Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de la célula madre de China y la investigación traslacional [número de subvención 2016YFA0102300 (a Jun Yang)];la Fundación para la Ciencia de la Naturaleza de China [concesión número 81870051, 81670054 (a Jun Yang)]; el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (CIFMS) [número de subvención 2016-I2M-4-003 (a Jun Yang)]; puMC Youth Found y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales [número de subvención 2017310013 (a Fang Zhou)].

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de ética de la investigación de la escuela de medicina de la Universidad de Zhejiang.
1. Hibridación in situ de montaje completo
<ol><li>La cría y reproducción de la línea de peces zebra<ol>
<li>Alimentar y criar todo el pez cebra adulto a 26-28 oC en un sistema de acuicultura recirculante con 14 h de luz/10 h de ciclo oscuro para cada día. Utilice líneas de peces cebra AB (tipo salvaje) para los siguientes...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Este protocolo aplicó una plataforma mejorada de análisis de ARN in situ de montaje integral para ensayos de formación de peces cebra y tubos en iPSC-ECs derivados de un paciente con HHT. El método ISH tradicional requiere un ciclo experimental más largo con pasos experimentales adicionales. El protocolo tiene algunas mejoras importantes, el uso de sondas Z dobles independientes e iPSC derivados de un paciente con HHT que se aplicaron en ensayos WISH y formación de tubos, respectivamente. Estos refinamientos son cr...

Se ha notificado una sola mutación en eng (CD105) en pacientes con HHT. La mutación conduce a una mayor proliferación de las CE y a una reducción del alargamiento de las CE mediada por el flujo1,2. También se ha informado previamente que la deficiencia de ENG reduce la expresión de marcadores endoteliales (es decir, kdrl, cdh5, hey2) en el pez cebra3. La endoglina, expresada principalmente en células endoteliales, es una glicoproteína transmembrana y funciona como un co-receptor para la transformación de los miembros de la familia factor de crecimiento (TGF-). Dirige la unión BMP9 a la superficie celular para regular el gen aguas abajo, incluida la expresión Id1, para inducir la diferenciación de células madre hacia las CE4. Por lo tanto, el gen eng desempeña un papel importante en la vasculogénesis y la enfermedad vascular humana5,6. Hemos examinado previamente los efectos del derribo de endogina en la formación de buques en embriones de pez cebra, seguido de un análisis de las CE derivadas de iPSC adquiridas a un paciente con HHT que lleva una mutación7. Este protocolo demuestra los efectos de la deficiencia de ENG en la expresión del marcador de progenitor endotelial y la formación de tubos, que es un método cuantificable para medir la angiogénesis in vitro.
Para estudiar la expresión espacial y temporal, WISH se emplea para detectar la expresión génica in vivo8. La hibridación in situ (ISH) es un método de uso de sondas etiquetadas con secuencias de complemento de ácidos nucleicos diana (ADN o ARNm) para detectar y visualizar híbridos de ácido nucleico objetivo en una muestra fija. El proceso amplifica las señales de expresión génica in vivo y se utiliza para detectar la expresión de genes mediante microscopía. WISH ha sido ampliamente utilizado en varios animales modelo, especialmente en peces cebra9. También se utiliza para adquirir los siguientes datos: 1) patrones de expresión espacial/temporal del gen, que proporcionan información sobre la función y clasificación del gen; y 2) marcadores genéticos expresados específicamente que se utilizan en fármacos de alto rendimiento o cribado mutante10.
Las sondas cromogénicas se degradan fácilmente con la hibridación in situ del cromosoma tradicional (CISH), lo que da como resultado un alto ruido de fondo y señales inespecíficas11,12. El método WISH utiliza dos sondas Z dobles independientes, que están diseñadas para hibridizar a las secuencias de ARN de destino. Cada sonda contiene una secuencia de 18-25 complementaria al ARN objetivo y una secuencia de cola de 14 bases (conceptualizada como Z). Los sondeos de destino se utilizan en un par (doble Z). Las dos secuencias de cola juntas forman un sitio de hibridación de 28 bases para el preamplificador, que contiene 20 sitios de unión para el amplificador. El amplificador, a su vez, contiene 20 sitios de unión para la sonda de etiquetas y teóricamente puede producir hasta 8.000 etiquetas para cada secuencia de ARN de destino.
Esta avanzada tecnología facilita la amplificación simultánea de la señal y la supresión de fondo para lograr la visualización de una sola molécula, preservando al mismo tiempo la morfología tisular13. La modificación adicional de los métodos WISH se basa en investigaciones anteriores14,incluyendo fijación adicional y tinción DAB. Aquí se proporciona un protocolo WISH mejorado que puede funcionar incluso si el ARN objetivo se reduce o degrada parcialmente. Las ventajas incluyen que se puede completar en 24 h sin condiciones libres de RNase. Las señales también se pueden detectar simultáneamente a través de múltiples canales desde múltiples destinos, y los resultados son consistentes y compatibles con los resultados de diferentes plataformas de automatización de alto rendimiento.
Los resultados de modelos animales no son necesarios reflejan el mismo fenómeno que ocurre en los seres humanos. ENG contiene dos pares de ciisteínas conservadas, C30-C207 y C53-C182, que forman puentes de disulfuro en regiones huérfanas. Para seguir estudiando el papel del eng en pacientes con HHT, se han llevado a cabo ensayos de formación de tubos con iPSC derivados de pacientes con HHT en células sin/con mutaciones eng (Cys30Arg, C30R)15. Después de que Kubota et al. informaron por primera vez el experimento de formación detubos 16,el ensayo se ha desarrollado de varias maneras. Se ha utilizado para identificar factores angiogénicos o antiangiogénicos, definir las vías de señalización en la angiogénesis e identificar genes que regulan la angiogénesis17.
Antes de la disponibilidad de iPSC-CE derivados del paciente, los investigadores utilizaron principalmente ECs cultivados para estudiar la angiogensis16. Sin embargo, para las células endoteliales, es un desafío técnico transducir genes exógenos con un virus, debido al número limitado de pasaje al que pueden sufrir las ECs. Esto se debe a que no hay suficiente material celular para ser recogido de los vasos humanos ya sea de la cirugía o donantes aprobados a juego. Con la invención de la técnica de generación iPSC por Shinya Yamanaka, los CE humanos derivados de iPSC se pueden utilizar de forma fiable en experimentos in vitro, como se informó anteriormente18.
El uso de EC transducidos viralmente con números y pasajes limitados puede ser suficiente para los estudios de señalización, pero para los estudios funcionales, es mejor generar líneas de células madre pluripotentes mutadas , (ya sea iPSCs o hESC dirigidas a CRISPER/Cas9), luego diferenciarlas en EC para estudios de angiogénesis que utilizan ensayos de formación de tubos19. La formación de tubos se puede utilizar para evaluar la función de las células endoteliales que tienen mutaciones en los rodamientos. Este protocolo también describe la formación de tubos en una placa de angiogénesis de deslizamiento, que es un método fácil, rentable y reproducible.
El protocolo siguiente proporciona un método fiable y sistémico para estudiar el papel de genes específicos en la formación vascular, junto con detalles para el patrón de expresión in vivo y la cuantificación funcional in vitro para el modelado de enfermedades humanas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

El desarrollo vascular se determina mediante la expresión secuencial de genes específicos, que pueden ser estudiados mediante la realización de ensayos de hibridación in situ en peces cebra durante diferentes etapas de desarrollo. Para investigar el papel de la endoglina (eng) en la formación de recipientes durante el desarrollo de telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT), se utiliza el derribo dirigido a morfolino de eng en peces cebra para estudiar su expresión temporal y funciones asociadas. Aquí, la hibridación de ARN in situ de montaje completo (WISH) se emplea para el análisis de eng y sus genes aguas abajo en embriones de pez cebra. Además, los ensayos de formación de tubos se realizan en células endoteliales diferenciadas por células madre pluripotentes inducidas por el paciente de HHT (iPSC-CE; con mutaciones eng). Un sistema de amplificación de señal específico que utiliza toda la cantidad In Situ Hybridization – WISH proporciona una mayor resolución y resultados de fondo más bajos en comparación con los métodos tradicionales. Para obtener una mejor señal, el tiempo posterior a la fijación se ajusta a 30 minutos después de la hibridación de la sonda. Debido a que la tinción por fluorescencia no es sensible en los embriones de pez cebra, se sustituye por la tinción de diaminobezidina (DAB) aquí. En este protocolo, las líneas iPSC derivadas del paciente de HHT que contienen una mutación eng se diferencian en células endoteliales. Después de recubrir una placa con matriz de membrana de sótano durante 30 min a 37 oC, los iPSC-CE se siembran como monocapa en pozos y se mantienen a 37 oC durante 3 h. A continuación, la longitud del tubo y el número de ramas se calculan utilizando imágenes microscópicas. Así, con este protocolo WISH mejorado, se demuestra que la reducción de la expresión eng afecta a la formación de progenitores endoteliales en embriones de pez cebra. Esto se confirma además mediante ensayos de formación de tubos que utilizan iPSC-ECs derivados de un paciente con HHT. Estos ensayos confirman el papel del eng en el desarrollo vascular temprano.

La hibridación in situ de montaje completo se basa en un principio similar a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia. Está diseñado para mejorar tanto la sensibilidad como la especificidad en el ISH del pez cebra, así como para amplificar las señales específicas del objetivo sin afectar la señal de fondo.
En 24 embriones de pez cebra hpf, la endoglina está muy expresada en la vena cardinal p...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

La hibridación in situ de montaje completo, WISH, proporciona una alta resolución y un resultado de fondo bajo en comparación con los métodos tradicionales. Además, las placas de deslizamiento en U mejoran el enfoque en la misma distancia focal mediante el uso de menos WISH se puede aplicar a embriones de ratón, embriones Drosophila y otros tejidos difíciles de manejar. El ensayo de formación de tubos se puede aplicar a células andrógenos diferenciadas con células madre.WISH facilita la comprensión del significado funcional de la corrección de mutaciones. La persona que demostrará el procedimiento es Yong Wang, un asistente de investigación de mi laboratorio. Trabajando bajo un microscopio, utilice el sistema FemtoJet para inyectar dos nanogramos de Morpholinos y 500 picogramos de MRNA en embriones unicelulares.Practique la microinyección de Morpholinos muchas veces hasta que pueda inyectarlo en las células con éxito y mantener la integridad de los huevos. Incubar los cigotos hasta que se descorionen y alcancen el estado de desarrollo que corresponde al experimento previsto. Como se describe en la tabla uno del manuscrito.A continuación, utilice una pipeta de plástico para transferir de 20 a 40 embriones a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir un mililitro de solución 4%PFA recién preparada a temperatura ambiente. Después de fijar, lavar y deshidratar los embriones como se describe en el manuscrito, coloque los embriones en un tamiz con malla de nylon en la parte inferior.Hidratar los embriones lavándolos secuencialmente en 75%50% y 25%metanol durante cinco minutos cada uno. Después de lavar los embriones con PBST, agregue 50 microlitros de proteinasa K en el tubo con los embriones. Después de la digestión, retire la proteinasa K y lave los embriones con PBST tres veces durante cinco minutos cada vez.Agregue de 50 a 100 microlitros de sondas diana mixtas en cada tubo con los embriones. Incubar los embriones durante la noche a 40 grados centígrados. Después de lavar los embriones como se describe en el manuscrito, utilice 4%paraformaldehído para fijar los embriones durante 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, lave los embriones en 2x solución SSCT tres veces durante 15 minutos cada vez a temperatura ambiente. Retire la solución SSCT y sustitúyalo por 50 microlitros de Amp 1. Luego incuba los embriones a 40 grados centígrados.Después de 30 minutos, lave los embriones en 2x solución SSCT tres veces durante 15 minutos cada vez a temperatura ambiente. Retire la solución SSCT y añada 50 microlitros de Amp 2. Después de incubar durante 15 minutos y lavar el embrión como se hizo anteriormente, agregue 50 microlitros de Amp 3 y toque el tubo suavemente.Incubar los embriones a 40 grados centígrados. Después de 30 minutos, lave los embriones como se describió anteriormente. A continuación, agregue 50 microlitros de Amp 4 dropwise y toque cuidadosamente el tubo.Luego incuba los embriones a 40 grados Celsius durante 15 minutos y lávalos tres veces con SSCT. Después de preparar los embriones para la toma de imágenes como se describe en el manuscrito, utilice un kit de sustrato de peroxidasa DAB para manchar la muestra. Agregue 50 microlitros cada uno de los reactivos de color A, B y C a un mililitro de agua destilada.Y mezcle bien para obtener un fluido de trabajo DAB completo. Agregue el líquido a la muestra y cúbralo durante diez minutos. Después de lavar a fondo las muestras, utilice un microscopio óptico para tomar imágenes de ellas.Para comenzar a cultivar y controlar los iPSC DE HHT, agregue la matriz de membrana del sótano a seis placas de cultivo celular de pozos para cubrir la parte inferior de los pozos. Incubar las placas durante una hora a 37 grados centígrados. A continuación, retire la solución de matriz de membrana de sótano usada de los pozos, y agregue dos mililitros de mTeSR 1 medio en cada pozo.Luego platue los iPSC cosechados del último pasaje en aproximadamente una vez diez a las seis células por pozo. Después de cultivar los iPSC durante aproximadamente cuatro días, cambie el medio de cultivo celular con el medio BEL suplementado. Crecer las células durante tres días para generar células mesoderm.Para expandir las células endoteliales vasculares, reemplace el medio por un medio BEL suplementado durante cuatro días. Y luego tratar las células con el mismo medio y cultivo durante otros tres a cuatro días. Purificar las células endoteliales vasculares maduras utilizando Dinocávas CD31 de acuerdo con las instrucciones del kit.A continuación, recoja las células positivas CD31 por búfer de elución. Mantener y ampliar las células endoteliales purificadas en medio EC-SFM que contiene VEGF165, bFGF y FBS. Para placar las células endoteliales, comience agregando 10 microlitros de matriz de membrana sótano por pozo a las placas de angiogénesis.Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Cosechar las células endoteliales y resuspenderlas en medio de crecimiento endotelial 2 pipeteando repetidamente. Añadir 50 microlitros de esta suspensión celular a la matriz solidificada en cada pozo y luego incubar las células a 37 grados Celsius.Después de tres a cinco horas de incubación, utilice un microscopio de alta resolución para evaluar la formación de tubos endoteliales. Captura imágenes de al menos diez áreas para cada grupo. Inspeccione la longitud total del tubo, el número de tubo y los puntos de rama.CISH y WISH se realizaron para determinar la expresión de endoglina en embriones post-fertilización las 24 horas. Se utilizó un marcador endotelial hemogénico y un marcador de progenitor endotelial para examinar el efecto del silenciamiento de la endoglina. Las flechas rojas indican regiones donde la expresión de estos marcadores, aplnrna y npr1a, disminuyó significativamente.El ensayo de formación de tubos endoteliales se realizó en el mutante de endoglin y controló las células endoteliales derivadas de iPSC. La formación del tubo fue evaluada y fotografiada después de tres horas. La longitud del tubo, el número de tubo y la ramificación se cuantificaron utilizando el software ImageJ.Las células endoteliales mutantes formaron menos ramas que las células endoteliales de control. Y las ramas en las células endoteliales mutadas aumentaron significativamente después de la estimulación con factor de crecimiento endotelial vascular. Este método también se puede utilizar para la generación de iPS a partir de sangre periférica.Y por el método aclara el papel de endocrino en la formación vascular in vitro e in vivo. Sabiendo que corregir la mutación puede marcar una diferencia en la angiogénesis, es posible trasplantar las células de nuevo a los pacientes para una posible terapia con células madre.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualización de las células Multiciliated en el pez cebra a través de un protocolo combinado de todo Monte fluorescente In Situ hibridación e inmunofluorescencia

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Inmunohistoquímica de montaje completo en embriones y larvas de pez cebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...