Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China-stem cell and translational research [numero di sovvenzione 2016YFA0102300 (a Jun Yang)];la Nature Science Foundation of China [numero di sovvenzione 81870051, 81670054 (a Jun Yang)]; il CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [numero di sovvenzione 2016-I2M-4-003 (a Jun Yang)]; il PUMC Youth Found e i Fondi fondamentali di ricerca per le Università Centrali [numero di sovvenzione 2017310013 (a Fang shou)].

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato Etico di Ricerca della scuola di medicina dell'Università di zhejiang.
1. Ibridazione in situ
<ol><li>Allevamento e riproduzione della linea di pesci zebra<ol>
<li>Nutrire e allevare tutti i pesci zebra adulti a 26-28 gradi centigradi in un sistema di acquacoltura ricircolante con un ciclo scuro di 14 h/10 h per ogni giorno. Utilizzare le linee di pesce zebra AB (wild-type) per le seguenti procedure.</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Questo protocollo ha applicato una piattaforma di analisi dell'RNA in situ a montaggio completo per i saggi di formazione di pesci zebra e di formazione di tubi su iPSC-EC derivati da un paziente HHT. Il metodo ISH tradizionale richiede un ciclo sperimentale più lungo con fasi sperimentali aggiuntive. Il protocollo presenta alcuni importanti miglioramenti, l'uso di doppie sonde indipendenti e iPSC derivate da un paziente con HHT che sono state applicate rispettivamente nei saggi WISH e nella formazione di tubi. Questi p...

Una singola mutazione su eng (CD105) è stata segnalata in pazienti con HHT. La mutazione porta ad un aumento della proliferazione CE e alla riduzione dell'allungamento CE mediato dal flusso1,2. È stato anche riferito in precedenza che la carenza di ENG riduce l'espressione dei marcatori endoteliali (cioè kdrl, cdh5, hey2) nel pesce zebra3. L'endoglin, espresso principalmente nelle cellule endoteliali, è una glicoproteina transmembrana e funziona come co-recettore per trasformare i membri della famiglia del fattore di crescita . Dirige il legame BMP9 sulla superficie cellulare per regolare il gene a valle, compresa l'espressione Id1, per indurre la differenziazione delle cellule staminali verso EC4. Così, il gene eng svolge ruoli importanti nella vasculogenesi e nella malattia vascolare umana5,6. In precedenza abbiamo esaminato gli effetti del knockdown endoglin sulla formazione dei vasi negli embrioni di pesce zebra, seguito dall'analisi delle EC derivate da iPSC acquisite da un paziente HHT con una mutazione di eng 7. Questo protocollo dimostra gli effetti della carenza di ENG sull'espressione del marcatore del progenitore endoteliale e sulla formazione di tubi, che è un metodo quantificabile per misurare l'angiogenesi in vitro.
Per studiare l'espressione spaziale e temporale, WISH viene impiegato per rilevare l'espressione genica in vivo8. L'ibridazione in situ (ISH) è un metodo di utilizzo di sonde etichettate con sequenze complementari di acidi nucleici bersaglio (DNA o mRNA) per rilevare e visualizzare ibridi di acido nucleico bersaglio in un esemplare fisso. Il processo amplifica i segnali di espressione genica in vivo e viene utilizzato per rilevare l'espressione dei geni mediante microscopia. WISH è stato ampiamente utilizzato in vari animali modello, soprattutto nel pesce zebra9. È anche usato per acquisire i seguenti dati: 1) modelli di espressione campionaria/temporale, che forniscono informazioni sulla funzione genica e sulla classificazione; e 2) marcatori genici specificamente espressi che vengono utilizzati in farmaci ad alto consumo o screeningmutante 10.
Le sonde cromogeniche sono facilmente degradate con l'ibridazione tradizionale in situ (CISH) cromosomica in situ, che si traduce in un rumore di fondo elevato e segnali non specifici11,12. Il metodo WISH utilizza due sonde doppie indipendenti, che sono progettate per ibridarsi per indirizzare le sequenze di RNA. Ogni sonda contiene una sequenza di 18-25 complementare all'RNA bersaglio e una sequenza di coda di base di 14 (concettualizzata come z). Le sonde di destinazione vengono utilizzate in una coppia (doppio) . Le due sequenze di coda formano insieme un sito di ibridazione di base 28 per il preamplificatore, che contiene 20 siti di binding per l'amplificatore. L'amplificatore, a sua volta, contiene 20 siti di legame per la sonda di etichette e può teoricamente produrre fino a 8.000 etichette per ogni sequenza di RNA bersaglio.
Questa tecnologia avanzata facilita l'amplificazione simultanea del segnale e la soppressione dello sfondo per ottenere la visualizzazione a singola molecola, preservando la morfologia dei tessuti13. Ulteriore modifica dei metodi WISH si basa su precedenti ricerche14, tra cui fissazione supplementare e colorazione DAB. A condizione qui è un protocollo WISH migliorato che può funzionare anche se l'RNA bersaglio è parzialmente diminuito o degradato. I vantaggi includono che può essere completato in 24 h senza condizioni RNase-free. I segnali possono anche essere rilevati simultaneamente attraverso più canali da più destinazioni e i risultati sono coerenti e compatibili con i risultati di diverse piattaforme di automazione ad alta velocità effettiva.
I risultati dei modelli animali non riflettono il fenomeno che si verifica nell'uomo. ENG contiene due coppie di cistein conservi, C30-C207 e C53-C182, che formano ponti disulfide nelle regioni orfane. Per studiare ulteriormente il ruolo di eng nei pazienti affetti da HHT, i saggi di formazione dei tubi con iPSC derivati da pazienti HHT sono stati effettuati in cellule senza/con mutazioni di eng (Cys30Arg, C30R)15. Dopo Che Kubota et al. ha riportato per la prima volta l'esperimento di formazione dei tubi16, il saggio è stato sviluppato in diversi modi. È stato utilizzato per identificare fattori angiogenici o antiangiogenici, definire le vie di segnalazione nell'angiogenesi e identificare i geni che regolano l'angiogenesi17.
Prima della disponibilità di iPSC-EC derivati dai pazienti, i ricercatori hanno utilizzato principalmente le EC coltivate per studiare l'angiogenesi16. Tuttavia, per le cellule endoteliali, è una sfida tecnica trasdurre geni esogeni con un virus, a causa del numero di passaggio limitato che le EC possono subire. Questo perché non c'è quasi abbastanza materiale cellulare da raccogliere da vasi umani sia da un intervento chirurgico o da donatori approvati corrispondenti. Con l'invenzione della tecnica di generazione iPSC da shinya Yamanaka, gli EC umani derivati dagli iPSC possono essere utilizzati in modo affidabile in esperimenti in vitro, come riportato in precedenza18.
Utilizzando EC viralmente trasdotti con un numero limitato di e passaggi può essere sufficiente per gli studi di segnalazione, ma per gli studi funzionali, è meglio generare linee di cellule staminali pluripotenti mutanti (o iPSC o HESC mirati a CRISPER/Cas9), quindi differenziarli in EC per gli studi di angiogenesi che utilizzano saggi di formazione dei tubi19. La formazione del tubo può essere utilizzata per valutare la funzione delle cellule endoteliali con mutazioni. Questo protocollo descrive anche la formazione di tubi su una piastra di angiogenesi, che è un metodo facile, conveniente e riproducibile.
Il protocollo seguente fornisce un metodo affidabile e sistemico per studiare il ruolo di geni specifici nella formazione vascolare, insieme a dettagli per il modello di espressione in vivo e la quantificazione funzionale in vitro per la modellazione della malattia umana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

Lo sviluppo vascolare è determinato dall'espressione sequenziale di geni specifici, che possono essere studiati eseguendo analisi di ibridazione in situ nel pesce zebra durante diverse fasi dello sviluppo. Per studiare il ruolo dell'endoglin(eng) nella formazione dei vasi durante lo sviluppo della telangiectasia ereditaria emorragica (HHT), il knockdown mirato mediato dal morfolino di eng nel pesce zebra viene utilizzato per studiarne l'espressione temporale e le funzioni associate. Qui, l'ibridazione dell'RNA in situ (WISH) viene impiegata per l'analisi di eng e dei suoi geni a valle negli embrioni di pesce zebra. Inoltre, i test di formazione dei tubi vengono eseguiti nelle cellule endoteliali differenziate dalle cellule staminali plurimi derivate dal paziente HHT (iPSC-ECs; con mutazioni di eng). Un sistema di amplificazione del segnale specifico che utilizza l'intera quantità In Situ Hybridization – WISH fornisce una risoluzione più alta e risultati di fondo inferiori rispetto ai metodi tradizionali. Per ottenere un segnale migliore, il tempo di post-fissazione viene regolato a 30 min dopo l'ibridazione della sonda. Poiché la colorazione a fluorescenza non è sensibile negli embrioni di pesce zebra, viene sostituita con colorazione diaminobezidina (DAB). In questo protocollo, le linee iPSC derivate dal paziente HHT contenenti una mutazione eng sono differenziate in cellule endoteliali. Dopo aver rivestito una piastra con matrice di membrana seminterrato per 30 min a 37 gradi centigradi, gli iPSC-EC vengono seminati come motrici in pozzi e tenuti a 37 gradi centigradi per 3 h. Quindi, la lunghezza del tubo e il numero di rami vengono calcolati utilizzando immagini microscopiche. Pertanto, con questo protocollo WISH migliorato, è dimostrato che l'espressione eng ridotta influisce sulla formazione di progenitore endoteliale negli embrioni di pesce zebra. Ciò è ulteriormente confermato dai saggi di formazione dei tubi utilizzando iPSC-ECs derivati da un paziente con HHT. Questi saggi confermano il ruolo per l'eng nei primi sviluppi vascolari.

L'ibridazione dell'intero montaggio in situ si basa su un principio simile al trasferimento di energia da risonanza a fluorescenza. È stato progettato per migliorare sia la sensibilità che la specificità nel pesce zebra ISH, nonché per amplificare i segnali specifici del bersaglio senza alterare il segnale di fondo.
Nei 24 embrioni di pesce zebra hpf, l'endoglin è altamente espresso nella vena cardinale posteriore ...

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Presentato qui è un protocollo per l'analisi dell'ibridazione dell'RNA in situ intera nel test di zebra fish e tube formation nelle cellule endoteliali derivate dalle cellule staminali derivate dal paziente per studiare il ruolo dell'endoglin nella formazione vascolare.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

L'ibridazione in situ a montaggio intero, WISH, fornisce un'alta risoluzione e un risultato di fondo basso rispetto ai metodi tradizionali. Inoltre, le piastre a U-slide migliorano la messa a fuoco alla stessa lunghezza focale utilizzando meno WISH può essere applicato su embrioni di topo, embrioni di Drosophila e altri tessuti difficili da maneggiare. Il saggio di formazione del tubo può essere applicato alle cellule androgene differenziate delle cellule staminali.WISH rende facile comprendere il significato funzionale della correzione della mutazione. La persona che dimostrerà la procedura è Yong Wang, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Lavorando al microscopio, utilizzare il sistema FemtoJet per iniettare due nanogrammi di morfolinos e 500 picogrammi di MRNA in embrioni a una cellula.Pratica la microiniezione di Morpholinos molte volte fino a quando non puoi iniettarla nelle cellule con successo e mantenere l'integrità delle uova. Incubare gli zigoti fino a quando non vengono dechorionati e raggiungere lo stato di sviluppo che corrisponde all'esperimento previsto. Come descritto nella tabella uno del manoscritto.Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire da 20 a 40 embrioni in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di soluzione 4%PFA preparata al momento a temperatura ambiente. Dopo aver riparato, lavato e disidratato gli embrioni come descritto nel manoscritto, mettere gli embrioni in un setaccio con rete di nylon sul fondo.Idratare gli embrioni lavandoli in sequenza nel 75%50% e nel 25% di metanolo per cinque minuti ciascuno. Dopo aver lavato gli embrioni con PBST, aggiungere 50 microlitri di proteinasi K nel tubo con gli embrioni. Dopo la digestione, rimuovere la proteinasi K e lavare gli embrioni con PBST tre volte per cinque minuti ogni volta.Aggiungere da 50 a 100 microlitri di sonde bersaglio miste in ogni tubo con gli embrioni. Incubare gli embrioni durante la notte a 40 gradi Celsius. Dopo aver lavato gli embrioni come descritto nel manoscritto, utilizzare il 4% di paraformaldeide per fissare gli embrioni per 30 minuti a temperatura ambiente.Quindi lavare gli embrioni in soluzione SSCT 2x tre volte per 15 minuti ogni volta a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione SSCT e sostituirla con 50 microlitri di Amp 1. Quindi incubare gli embrioni a 40 gradi Celsius.Dopo 30 minuti, lavare gli embrioni in soluzione 2x SSCT tre volte per 15 minuti ogni volta a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione SSCT e aggiungere 50 microlitri di Amp 2. Dopo aver incubato per 15 minuti e lavato l'embrione come fatto in precedenza, aggiungere 50 microlitri di Amp 3 e toccare delicatamente il tubo.Incubare gli embrioni a 40 gradi Celsius. Dopo 30 minuti lavare gli embrioni come descritto in precedenza. Quindi aggiungere 50 microlitri di Amp 4 dropwise e toccare con cura il tubo.Quindi incubare gli embrioni a 40 gradi Celsius per 15 minuti e lavarli tre volte con SSCT. Dopo aver preparato gli embrioni per l'imaging come descritto nel manoscritto, utilizzare un kit di substrato perossidasi DAB per macchiare il campione. Aggiungere 50 microlitri ciascuno dei reagenti di colore A, B e C a un millilitro di acqua distillata.E mescolare bene per ottenere un fluido di lavoro DAB completo. Aggiungere il fluido al campione e coprire per dieci minuti. Dopo aver accuratamente lavato i campioni, utilizzare un microscopio ottico per immaginirli.Per iniziare la coltivazione e il controllo degli IPSC HHT, aggiungere la matrice della membrana basale a sei piastre di coltura cellulare del pozzo per coprire il fondo dei pozzi. Incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la soluzione a matrice di membrana basale utilizzata dai pozzi e aggiungere due millilitri di mezzo mTeSR 1 in ogni pozzo.Quindi placcare gli IPSC raccolti dall'ultimo passaggio a circa una volta dieci alle sei cellule per pozzo. Dopo aver coltivato gli iPSC per circa quattro giorni, scambiare il mezzo di coltura cellulare con mezzo BEL integrato. Far crescere le cellule per tre giorni per generare cellule mesodermiche.Per espandere le cellule endoteliali vascolari, sostituire il mezzo con mezzo BEL integrato per quattro giorni. E poi trattare le cellule con lo stesso mezzo e coltura per altri tre o quattro giorni. Purificare le cellule endoteliali vascolari mature utilizzando CD31 Dynabeads secondo le istruzioni del kit.Quindi raccogliere le celle positive CD31 tramite buffer di eluizione. Mantenere ed espandere le cellule endoteliali purificate nel mezzo EC-SFM contenente VEGF165, bFGF e FBS. Per placcare le cellule endoteliali, iniziare aggiungendo 10 microlitri di matrice di membrana basale per pozzo alle piastre di angiogenesi.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Raccogliere le cellule endoteliali e rimostrarle in mezzo di crescita endoteliale 2 pipettando ripetutamente. Aggiungere 50 microlitri di questa sospensione cellulare alla matrice solidificata in ogni pozzo e quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius.Dopo tre o cinque ore di incubazione, utilizzare un microscopio ad alta risoluzione per valutare la formazione di tubi endoteliali. Acquisire immagini di almeno dieci aree per ogni gruppo. Ispezionare la lunghezza complessiva del tubo, il numero del tubo e i punti di diramazione.CISH e WISH sono stati eseguiti per determinare l'espressione dell'endoglina in embrioni post-fecondazione 24 ore su 24. Un marcatore endoteliale emogenico e un marcatore progenitore endoteliale sono stati usati per esaminare l'effetto del silenziamento dell'endoglina. Le frecce rosse indicano regioni in cui l'espressione di questi marcatori, aplnrna e npr1a, è diminuita significativamente.Il test di formazione del tubo endoteliale è stato eseguito sul mutante endoglino e controlla le cellule endoteliali derivate dall'iPSC. La formazione del tubo è stata valutata e fotografata dopo tre ore. La lunghezza del tubo, il numero del tubo e la ramificazione sono stati quantificati utilizzando il software ImageJ.Le cellule endoteliali mutanti formavano meno rami del controllo delle cellule endoteliali. E i rami nelle cellule endoteliali mutanti aumentarono significativamente dopo la stimolazione con fattore di crescita endoteliale vascolare. Questo metodo può essere utilizzato anche per la generazione di iPS dal sangue periferico.E con il metodo chiarisce il ruolo del endocrino nella formazione vascolare in vitro e in vivo. Sapendo che correggere la mutazione può fare la differenza nell'angiogenesi, è possibile trapiantare le cellule di nuovo nei pazienti per una potenziale terapia con cellule staminali.

Research

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Developmental Biology

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