Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key Research and Development Program of China-stem celle og translasjonell forskning [tilskuddsnummer 2016YFA0102300 (til Jun Yang)];Nature Science Foundation of China [tilskuddsnummer 81870051, 81670054 (til Jun Yang)]; CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [tilskuddsnummer 2016-I2M-4-003 (til Jun Yang)]; PUMC Youth Found og Fundamental Research Funds for de sentrale universitetene [tilskuddsnummer 2017310013 (til Fang Zhou)].

Alle dyreforsøk som ble beskrevet ble godkjent av Forskningsetikkkomiteen ved Zhejiang University school of Medicine.
1. Helmontering in situ hybridisering
<ol><li>Sebrafisk linje husdyrhold og reproduksjon<ol>
<li>Fôr og hev alle voksne sebrafisk ved 26-28 °C i et resirkulerende akvakultursystem med 14 t lys/10 t mørk syklus for hver dag. Bruk AB (wild-type) sebrafisk linjer for følgende prosedyrer.</li>
		<li>Legg et lag småstein i bunnen av avlsboksen som et ly for egg. Gruppe forel...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Denne protokollen brukte en forbedret helmontert in situ RNA-analyseplattform for sebrafisk- og rørdannelsesanalyser på iPSC-ECer avledet fra en HHT-pasient. Den tradisjonelle ISH-metoden krever en lengre eksperimentell syklus med ekstra eksperimentelle trinn. Protokollen har noen viktige forbedringer, bruk av uavhengige doble Z-sonder og iPSCer avledet fra en pasient med HHT som ble brukt i WISH-analyser og rørdannelse, henholdsvis. Disse forbedringene er avgjørende for å forbedre deteksjonsfølsomheten sammenligne...

En enkelt mutasjon på eng (CD105) er rapportert hos pasienter med HHT. Mutasjonen fører til økt EF-spredning og redusert strømningsmediert EC-forlengelse1,,2. Det har også tidligere blitt rapportert at ENG-mangel reduserer endotelmarkører uttrykk (dvs. kdrl, cdh5, hey2) i sebrafisk3. Endoglin, hovedsakelig uttrykt i endotelceller, er en transmembrane glykoprotein og fungerer som en co-reseptor for å transformere vekstfaktor β (TGF-β) familiemedlemmer. Det leder BMP9 binding på celleoverflaten for å regulere nedstrøms genet, inkludert Id1 uttrykk, å indusere stamcelle differensiering mot ECs4. Dermed spiller eng genet viktige roller i vaskuogenese og menneskelig vaskulær sykdom5,6. Vi har tidligere undersøkt effekten av endoglin knockdown på fartøydannelse i sebrafisk embryoer, etterfulgt av analyse av iPSCs-avledet ECs ervervet fra en HHT pasient bærer en eng mutasjon7. Denne protokollen viser effekten av ENG-mangel på endotelstammarkøruttrykk og rørdannelse, som er en kvantifiserbar metode for måling av in vitro angiogenese.
For å studere eng romlig og timelig uttrykk, er WISH ansatt for å oppdage genuttrykk in vivo8. In situ hybridization (ISH) er en metode for å bruke merkede sonder med komplement sekvenser av målkjernesyrer (DNA eller mRNA) for å oppdage og visualisere målkjernesyre hybrider i en fast prøve. Prosessen forsterker genuttrykkssignaler in vivo og brukes til å oppdage uttrykket av gener ved mikroskopi. WISH har vært mye brukt i ulike modell dyr, spesielt i sebrafisk9. Det brukes også til å skaffe følgende data: 1) gen romlige / temporale uttrykksmønstre, som gir informasjon om genfunksjon og klassifisering; og 2) spesielt uttrykte genmarkører som brukes i høygjennomstrømning narkotika eller mutant screening10.
Kromogene sonder er lett degradert med tradisjonelle kromosom in situ hybridization (CISH), noe som resulterer i høy bakgrunnsstøy og uspesifikke signaler11,12. WISH-metoden bruker to uavhengige doble Z-sonder, som er designet for å hybridisere for å målrette RNA-sekvenser. Hver sonde inneholder en 18-25 sekvens komplementær til målet RNA og en 14 base tail sekvens (konseptualisert som Z). Målsondene brukes i et par (dobbel Z). De to halesekvensene danner sammen et 28-base hybridiseringssted for foramplifieren, som inneholder 20 bindingssteder for forsterkeren. Forsterkeren inneholder i sin tur 20 bindingssteder for etikettsonden og kan teoretisk gi opptil 8000 etiketter for hver mål RNA-sekvens.
Denne avanserte teknologien forenkler samtidig signalforsterkning og bakgrunnsundertrykkelse for å oppnå visualisering med ett molekyl samtidig som vevmorfologienbevares 13. Ytterligere endring av WISH-metodene er basert på tidligere forskning14, inkludert ekstra fiksering og DAB-farging. Forutsatt her er en forbedret WISH-protokoll som kan fungere selv om målet RNA er delvis redusert eller degradert. Fordeler inkluderer at det kan fullføres i 24 timer uten RNase-frie forhold. Signaler kan også oppdages samtidig gjennom flere kanaler fra flere mål, og resultatene er konsistente og kompatible med resultater fra forskjellige automatiseringsplattformer med høy gjennomstrømning.
Resultater fra dyremodeller gjenspeiler ikke det samme fenomenet som oppstår hos mennesker. ENG inneholder to par bevarte cysteiner, C30-C207 og C53-C182, som danner disulfidbroer i foreldreløse områder. For ytterligere å studere rollen som eng hos HHT-pasienter, har rørdannelsesanalyser med iPSCer avledet fra HHT-pasienter blitt utført i celler uten/med eng-mutasjoner (Cys30Arg, C30R)15. Etter at Kubota et al. først rapporterte rørdannelseseksperimentet16,er analysen utviklet på flere måter. Det har blitt brukt til å identifisere angiogene eller antiangiogene faktorer, definere signalveiene i angiogenese, og identifisere gener som regulerer angiogenese17.
Før tilgjengeligheten av pasientavledede iPSC-ECer, brukte forskere primært kultiverte ECer til å studere angiogensis16. Men for endotelceller er det en teknisk utfordring å transduce eksogene gener med et virus, på grunn av det begrensede passasjenummeret som ECer kan gjennomgå. Dette er fordi det er knapt nok cellulært materiale til å bli samlet inn fra menneskelige fartøy enten fra kirurgi eller matchet godkjente givere. Med oppfinnelsen av iPSC generasjon teknikk av Shinya Yamanaka, menneskelige ECer avledet fra iPSCs kan brukes pålitelig i in vitro eksperimenter, som rapportert tidligere18.
Ved hjelp av viralt transduserte ECer med begrenset antall og passasjer kan være tilstrekkelig for signalstudier, men for funksjonelle studier er det bedre å generere muterte pluripotente stamcellelinjer (enten iPSCer eller CRISPER / Cas9-målrettede hESCer), og deretter skille dem inn i ECer for angiogenesestudier som bruker rørdannelsesanalyser19. Rørdannelse kan brukes til å evaluere funksjonen til endotelceller som bærer mutasjoner. Denne protokollen beskriver også rørdannelse på en μ-slide angiogenese plate, som er en enkel, kostnadseffektiv og reproduserbar metode.
Protokollen nedenfor gir en pålitelig og systemisk metode for å studere rollen som spesifikke gener i vaskulær formasjon, sammen med detaljer for in vivo uttrykksmønster og in vitro funksjonell kvantifisering for modellering av menneskelig sykdom.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

Vaskulær utvikling bestemmes av det sekvensielle uttrykket av spesifikke gener, som kan studeres ved å utføre in situ hybridiseringsanalyser i sebrafisk under ulike utviklingsstadier. For å undersøke rollen som endoglin(eng) i skipsdannelse under utviklingen av arvelig hemorragisk telangiectasia (HHT), brukes morpholino-mediert målrettet knockdown av eng i sebrafisk til å studere sitt temporale uttrykk og tilhørende funksjoner. Her er helmontert in situ RNA hybridisering (WISH) ansatt for analyse av eng og dets nedstrøms gener i sebrafiskembryoer. Også rørdannelsesanalyser utføres i HHT pasientavledede indusert pluripotent stamcelledifferensierte endotelceller (iPSC-ECer; med eng mutasjoner). Et spesifikt signalforsterkende system ved hjelp av hele beløpet In Situ Hybridization – WISH gir høyere oppløsning og lavere bakgrunnsresultater sammenlignet med tradisjonelle metoder. For å få et bedre signal, justeres etterløsningstiden til 30 minutter etter sondehybridisering. Fordi fluorescensfarging ikke er følsom i sebrafiskembryoer, erstattes den med diaminobezidin (DAB) farging her. I denne protokollen differensieres HHT pasientavledede iPSC-linjer som inneholder en eng-mutasjon, til endotelceller. Etter å ha dekket en plate med kjellermembranmatrise i 30 min ved 37 °C, seedes iPSC-ECer som monolager i brønner og oppbevares ved 37 °C i 3 timer. Deretter beregnes rørlengden og antall grener ved hjelp av mikroskopiske bilder. Dermed, med denne forbedrede WISH-protokollen, er det vist at redusert eng-uttrykk påvirker endotelstamdannelse i sebrafiskembryoer. Dette bekreftes videre av rørdannelsesanalyser ved hjelp av iPSC-ECer avledet fra en pasient med HHT. Disse analysene bekrefter rollen for eng i tidlig vaskulær utvikling.

Hele mount in situ hybridization er basert på et prinsipp som ligner på fluorescens resonans energioverføring. Den er designet for å forbedre både følsomhet og spesifisitet i sebrafisk ISH samt forsterke målspesifikke signaler uten å påvirke bakgrunnssignalet.
I 24 hpf sebrafisk embryoer, er endoglin sterkt uttrykt i den bakre kardinal vene (PCV), intersegmentale fartøy (ISVs), og blod øyer3...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Presentert her er en protokoll for hel-mount in situ RNA hybridisering analyse i sebrafisk og rør formasjon analyse i pasient-avledet indusert pluripotent stamcelle-avledede endotelceller å studere rollen som endoglin i vaskulær formasjon.

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Hele braketten, in situ hybridisering, WISH, gir en høy oppløsning og et lavt bakgrunnsresultat sammenlignet med tradisjonelle metoder. Også U-slide plater forbedre fokus på samme brennvidde ved hjelp av mindre WISH kan brukes på mus embryoer, Drosophila embryoer og annet vev vanskelig å håndtere. Rørformasjonsanalysen kan brukes på stamcelle differensierte androgenceller.WISH gjør det enkelt å forstå den funksjonelle betydningen av mutasjonskorreksjon. Personen som skal demonstrere prosedyren er Yong Wang, en forskningsassistent fra laboratoriet mitt. Arbeide under et mikroskop, bruke FemtoJet systemet til å injisere to nanograms av Morpholinos og 500 picograms av MRNA i en-celle embryoer.Øv på mikroinjeksjonen av Morpholinos mange ganger til du kan injisere den i celler med hell og holde eggenes integritet. Inkuber zygotene til de er dehorionated og nå utviklingstilstanden som tilsvarer det tiltenkte eksperimentet. Som beskrevet i tabell en av manuskriptet.Deretter bruker du en plastpipette til å overføre 20 til 40 embryoer til et 1,5 milliliter rør. Tilsett en milliliter nylaget 4% PFA-løsning ved romtemperatur. Etter å ha fikset, vasket og dehydrert embryoene som beskrevet i manuskriptet, legg embryoene i en sil med nylonnett nederst.Hydrer embryoene ved å vaske dem sekvensielt i 75% 50% og 25% metanol i fem minutter hver. Etter å ha vasket embryoene med PBST, tilsett 50 mikroliter proteinase K i røret med embryoene. Etter fordøyelsen, fjern proteinase K og vask embryoene med PBST tre ganger i fem minutter hver gang.Tilsett 50 til 100 mikroliter blandede målsonder i hvert rør med embryoene. Inkuber embryoene over natten ved 40 grader Celsius. Etter å ha vasket embryoene som beskrevet i manuskriptet, bruk 4% paraformaldehyd for å fikse embryoene i 30 minutter ved romtemperatur.Vask deretter embryoene i 2x SSCT-løsning tre ganger i 15 minutter hver gang ved romtemperatur. Fjern SSCT-oppløsningen og bytt den ut med 50 mikroliter amp 1. Deretter inkubere embryoene ved 40 grader Celsius.Etter 30 minutter vask embryoene i 2x SSCT-løsning tre ganger i 15 minutter hver gang ved romtemperatur. Fjern SSCT-oppløsningen og tilsett 50 mikroliter amp 2. Etter inkubering i 15 minutter og vasket embryoet som gjort tidligere, legg til 50 mikroliter amp 3 og bank forsiktig på røret.Inkuber embryoene ved 40 grader Celsius. Etter 30 minutter vask embryoene som beskrevet tidligere. Tilsett deretter 50 mikroliter amp 4 dråpevis og bank forsiktig på røret.Deretter inkuber embryoene ved 40 grader Celsius i 15 minutter og vask dem tre ganger med SSCT. Etter å ha forberedt embryoene for avbildning som beskrevet i manuskriptet, bruk et DAB peroksidasesubstratsett til å flekke prøven. Tilsett 50 mikroliter hver av fargereagensene A, B og C til en milliliter destillert vann.Og bland godt for å få en komplett DAB arbeidsvæske. Tilsett væsken til prøven og dekk i ti minutter. Etter grundig vasking av prøvene, bruk et optisk mikroskop for å bilde dem.For å begynne å dyrke og kontrollere HHT iPSCer, legg kjellermembranmatrisen til seks brønncellekulturplater for å dekke bunnen av brønnene. Inkuber platene i en time ved 37 grader Celsius. Deretter fjerner du den brukte kjellermembranmatriseløsningen fra brønnene, og legger til to milliliter mTeSR 1 medium i hver brønn.Deretter plate iPSCs høstet fra den siste passasjen på omtrent en ganger ti til de seks cellene per brønn. Etter å ha dyrket iPSCene i omtrent fire dager, bør du bytte cellekulturmediet med supplert BEL-medium. Vokse cellene i tre dager for å generere mesoderm celler.For å utvide vaskulære endotelceller, erstatt mediet med supplert BEL-medium i fire dager. Og deretter behandle cellene med samme medium og kultur i ytterligere tre til fire dager. Rens de modne vaskulære endotelcellene ved hjelp av CD31 Dynabeads i henhold til instruksjonene for settet.Deretter samler cd31 positive celler ved elution buffer. Vedlikehold og utvid de rensede endotelcellene i EC-SFM-mediet som inneholder VEGF165, bFGF og FBS. For å plate endotelceller, begynn med å legge til 10 mikroliter kjellermembranmatrise per brønn til angiogeneseplatene.Inkuber platene ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Høst endotelcellene og gjenoppliv dem i endotelvekst medium 2 ved å pipettere gjentatte ganger. Tilsett 50 mikroliter av denne cellesuspensjonen til den størknede matrisen i hver brønn og inkuber deretter cellene ved 37 grader Celsius.Etter tre til fem timers inkubasjon, bruk et høyoppløselig mikroskop for å vurdere endotelrørdannelse. Ta bilder av minst ti områder for hver gruppe. Inspiser den totale rørlengden, rørnummeret og forgreningspunktene.CISH og WISH ble utført for å bestemme uttrykket av endoglin i 24 timer etter befruktning embryoer. En hemogenic endotelmarkør og en endotelstamfarmarkør ble brukt til å undersøke effekten av endoglinavvising. De røde pilene angir områder der uttrykket for disse markørene, aplnrna og npr1a, betydelig redusert.Endotelrørformasjonsanalysen ble utført på endoglinmutanten og kontrollerer iPSC-avledede endotelceller. Rørdannelsen ble vurdert og fotografert etter tre timer. Tube lengde, tube nummer og forgrening ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ programvare.Muterte endotelceller dannet færre grener enn kontroll endotelceller. Og grener i muterte endotelceller økte betydelig etter stimulering med vaskulær endotelvekstfaktor. Denne metoden kan også brukes til iPS-generering fra perifert blod.Og ved metoden klargjør rollen som endokrin i vaskulær formasjon in vitro og in vivo. Å vite at korrigering av mutasjonen kan gjøre en forskjell i angiogenese, er det mulig å transplantere cellene tilbake til pasienter for potensiell stamcellebehandling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount i Situ hybridisering for Astyanax embryo

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping og kvantifisering av In Situ Hybridisering Farging i Sebrafisk

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...