छित प्रयोग से मेल खाती है, तब तक जाइगोट्स को इनक्यूबेट करें। जैसा कि पांडुलिपि की तालिका एक में वर्णित है।इसके बाद, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 20 से 40 भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर हौसले से तैयार 4% पीएफए समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें। पांडुलिपि में वर्णित भ्रूण को ठीक करने, धोने और निर्जलित करने के बाद, भ्रूण को नीचे नायलॉन जाल के साथ छलनी में रखें।भ्रूण को क्रमिक रूप से 75% 50% और 25% मेथनॉल में पांच मिनट के लिए धोकर हाइड्रेट करें। पीबीएसटी के साथ भ्रूण धोने के बाद, भ्रूण के साथ ट्यूब में प्रोटीन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। पाचन के बाद प्रोटीनेज कश्मीर को हटा दें और हर बार पांच मिनट के लिए तीन बार पीबीएसटी से भ्रूण को धो लें।भ्रूण के साथ प्रत्येक ट्यूब में मिश्रित लक्ष्य जांच के ५० से १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । भ्रूण को रात भर ४० डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । पांडुलिपि में वर्णित भ्रूण को धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए भ्रूण को ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करें।फिर कमरे के तापमान पर हर बार 15 मिनट के लिए तीन बार 2x SSCT समाधान में भ्रूण धोएं। एसएसटी समाधान निकालें और इसे एएमपी 1 के 50 माइक्रोलीटर से बदलें। फिर भ्रूण को 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।30 मिनट के बाद, 2x SSCT समाधान में भ्रूण को कमरे के तापमान पर हर बार 15 मिनट के लिए तीन बार धोएं। एसएसटी समाधान निकालें और एएमपी 2 के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। 15 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग और भ्रूण धोने के बाद जैसा कि पहले किया गया था, एएमपी 3 के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूब को धीरे से टैप करें।भ्रूण को 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 30 मिनट के बाद भ्रूण धोने के रूप में पहले वर्णित है । इसके बाद एएमपी 4 ड्रॉपवाइज के 50 माइक्रोलीटर डालें और ध्यान से ट्यूब पर टैप करें।फिर भ्रूण को 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और उन्हें एसएससीटी के साथ तीन बार धोएं। पांडुलिपि में वर्णित इमेजिंग के लिए भ्रूण तैयार करने के बाद, नमूना दाग करने के लिए एक डीएबी पेरोक्सिडास सब्सट्रेट किट का उपयोग करें। आसुत पानी के एक मिलीलीटर के लिए रंग अभिकर् ती ए, बी और सी के प्रत्येक 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।और एक पूर्ण डीएबी काम तरल पदार्थ प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं। नमूने में तरल पदार्थ जोड़ें और दस मिनट के लिए कवर करें। नमूनों को अच्छी तरह से धोने के बाद, उन्हें छवि के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।एचएचटी आईपीएससी की खेती और नियंत्रण शुरू करने के लिए, कुओं के नीचे को कवर करने के लिए छह अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें। प्लेटों को एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कुओं से उपयोग किए गए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान को हटा दें, और प्रत्येक कुएं में दो मिलीलीटर mTeSR 1 माध्यम जोड़ें।फिर आईपीएससी को अंतिम मार्ग से लगभग एक गुना दस बार छह कोशिकाओं को अच्छी तरह से काटा जाता है। लगभग चार दिनों के लिए आईपीएससी की खेती करने के बाद, पूरक बीईएल माध्यम के साथ सेल संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान करें। मेसोडर्म कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए तीन दिनों के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए, चार दिनों के लिए पूरक बीईएल माध्यम के साथ माध्यम की जगह । और फिर एक ही माध्यम और संस्कृति के साथ एक और तीन से चार दिनों के लिए कोशिकाओं का इलाज । किट निर्देशों के अनुसार सीडी 31 डायनाबीच का उपयोग करके परिपक्व संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं को शुद्ध करें।फिर एल्यूशन बफर द्वारा सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा करें। ईसी-एसएफएम माध्यम में शुद्ध एंडोथेलियल कोशिकाओं को बनाए रखें और विस्तार करें जिसमें VEGF165, बीडब्ल्यूजीएफ और एफबीएस शामिल हैं। एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्लेट करने के लिए, एंजियोजेनेसिस प्लेटों में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 10 माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से जोड़कर शुरू करें।प्लेटों को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एंडोथेलियल कोशिकाओं को फसल करें और उन्हें एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम 2 में बार-बार पाइपिंग करके फिर से खर्च करें। प्रत्येक कुएं में जम मैट्रिक्स के लिए इस सेल निलंबन के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।तीन से पांच घंटे इनक्यूबेशन के बाद, एंडोथेलियल ट्यूब गठन का आकलन करने के लिए एक उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रत्येक समूह के लिए कम से कम दस क्षेत्रों की छवियों को कैप्चर करें। समग्र ट्यूब लंबाई, ट्यूब नंबर और शाखा बिंदुओं का निरीक्षण करें।CISH और इच्छा 24 घंटे के बाद निषेचन भ्रूण में एंडोग्लिन की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए प्रदर्शन किया गया । एंडोग्लिन साइलेंसिंग के प्रभाव की जांच करने के लिए एक हीमोजेनिक एंडोथेलियल मार्कर और एंडोथेलियल प्रोजेनिटर मार्कर का उपयोग किया गया था। लाल तीर उन क्षेत्रों को इंगित करते हैं जहां इन मार्कर, एप्लार्ना और एनपीआर 1ए की अभिव्यक्ति में काफी कमी आई है।एंडोथेलियल ट्यूब फॉर्मेशन परख एंडोग्लिन उत्परिवर्ती और नियंत्रण आईपीएससी-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं पर किया गया था। तीन घंटे बाद ट्यूब बनाने का आकलन कर फोटो खिंचवाई गई। इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ट्यूब की लंबाई, ट्यूब नंबर और ब्रांचिंग की मात्रा निर्धारित की गई थी।उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रण एंडोथेलियल कोशिकाओं की तुलना में कम शाखाओं का गठन किया । और उत्परिवर्ती एंडोथेलियल कोशिकाओं में शाखाओं में काफी संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक के साथ उत्तेजना के बाद वृद्धि हुई है। इस विधि का उपयोग परिधीय रक्त से आईपीएस उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है।और विधि द्वारा विट्रो में और वीवो में संवहनी गठन में एंडोक्राइन की भूमिका को स्पष्ट करता है। यह जानते हुए कि उत्परिवर्तन को ठीक करने से एंजियोजेनेसिस में फर्क पड़ सकता है, संभावित स्टेम सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं को वापस रोगियों में प्रत्यारोपण करना संभव है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

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विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक<em&gt; Xenopus</em&gt; किडनी

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

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मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण में जीन एक्सप्रेशन डोमेन की तुलना के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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Zebrafish में Multiciliated कोशिकाओं visualizing सीटू संकरण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट के एक संयुक्त प्रोटोकॉल के माध्यम से

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

astyanax भ्रूण के लिए स्वस्थानी संकरण में wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

जेब्राफिश में सीटू संकरण धुंधला में जेनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...