Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Células-Tronco da China e pesquisa translacional [número de subvenção 2016YFA0102300 (para Jun Yang)];a Nature Science Foundation of China [número de subvenção 81870051, 81670054 (para Jun Yang)]; o CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) [número de subvenção 2016-I2M-4-003 (para Jun Yang)]; o PUMC Youth Found e o Fundamental Research Funds for the Central Universities [número de subvenção 2017310013 (para Fang Zhou)].

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang.
1. Hibridização total in situ
<ol><li>Criação e reprodução da linha zebrafish<ol>
<li>Alimente e levante todos os zebrafish adultos a 26-28 °C em um sistema de aquicultura recirculante com 14 h de ciclo escuro de luz/10h para cada dia. Use linhas de zebrafish AB (tipo selvagem) para os seguintes procedimentos.</li>
		<li>Coloque uma camada...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Este protocolo aplicou uma melhor plataforma de análise de RNA in situ in situ para ensaios de formação de zebrafish e tubos em iPSC-CEs derivados de um paciente HHT. O método ISH tradicional requer um ciclo experimental mais longo com etapas experimentais extras. O protocolo possui algumas melhorias importantes, o uso de sondas independentes duplas Z e iPSCs derivados de um paciente com HHT que foram aplicados em ensaios WISH e formação de tubos, respectivamente. Esses refinamentos são cruciais para aumentar a se...

Uma única mutação no eng (CD105) foi relatada em pacientes com HHT. A mutação leva ao aumento da proliferação da CE e à redução do alongamento da CE mediada pelo fluxo1,,2. Também foi relatado anteriormente que a deficiência de ENG reduz a expressão de marcadores endoteliais (ou seja, kdrl, cdh5, hey2) em zebrafish3. Endoglin, expressa principalmente em células endoteliais, é uma glicoproteína transmembrana e funciona como um co-receptor para transformar o fator de crescimento β (TGF-β) membros da família. Ele direciona a ligação BMP9 na superfície celular para regular o gene a jusante, incluindo a expressão Id1, para induzir a diferenciação de células-tronco em relação aos CE4. Assim, o gene eng desempenha papéis importantes na vasculogênese e na doença vascular humana5,6. Examinamos anteriormente os efeitos da derrubada de endoglin na formação de vasos em embriões de zebrafish, seguido pela análise de CEs derivados de iPSCs adquiridos de um paciente com HHT com uma mutação eng 7. Este protocolo demonstra os efeitos da deficiência de ENG na expressão do marcador progenitor endotelial e na formação de tubos, que é um método quantificável para medir angiogênese in vitro.
Para estudar a expressão espacial e temporal, o WISH é empregado para detectar a expressão genética in vivo8. A hibridização in situ (ISH) é um método de uso de sondas rotuladas com sequências complementares de ácidos nucleicos-alvo (DNA ou mRNA) para detectar e visualizar híbridos de ácido nucleico alvo em uma amostra fixa. O processo amplifica sinais de expressão genética in vivo e é usado para detectar a expressão de genes por microscopia. A WISH tem sido amplamente utilizada em vários animais modelo, especialmente em zebrafish9. Também é usado para adquirir os seguintes dados: 1) padrões de expressão espacial/temporal genética, que fornecem informações sobre a função e classificação genética; e 2) marcadores genéticos expressos especificamente que são usados em drogas de alta produtividade ou triagem mutante10.
As sondas cromogênicas são facilmente degradadas com o cromossomo tradicional in situ hibridização (CISH), o que resulta em alto ruído de fundo e sinais inespecíficos11,12. O método WISH usa duas sondas Z duplas independentes, que são projetadas para hibridizar para atingir sequências de RNA. Cada sonda contém uma sequência de 18-25 complementar ao RNA alvo e uma sequência de cauda base de 14 (conceitualizada como Z). As sondas-alvo são usadas em um par (duplo Z). As duas sequências de cauda juntas formam um local de hibridização de 28 bases para o pré-amplificador, que contém 20 locais de ligação para o amplificador. O amplificador, por sua vez, contém 20 sites de vinculação para a sonda de etiqueta e pode teoricamente render até 8.000 etiquetas para cada sequência de RNA de destino.
Esta tecnologia avançada facilita a amplificação simultânea de sinal e a supressão de fundo para alcançar a visualização de molécula única, preservando a morfologia tecidual13. Outra modificação dos métodos WISH baseia-se em pesquisas anteriores14, incluindo fixação extra e coloração da DAB. Desde aqui está um protocolo WISH melhorado que pode funcionar mesmo que o RNA alvo seja parcialmente diminuído ou degradado. As vantagens incluem que ele pode ser concluído em 24 horas sem condições livres de RNase. Os sinais também podem ser detectados simultaneamente através de vários canais de vários alvos, e os resultados são consistentes e compatíveis com resultados de diferentes plataformas de automação de alto rendimento.
Os resultados de modelos animais não refletem o mesmo fenômeno que ocorre em humanos. A ENG contém dois pares de cisteínas conservadas, C30-C207 e C53-C182, que formam pontes de dissulfeto em regiões órfãs. Para estudar melhor o papel do eng em pacientes com HHT, ensaios de formação de tubos com iPSCs derivados de pacientes com HHT têm sido realizados em células sem/com mutações eng (Cys30Arg, C30R)15. Depois que Kubota et al. relataram pela primeira vez o experimento de formação detubos 16,o ensaio foi desenvolvido de várias maneiras. Tem sido usado para identificar fatores angiogênicos ou antiangiogênicos, definir as vias de sinalização na angiogênese e identificar genes que regulam a angiogênese17.
Antes da disponibilidade de iPSC-CE derivados do paciente, os pesquisadores usavam eCs principalmente cultos para estudar angiogense16. No entanto, para as células endoteliais, é um desafio técnico transduir genes exógenos com um vírus, devido ao número de passagem limitado que as CEs podem sofrer. Isso porque não há material celular suficiente para ser coletado de vasos humanos, seja de cirurgia ou doadores aprovados. Com a invenção da técnica de geração iPSC por Shinya Yamanaka, os CEs humanos derivados de iPSCs podem ser usados de forma confiável em experimentos in vitro, como relatado anteriormente18.
O uso de CEs transduzidas viralmente com números e passagens limitadas pode ser suficiente para estudos de sinalização, mas para estudos funcionais, é melhor gerar linhas de células-tronco pluripotentes mutantes, (iPSCs ou hESCs alvo CRISPER/Cas9), em seguida, diferenciá-los em CEs para estudos de angiogênese que usam ensaios de formação de tubos19. A formação de tubos pode ser usada para avaliar a função das células endoteliais que carregam mutações. Este protocolo também descreve a formação de tubos em uma placa de angiogênese de μ-slide, que é um método fácil, econômico e reprodutível.
O protocolo abaixo fornece um método confiável e sistêmico para estudar o papel de genes específicos na formação vascular, juntamente com detalhes para o padrão de expressão in vivo e quantificação funcional in vitro para modelagem de doenças humanas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

O desenvolvimento vascular é determinado pela expressão sequencial de genes específicos, que podem ser estudados realizando ensaios de hibridização in situ em zebrafish durante diferentes estágios de desenvolvimento. Para investigar o papel da endoglin(eng) na formação de vasos durante o desenvolvimento da telangiectasia hemorrágica hereditária (HHT), o knockdown direcionado mediado por morfina de eng em zebrafish é usado para estudar sua expressão temporal e funções associadas. Aqui, a hibridização de RNA in situ (WISH) é empregada para a análise de eng e seus genes a jusante em embriões de zebrafish. Além disso, os ensaios de formação de tubos são realizados em células endoteliais induzidas pelo paciente HHT (iPSC-ECs; com mutações eng). Um sistema específico de amplificação de sinal usando toda a quantidade In Situ Hybridization – WISH fornece maior resolução e resultados de fundo mais baixos em comparação com os métodos tradicionais. Para obter um sinal melhor, o tempo de pós-fixação é ajustado para 30 minutos após a hibridização da sonda. Como a coloração da fluorescência não é sensível em embriões de zebrafish, ela é substituída por coloração diaminobezidina (DAB) aqui. Neste protocolo, as linhas iPSC derivadas do paciente HHT contendo uma mutação eng são diferenciadas em células endoteliais. Depois de revestir uma placa com matriz de membrana de porão por 30 min a 37 °C, os iPSC-CE são semeados como monocamadas em poços e mantidos a 37 °C por 3h. Em seguida, o comprimento do tubo e o número de ramos são calculados usando imagens microscópicas. Assim, com este protocolo WISH melhorado, mostra-se que a expressão eng reduzida afeta a formação de progenitores endoteliais em embriões de zebrafish. Isso é confirmado ainda por ensaios de formação de tubos utilizando iPSC-CEs derivados de um paciente com HHT. Esses ensaios confirmam o papel do eng no desenvolvimento vascular precoce.

A hibridização total do situ baseia-se em um princípio semelhante à transferência de energia de ressonância fluorescência. Ele foi projetado para melhorar a sensibilidade e a especificidade no ISH de zebrafish, bem como amplificar sinais específicos de alvo sem afetar o sinal de fundo.
Em embriões de zebrafish de 24 hpf, a endoglina é altamente expressa na veia cardeal posterior (PCV), vasos intersegmentais (I...

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Apresentado aqui é um protocolo para análise de hibridização de RNA in situ in situ em zebrafish e ensaio de formação de tubos em células endoteliais derivadas de células-tronco derivadas do paciente para estudar o papel da endoglina na formação vascular.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A hibridização completa, in situ, WISH, proporciona uma alta resolução e um baixo resultado de fundo em comparação com os métodos tradicionais. Além disso, as placas de u-slide melhoram o foco na mesma distância focal usando menos WISH pode ser aplicado a embriões de camundongos, embriões de Drosophila e outros tecidos difíceis de manusear. O ensaio de formação do tubo pode ser aplicado a células-tronco células andrógenas diferenciadas.O WISH facilita a compreensão do significado funcional da correção da mutação. A pessoa que vai demonstrar o procedimento é Yong Wang, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Trabalhando sob um microscópio, use o sistema FemtoJet para injetar dois nanogramas de Morpholinos e 500 picogramas de MRNA em embriões unicelulares.Pratique a microinjeção de Morpholinos muitas vezes até que você possa injetá-lo nas células com sucesso e manter a integridade dos ovos. Incubar as zigotos até que sejam descorrioadas e alcancem o estado de desenvolvimento que corresponde ao experimento pretendido. Como descrito na mesa um do manuscrito.Em seguida, use uma pipeta de plástico para transferir 20 a 40 embriões para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de solução 4%PFA recém-preparada à temperatura ambiente. Após a fixação, lavagem e desidratação dos embriões como descrito no manuscrito, coloque os embriões em uma peneira com malha de nylon na parte inferior.Hidrate os embriões lavando-os sequencialmente em 75%50% e 25% de metanol por cinco minutos cada. Depois de lavar os embriões com PBST, adicione 50 microliters de proteinase K no tubo com os embriões. Após a digestão, remova a proteína K e lave os embriões com PBST três vezes por cinco minutos cada vez.Adicione 50 a 100 microliters de sondas alvo mistas em cada tubo com os embriões. Incubar os embriões durante a noite a 40 graus Celsius. Após lavar os embriões como descrito no manuscrito, use 4% de paraformaldeído para corrigir os embriões por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, lave os embriões em solução SSCT 2x três vezes por 15 minutos cada vez em temperatura ambiente. Remova a solução SSCT e substitua-a por 50 microliters de Amp 1. Em seguida, incubar os embriões a 40 graus Celsius.Após 30 minutos, lave os embriões em solução SSCT 2x três vezes por 15 minutos cada vez em temperatura ambiente. Remova a solução SSCT e adicione 50 microliters de Amp 2. Depois de incubar por 15 minutos e lavar o embrião como feito anteriormente, adicione 50 microliters de Amp 3 e bata suavemente no tubo.Incubar os embriões a 40 graus Celsius. Após 30 minutos lave os embriões como descrito anteriormente. Em seguida, adicione 50 microliters de Amp 4 dropwise e toque cuidadosamente no tubo.Em seguida, incubar os embriões a 40 graus Celsius por 15 minutos e lavá-los três vezes com SSCT. Depois de preparar os embriões para imagens como descrito no manuscrito, use um kit de substrato de peroxidase DAB para manchar o espécime. Adicione 50 microliters cada um dos reagentes de cor A, B e C a um mililitro de água destilada.E misture bem para obter um fluido de trabalho DAB completo. Adicione o fluido ao espécime e cubra por dez minutos. Depois de lavar completamente os espécimes, use um microscópio óptico para imagens.Para começar a cultivar e controlar os iPSCs HHT, adicione matriz de membrana de porão a seis placas de cultura de células de poço para cobrir a parte inferior dos poços. Incubar as placas por uma hora a 37 graus Celsius. Em seguida, remova a solução de matriz de membrana de porão usada dos poços e adicione dois mililitros de mTeSR 1 médio em cada poço.Em seguida, emplaque os iPSCs colhidos da última passagem em aproximadamente dez vezes dez para as seis células por poço. Após cultivar os iPSCs por aproximadamente quatro dias, troque o meio de cultura celular com o meio BEL suplementado. Cresça as células por três dias para gerar células de mesoderme.Para expandir as células endoteliais vasculares, substitua o meio por meio BEL suplementado por quatro dias. E então tratar as células com o mesmo meio e cultura por mais três ou quatro dias. Purifique as células endoteliais vasculares maduras usando dynabeads CD31 de acordo com as instruções do kit.Em seguida, colete as células positivas CD31 por buffer de eluição. Manter e expandir as células endoteliais purificadas em meio EC-SFM contendo VEGF165, bFGF e FBS. Para emplacar as células endoteliais, comece adicionando 10 microlitadores de matriz de membrana por parte do poço às placas de angiogênese.Incubar as placas a 37 graus Celsius por 30 minutos. Colher as células endoteliais e resuspensá-las em crescimento endotelial médio 2 por pipetação repetidamente. Adicione 50 microliters desta suspensão celular à matriz solidificada em cada poço e, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius.Após três a cinco horas de incubação, use um microscópio de alta resolução para avaliar a formação do tubo endotelial. Capture imagens de pelo menos dez áreas para cada grupo. Inspecione o comprimento geral do tubo, o número do tubo e os pontos do galho.CISH e WISH foram realizados para determinar a expressão de endoglina em embriões pós-fertilização 24 horas. Um marcador endotelial hemogênico e um marcador progenitor endotelial foram usados para examinar o efeito do silenciamento da endóglina. As setas vermelhas indicam regiões onde a expressão desses marcadores, aplnrna e npr1a, diminuiu significativamente.O ensaio de formação do tubo endotelial foi realizado no mutante de endoglina e controlou as células endoteliais derivadas do iPSC. A formação do tubo foi avaliada e fotografada após três horas. O comprimento do tubo, o número do tubo e a ramificação foram quantificados por meio do software ImageJ.Células endoteliais mutantes formaram menos ramos do que controlar células endoteliais. E os ramos das células endoteliais mutantes aumentaram significativamente após a estimulação com fator de crescimento endotelial vascular. Este método também pode ser usado para a geração de iPS a partir de sangue periférico.E pelo método esclarece o papel da endócrina na formação vascular in vitro e in vivo. Sabendo que corrigir a mutação pode fazer a diferença na angiogênese, é possível transplantar as células de volta em pacientes para uma potencial terapia com células-tronco.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...