Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

이 작품은 중국 줄기 세포 및 번역 연구의 국가 핵심 연구 개발 프로그램의 보조금에 의해 지원되었다 [보조금 번호 2016YFA0102300 (준 양에)];중국의 자연 과학 재단 [보조금 번호 81870051, 81670054 (준 양)]; 의학을 위한 CAMS 혁신 기금 (CIFMS) [보조금 번호 2016-I2M-4-003 (준 양에)]; PUMC 청소년 발견 및 중앙 대학에 대한 기본 연구 기금 [보조금 번호 2017310013 (팡 저우에)].

설명된 모든 동물 실험은 절강 대학 의과 대학의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 전체 마운트 인 시투 하이브리드화
<ol><li>제브라피쉬 라인 축산 및 복제품<ol>
<li>매일 14 시간 빛 / 10 h 다크 사이클로 재순환 양식 시스템에서 모든 성인 얼룩말 물고기를 26-28 °C에서 공급하고 올립니다. 다음 절차에 AB(야생형) 제브라피쉬 라인을 사용하십시오.</li>
		<li>계란을위한 ...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

이 프로토콜은 HHT 환자에서 유래된 iPSC-EC에 제브라피시 및 튜브 형성 분석을 위한 situ RNA 분석 플랫폼에서 개선된 전체 마운트를 적용했습니다. 전통적인 ISH 방법은 추가 실험 단계와 더 긴 실험 주기를 필요로한다. 프로토콜은 몇 가지 중요한 개선, 각각 WISH 분석 및 튜브 형성에 적용 된 HHT 환자에서 파생 된 독립적 인 이중 Z 프로브 및 iPSCs의 사용. 이러한 개선은 기존의 ISH에서 관찰되는 것과 비?...

eng (CD105)에 단 하나 돌연변이는 HHT를 가진 환자에서 보고되었습니다. 돌연변이는 증가된 EC 증식 및 감소된 유동 매개 EC 신장1,,2로이어집니다. 또한 이전에 는 ENG 결핍이 제브라피시3에서내피 마커 발현(즉, kdrl, cdh5, hey2)을감소시킨다고 보고되었다. Endoglin,주로 내피 세포에서 발현, 막 막 당단백질 및 성장 인자 β (TGF-β) 가족 구성원을 변형시키기위한 공동 수용체로서의 기능. 그것은 ECs 4를향해 줄기 세포 분화를 유도하기 위하여 Id1 발현을 포함하여 다운스트림 유전자를 통제하기 위하여 세포 표면에 BMP9 결합을 지시합니다. 따라서, eng 유전자는 혈관 발생 및 인간 혈관 질환5,,6에서중요한 역할을 한다. 우리는 이전에 eng 돌연변이를 품고 HHT 환자에게서 취득한 iPSCs 파생된 ECs의 분석에 선행된 zebrafish 태아에 있는 혈관 대형에 endoglin 녹다운의 효력을 검토했습니다7. 이 프로토콜은 내피 전구 마커 발현 및 튜브 형성에 대한 ENG 결핍의 효과를 보여 주며, 이는 시험관 내 혈관신생을 측정하기 위한 정량화 가능한 방법이다.
eng 공간 및 시간발현을 연구하기 위해, WISH는 생체 내 유전자 발현을 검출하기 위해 사용된다8. 상기 소성형화(ISH)는 고정된 시편에서 표적 핵산 하이브리드를 검출하고 시각화하기 위해 표적 핵산(DNA 또는 mRNA)의 보체 서열을 가진 표지된 프로브를 사용하는 방법이다. 이 과정은 생체 내에서 유전자 발현 신호를 증폭시키고 현미경 검사법에 의한 유전자의 발현을 감지하는 데 사용됩니다. WISH는 다양한 모델 동물, 특히 제브라피시9에서널리 사용되어 왔습니다. 그것은 또한 다음 데이터를 취득 하는 데 사용 됩니다.: 1) 유전자 기능 및 분류에 대 한 정보를 제공 하는 유전자 공간/시간 발현 패턴; 및 2) 고처리량 약물 또는 돌연변이 스크리닝에 사용되는 구체적으로 발현된 유전자마커(10).
발색성 프로브는 높은 배경 잡음 및 비특이적 신호11,,12의결과로 SITU 혼성화 (CISH)에서 전통적인 염색체로 쉽게 분해됩니다. WISH 방법은 두 개의 독립적인 이중 Z 프로브를 사용하며, 이는 표적 RNA 서열을 혼성화하도록 설계되었습니다. 각 프로브는 표적 RNA 및 14염기 꼬리 서열에 상보적인 18-25 서열을 함유한다(Z로 개념화). 대상 프로브는 쌍(이중 Z)으로 사용됩니다. 두 개의 테일 서퀀스는 함께 증폭기용 20개의 결합 부위를 포함하는 프리앰프에 대한 28개의 염기 혼성화 사이트를 형성한다. 증폭기는 차례로, 라벨 프로브를 위한 20개의 결합 사이트를 포함하고 이론적으로 각 표적 RNA 순서를 위한 8,000개의 레이블까지 산출할 수 있습니다.
이 첨단 기술은 조직 형태(13)를보존하면서 단일 분자 시각화를 달성하기 위해 동시 신호 증폭 및 배경 억제를 용이하게합니다. WISH 방법의 추가 수정은 추가 고정 및 DAB 염색을 포함하여 이전 연구14를기반으로합니다. 여기서 제공되는 표적 RNA가 부분적으로 감소되거나 저하되더라도 작동할 수 있는 개선된 WISH 프로토콜이 있다. 장점은 RNase없는 조건없이 24 시간에서 완료 할 수 있다는 것을 포함한다. 또한 여러 대상의 여러 채널을 통해 신호를 동시에 감지할 수 있으며, 그 결과는 서로 다른 고처리량 자동화 플랫폼의 결과와 일관되고 호환됩니다.
동물 모델의 결과는 인간에서 발생하는 동일한 현상을 반영할 필요가 없습니다. ENG에는 고아 지역에서 이황화물 다리를 형성하는 보존 된 시스테인, C30-C207 및 C53-C182 쌍이 포함되어 있습니다. HHT 환자에서 eng의 역할을 추가로 연구하기 위해, HHT 환자로부터 유래된 iPSCs를 가진 관 형성 성 세포는 eng 돌연변이가 없는 세포에서 수행되었다(Cys30Arg, C30R)15. Kubota 외. 먼저 튜브 형성 실험16을보고 한 후, 분석실험은 여러 가지 방법으로 개발되었다. 혈관신생 또는 항혈관신생 인자를 식별하고, 혈관신생에서 신호 경로를 정의하고, 혈관신생을 조절하는 유전자를 식별하는 데 사용되어 왔다17.
환자 유래 iPSC-EC의 가용성 이전에, 연구원은 혈관 신생을 연구하기 위하여 주로 배양된 EC를이용했습니다 16. 그러나, 내피 세포의 경우, IC가 겪을 수있는 제한된 통로 수 때문에 바이러스로 외인성 유전자를 변환하는 것은 기술적 인 도전입니다. 이것은 수술 또는 일치하는 승인된 기증자에서 인간 적인 혈관에서 집합될 거의 충분한 세포 물질이 없기 때문입니다. 야마나카 신야에 의한 iPSC 생성 기술의 발명으로, iPSCs로부터 유래된 인간 ECs는 시험관 내 실험에서 안정적으로 사용될 수 있다고18일이전에 보고된 바와 같이.
제한된 수와 통로를 가진 바이러스성 으로 변환된 ECs를 사용하는 것은 신호 연구 결과를 위해 충분할지도 모르지만, 기능적인 연구 결과를 위해, 돌연변이 다능성 줄기 세포주(iPSCs 또는 CRISPER/Cas9 표적 hESCs)를 생성하는 것이 좋습니다, 그 다음 관 형성 분석제19를사용하는 혈관 신생 연구를 위해 ECs로 분화. 관 형성은 돌연변이를 베어링 내피 세포의 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜은 또한 쉽고 비용 효율적이며 재현 가능한 방법인 μ-slide 혈관신생 플레이트에서 튜브 형성을 설명합니다.
아래 프로토콜은 생체 내 발현 패턴 및 인체 질환 모델링을 위한 생체외 기능적 정량화에 대한 세부 사항과 함께 혈관 형성에서 특정 유전자의 역할을 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 체계적인 방법을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

혈관 발달은 특정 유전자의 순차적 발현에 의해 결정되며, 이는 상이한 발달 단계 동안 제브라피시의 실화 혼성 분석실험에서 수행함으로써 연구될 수 있다. 유전 출혈성 모두랑성 말단확장증 (HHT)의 발달 도중 혈관 형성에 있는 endoglin (eng)의 역할을 조사하기 위하여는, zebrafish에 있는 eng의 모르폴리노 중재한 표적 녹다운은 그것의 측두식 및 관련 기능을 공부하기 위하여 이용됩니다. 여기서, 제브라피시 배아에서 의 eng 및 그 하류 유전자의 분석을 위해 위시(WISH)의 전체 마운트가 채용된다. 또한, 튜브 형성 은 HHT 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 에서 수행 -분화 내피 세포 (iPSC-ECs; eng 돌연변이와 함께). 전체 양을 사용하는 특정 신호 증폭 시스템 인 시투 하이브리드화 – WISH는 기존 방법에 비해 더 높은 해상도와 낮은 배경 결과를 제공합니다. 더 나은 신호를 얻기 위해, 포스트 픽스레이션 시간은 프로브 혼성화 후 30분으로 조정된다. 형광 염색은 제브라피시 배아에 민감하지 않기 때문에, 여기에서 염색하는 디아미노베지딘(DAB)으로 대체된다. 이 프로토콜에서, eng 돌연변이를 포함하는 HHT 환자 유래 iPSC 라인은 내피 세포로 분화된다. 37°C에서 30분 동안 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅한 후, iPSC-EC는 웰내로 단층으로 시드되고 3시간 동안 37°C에서 유지된다. 그런 다음, 튜브 길이와 가지의 수는 현미경 이미지를 사용하여 계산된다. 따라서, 이러한 개선된 WISH 프로토콜을 통해, 감소된 eng 발현이 제브라피시 배아에서 내피 전구 형성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 이것은 HHT를 가진 환자에게서 파생된 iPSC-EC를 사용하여 관 대형 검역에 의해 추가확인됩니다. 이러한 해약은 초기 혈관 발달에서 eng에 대한 역할을 확인한다.

전체 마운트 인 시투 혼성화는 형광 공명 에너지 전달과 유사한 원리를 기반으로합니다. 그것은 제브라피쉬 ISH의 감도와 특이성을 모두 향상시키고 배경 신호에 영향을 주지 않고 표적 별 신호를 증폭하도록 설계되었습니다.
24 hpf 제브라피쉬 배아에서, 엔도글린은 후방 추기경 정맥(PCV), 분절간 혈관(ISV) 및 혈액섬<sup cl...

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

여기서 제시된 것은 혈관 형성에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 환자 유래 유도 만능 줄기 세포 유래 내피 세포에서 제브라피쉬 및 튜브 형성 분석에서 의 제브라피시 및 튜브 형성 분석에서 전체 마운트에 대한 프로토콜이다.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

시투 혼성화의 전체 마운트인 WISH는 기존 방법에 비해 고해상도와 낮은 배경 결과를 제공합니다. 또한, U-슬라이드 플레이트는 마우스 배아, 드로소필라 배아 및 취급이 어려운 다른 조직에 적용될 수 있는 적은 소원을 사용하여 동일한 초점 길이로 초점을 개선한다. 관 형성 분석체는 줄기 세포 분화 안드로겐 세포에 적용될 수 있다.WISH를 사용하면 돌연변이 교정의 기능적 의미를 쉽게 이해할 수 있습니다. 절차를 시연할 사람은 내 실험실에서 연구 조수인 용왕입니다. 현미경으로 작업, 펨토젯 시스템을 사용하여 1 세포 배아에 Morpholinos의 두 나노 그램과 500 피코그램을 주입.성공적으로 세포에 주입하고 계란의 무결성을 유지할 수 있을 때까지 Morpholinos의 미세 주입을 여러 번 연습하십시오. zygotes가 비반향될 때까지 자고테를 배양하고 의도된 실험에 해당하는 개발 상태에 도달합니다. 표에 설명된 바와 같이 원고 중 하나.다음으로 플라스틱 파이펫을 사용하여 20~40개의 배아를 1.5밀리리터 튜브로 옮기습니다. 실온에서 갓 준비된 4% PFA 용액 1밀리리터를 추가합니다. 원고에 설명된 바와 같이 배아를 고정, 세척 및 탈수한 후, 배아를 바닥에 나일론 메쉬로 체에 놓습니다.배아를 75%50%와 메탄올 25%로 각각 5분간 순차적으로 세척하여 수분을 공급합니다. PBST로 배아를 세척한 후, 배아를 통해 50마이크로리터의 단백질제 K를 튜브에 넣습니다. 소화 후, 단백질을 제거하고 매번 5 분 동안 PBST로 배아를 세 번 씻습니다.배아를 사용하여 각 튜브에 혼합 표적 프로브의 50~100마이크로리터를 추가합니다. 하룻밤 사이에 배아를 섭씨 40도에서 배양합니다. 원고에 설명된 바와 같이 배아를 세척한 후 4%의 파라포름알데히드를 사용하여 실온에서 30분 동안 배아를 고치게 한다.그런 다음 실온에서 매번 15분 동안 2x SSCT 용액으로 배아를 세 번 씻는다. SSCT 용액을 제거하고 Amp 1의 50 마이크로리터로 교체하십시오. 그런 다음 섭씨 40도에서 배아를 배양합니다.30분 후 실온에서 매번 15분 동안 2x SSCT 용액으로 배아를 세 번 씻는다. SSCT 용액을 제거하고 Amp 2의 마이크로리터 50을 추가합니다. 15분 동안 배양하고 배아를 세척한 후 Amp 3의 마이크로리터 50기를 넣고 튜브를 부드럽게 누릅니다.섭씨 40도에서 배아를 배양하십시오. 30 분 후에 이전에 설명한 바와 같이 배아를 씻는다. 그런 다음 Amp 4의 마이크로리터 50기를 드롭와이즈로 추가하고 조심스럽게 튜브를 누릅니다.그런 다음 배아를 섭씨 40도에서 15분 동안 배양하고 SSCT로 세 번 씻습니다. 원고에 설명된 바와 같이 이미징을 위한 배아를 준비한 후, DAB peroxidase 기판 키트를 사용하여 표본을 얼룩지게 한다. 각 50마이크로리터의 컬러 시약 A, B, C를 증류수 1밀리리터에 추가합니다.그리고 완전한 DAB 작업 유체를 얻기 위해 잘 혼합. 시편에 액체를 넣고 10분 동안 덮습니다. 철저하게 표본을 세척 한 후, 그들을 이미지 광학 현미경을 사용합니다.HHT iPSC의 배양 및 제어를 시작하려면, 우물의 바닥을 커버하기 위해 6 개의 잘 세포 배양 판에 지하 막 매트릭스를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 접시를 배양합니다. 다음으로, 중고 지하 멤브레인 매트릭스 용액을 우물에서 제거하고, 각각의 우물에 mTeSR 1 배지의 2밀리리터를 추가한다.그런 다음 마지막 통로에서 수확한 iPSC를 10배 정도에서 6개의 세포로 플레이트한다. 약 4일 동안 iPSC를 배양한 후, 세포 배양 배지를 보충된 BEL 배지로 교환한다. 중피 세포를 생성하기 위해 3 일 동안 세포를 성장시다.혈관 내피 세포를 확장하려면 배지를 4 일 동안 보충 된 BEL 배지로 교체하십시오. 그리고 세포를 동일한 배지 및 배양으로 3~4일 간 치료한다. 키트 지침에 따라 CD31 Dynabeads를 사용하여 성숙한 혈관 내피 세포를 정화합니다.그런 다음 용출 버퍼에 의해 CD31 양수 세포를 수집합니다. VEGF165, bFGF 및 FBS를 함유하는 EC-SFM 배지에서 정제된 내피 세포를 유지 및 확장한다. 내피 세포를 플레이트하기 위해 혈관 신생 판에 잘 당 지하 막 매트릭스 10 마이크로 리터를 첨가하여 시작합니다.30분 동안 37°C의 플레이트를 배양합니다. 내피 세포를 수확하고 반복적으로 파이펫팅하여 내피 성장 매체 2에서 재보식하십시오. 각 우물의 고형화된 매트릭스에 이 세포 현탁액의 50마이크로리터를 추가한 다음 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.3~5시간 의 배양 후 고해상도 현미경을 사용하여 내피 튜브 형성을 평가합니다. 각 그룹에 대해 최소 10개의 영역의 이미지를 캡처합니다. 전체 튜브 길이, 튜브 번호 및 분기 점을 검사합니다.CISH와 WISH는 24시간 후 수정 배아에서 엔도글린의 발현을 결정하기 위해 수행되었다. 혈진성 내피 마커와 내피 전구 마커는 endoglin 침묵의 효과를 검사하기 위해 사용되었다. 적색 화살표는 이러한 마커, aplnrna 및 npr1a의 발현이 현저히 감소한 영역을 나타냅니다.내피관 형성 분석체는 endoglin 돌연변이 및 제어 iPSC 유래 내피 세포에서 수행되었다. 튜브 형성을 평가하고 3 시간 후에 촬영하였다. Tube 길이, 튜브 번호 및 분기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.돌연변이 내피 세포는 내피 세포를 제어하는 것보다 적은 가지를 형성했다. 그리고 돌연변이 내피 세포의 가지는 혈관 내피 성장 인자를 가진 자극 후에 현저하게 증가했습니다. 이 방법은 또한 말초 혈액에서 iPS 생성을 위해 사용될 수 있다.그리고 방법에 의해 체외 및 생체 내 혈관 형성에서 내분비의 역할을 명확히한다. 돌연변이를 교정하면 혈관 신생에 차이를 만들 수 있다는 것을 알고, 잠재적 인 줄기 세포 치료를 위해 환자로 세포를 다시 이식 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...