Name: whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Bu çalışma, Çin kök hücre ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı hibe tarafından desteklendi [hibe numarası 2016YFA0102300 (Jun Yang için)];Çin Doğa Bilimleri Vakfı [hibe numarası 81870051, 81670054 (Jun Yang için)]; CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (CIFMS) [hibe numarası 2016-I2M-4-003 (Jun Yang için)]; PUMC Youth Found ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları [hibe numarası 2017310013 (Fang Zhou için)].

Açıklanan tüm hayvan deneyleri Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yerinde hibridizasyonda tam montaj
<ol><li>Zebra balığı soy ve üreme<ol>
<li>Her gün için 14 saat ışık/10 saat karanlık döngüsü ile yeniden dolaşan bir kültür balıkçılığı sisteminde tüm yetişkin zebra balıklarını 26-28 °C'de besleyin ve yetiştirin. Aşağıdaki yordamlar için AB (vahşi tip) zebra balığı hatlarını kullanın.</l...

<ol>
	<li>Jin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+prevents+vascular+malformation+by+regulating+flow-induced+cell+migration+and+specification+through+VEGFR2+signalling.">Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).</li><li>Sugden, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+controls+blood+vessel+diameter+through+endothelial+cell+shape+changes+in+response+to+haemodynamic+cues.">Endoglin controls blood vessel diameter through endothelial cell shape changes in response to haemodynamic cues.</a> Nature Cell Biology. 19 (6), 653-665 (2017).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoglin+is+a+conserved+regulator+of+vasculogenesis+in+zebrafish+-+implications+for+hereditary+haemorrhagic+telangiectasia.">Endoglin is a conserved regulator of vasculogenesis in zebrafish - implications for hereditary haemorrhagic telangiectasia.</a> Bioscience Reports. 39 (5), (2019).</li><li>Lawera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+soluble+endoglin+in+BMP9+signaling.">Role of soluble endoglin in BMP9 signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (36), 17800-17808 (2019).</li><li>Gallardo-Vara, E., Tual-Chalot, S., Botella, L. M., Arthur, H. M., Bernabeu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+endoglin+regulates+expression+of+angiogenesis-related+proteins+and+induction+of+arteriovenous+malformations+in+a+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Soluble endoglin regulates expression of angiogenesis-related proteins and induction of arteriovenous malformations in a mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 11 (9), (2019).</li><li>Gomez-Puerto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+contributes+to+BMP+type+2+receptor+degradation+and+development+of+pulmonary+arterial+hypertension.">Autophagy contributes to BMP type 2 receptor degradation and development of pulmonary arterial hypertension.</a> The Journal of Pathology. 249 (3), 356-367 (2019).</li><li>Kim, S. K., Henen, M. A., Hinck, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+betaglycan+and+endoglin,+membrane-bound+co-receptors+of+the+TGF-beta+family.">Structural biology of betaglycan and endoglin, membrane-bound co-receptors of the TGF-beta family.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (17), 1547-1558 (2019).</li><li>Dakou, E., Vanbekbergen, N., Corradi, S., Kemp, C. R., Leyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+In+Situ+Hybridization+(WISH)+Optimized+for+Gene+Expression+Analysis+in+Mouse+Embryos+and+Embryoid+Bodies.">Whole-Mount In Situ Hybridization (WISH) Optimized for Gene Expression Analysis in Mouse Embryos and Embryoid Bodies.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 27-40 (2014).</li><li>Xiao, C., Gao, L., Hou, Y., Xu, C., Xiong, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-remodelling+factor+Brg1+regulates+myocardial+proliferation+and+regeneration+in+zebrafish.">Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 7, 13787 (2016).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Rosa, F. E., Santos, R. M., Rogatto, S. R., Domingues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromogenic+in+situ+hybridization+compared+with+other+approaches+to+evaluate+HER2/neu+status+in+breast+carcinomas.">Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas.</a> Brazilian Journal of Medical Biology Research. 46 (3), 207-216 (2013).</li><li>Hauptmann, G., Lauter, G., Soll, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+signal+amplification+in+zebrafish+RNA+FISH.">Detection and signal amplification in zebrafish RNA FISH.</a> Methods. 98, 50-59 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12 (1), 55 (2014).</li><li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXPRESS:+Autologous+correction+in+patient+iPSC-ECs+to+identify+a+novel+pathogenic+mutation+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">EXPRESS: Autologous correction in patient iPSC-ECs to identify a novel pathogenic mutation of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Pulmonary Circulation. , (2019).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li><li>Clayton, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+promote+angiogenesis+and+accelerate+wound+closure+in+a+murine+excisional+wound+healing+model.">Induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells promote angiogenesis and accelerate wound closure in a murine excisional wound healing model.</a> Bioscience Reports. 38 (4), (2018).</li><li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cells+Derived+From+Human+iPSCS+Increase+Capillary+Density+and+Improve+Perfusion+in+a+Mouse+Model+of+Peripheral+Arterial+Disease.">Endothelial Cells Derived From Human iPSCS Increase Capillary Density and Improve Perfusion in a Mouse Model of Peripheral Arterial Disease.</a> Arteriosclerosis Thrombosis &amp; Vascular Biology. 31 (11), e72-e79 (2011).</li><li>Musunuru, K., Sheikh, F., Gupta, R. M., Houser, S. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cardiovascular+Disease+Modeling+and+Precision+Medicine:+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association.">Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Clinical Genomics and Precision Medicine. 11 (1), e000043 (2018).</li><li>Wang, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apelin+attenuates+TGF-&#946;1-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition+via+activation+of+PKC-&#949;+in+human+renal+tubular+epithelial+cells.">Apelin attenuates TGF-&#946;1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-&#949; in human renal tubular epithelial cells.</a> Peptides. 96, 44-52 (2017).</li><li>El Hallani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Endothelial+Cell+Hybrids+Participate+in+Glioblastoma+Vasculature.">Tumor and Endothelial Cell Hybrids Participate in Glioblastoma Vasculature.</a> Biomed Research International. , 1-9 (2014).</li><li>Anderson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+RNAscope+In+Situ+Hybridization+Assays+for+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Cells+and+Tissues.">Fully Automated RNAscope In Situ Hybridization Assays for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Cells and Tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2201-2208 (2016).</li><li>Sun, X., Tan, G., Liew, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+challenges+for+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+in+cardiovascular+medicine.">Future challenges for patient-specific induced pluripotent stem cells in cardiovascular medicine.</a> Expert Review of Cardiovascular Therapy. 10 (8), 943-945 (2012).</li></ol>

Bu protokol, bir HHT hastasından elde edilen iPSC-EC'lerde zebra balığı ve tüp oluşumu tahlilleri için geliştirilmiş bir yerinde RNA analiz platformu uygulamıştır. Geleneksel ISH yöntemi ekstra deneysel adımlar ile daha uzun bir deneysel döngü gerektirir. Protokolde, sırasıyla WISH tahlillerinde ve tüp oluşumunda uygulanan HHT'li bir hastadan elde edilen bağımsız çift Z probları ve iPSC'lerin kullanımı gibi önemli iyileştirmeler vardır. Bu iyileştirmeler, geleneksel ISH ile gözlenenlerle k...

HHT'li hastalarda eng (CD105) üzerinde tek bir mutasyon bildirilmiştir. Mutasyon artmış EC proliferasyonu ve azaltılmış akış aracılı EC uzaması yol açar1,2. Ayrıca daha önce ENG eksikliği zebrabalığı3endotel belirteçleri ekspresyonu (yani, kdrl, cdh5, hey2) azaltır bildirilmiştir . Endoglin,özellikle endotel hücrelerinde ifade, bir transmembran glikoprotein ve büyüme faktörü β dönüştürmek için bir ko-reseptör olarak işlevleri (TGF-β) aile üyeleri. Döl1 ekspresyonu da dahil olmak üzere, kök hücre farklılaşmasını sağlamak için hücre yüzeyine BMP9 bağlanmasını yönlendirir4. Bu nedenle eng geni vaskülogenez ve insan damar hastalıklarında önemli rol oynar5,6. Daha önce zebra balığı embriyolarında damar oluşumu üzerinde endoglin knockdown etkilerini inceledik, bir eng mutasyonutaşıyan bir HHT hastadan edinilen iPSCs türetilmiş ECs analizi izledi 7 . Bu protokol, ENG eksikliğinin in vitro anjiyogenezi ölçmek için ölçülebilir bir yöntem olan endotel atası belirteç ekspresyonu ve tüp oluşumu üzerine etkilerini göstermektedir.
Eng mekansal ve zamansal ekspresyonu incelemek için WISH in vivo8'degen ekspresyonunu saptamak için kullanılır. In situ hibridizasyon (ISH), hedef nükleik asit melezlerini sabit bir numunede tespit etmek ve görselleştirmek için hedef nükleik asit (DNA veya mRNA) dizilerini tamamlayan etiketli probların kullanılması yöntemidir. Bu süreç in vivo gen ekspresyonu sinyallerini güçlendirir ve genlerin mikroskopi ile ekspresyonunu saptamak için kullanılır. WISH yaygın olarak çeşitli model hayvanlarda, özellikle zebra balığı9kullanılmıştır. Ayrıca aşağıdaki verileri elde etmek için kullanılır: 1) gen fonksiyonu ve sınıflandırma hakkında bilgi sağlayan gen mekansal/zamansal ifade desenleri; ve 2) özellikle yüksek iş yapımı ilaç veya mutant tarama10kullanılan gen belirteçleri ifade .
Kromojenik problar, yüksek arka plan gürültüsü ve nonspesifik sinyallerle sonuçlanan situ hibridizasyonda (CISH) geleneksel kromozom ile kolayca bozulur11,12. WISH yöntemi, RNA dizilerini hedeflemek için hibridize etmek üzere tasarlanmış iki bağımsız çift Z probkullanır. Her sonda hedef RNA tamamlayıcı bir 18-25 dizisi ve 14 baz kuyruk dizisi (Z olarak kavramsallaştırılmış) içerir. Hedef problar bir çift (çift Z) kullanılır. İki kuyruk dizisi, amplifikatör için 20 bağlama alanı içeren preamplifikatör için 28 baz hibridizasyon alanı oluşturur. Amplifikatör, sırayla, etiket sondası için 20 bağlama sitesi içerir ve teorik olarak her hedef RNA dizisi için 8.000'e kadar etiket verebilir.
Bu ileri teknoloji doku morfolojisi korurken tek moleküllü görselleştirme elde etmek için eşzamanlı sinyal amplifikasyon ve arka plan bastırma kolaylaştırır13. WISH yöntemlerinin daha fazla değişiklik önceki araştırma dayanmaktadır14, ekstra fiksasyon ve DAB boyama dahil. Burada sağlanan hedef RNA kısmen azalmış veya bozulmuş olsa bile çalışabilirsiniz geliştirilmiş bir WISH protokolüdür. Avantajları rnase içermeyen koşullar olmadan 24 saat içinde tamamlanabilir içerir. Sinyaller aynı anda birden fazla hedeften birden fazla kanal üzerinden algılanabilir ve sonuçlar tutarlı dır ve farklı yüksek iş hacmi otomasyon platformlarından elde edilen sonuçlarla uyumludur.
Hayvan modellerinden elde edilen sonuçlar, insanlarda meydana gelen aynı fenomeni yansıtmaya gerek yoktur. ENG, yetim bölgelerde disülfür köprüleri oluşturan c30-C207 ve C53-C182 olmak üzere iki çift korunmuş sistein içerir. HHT hastalarında eng'in rolünü daha fazla incelemek için, HHT hastalarından elde edilen iPSC'li tüp oluşumu tahlilleri eng mutasyonu olmayan hücrelerde gerçekleştirilmiştir (Cys30Arg, C30R)15. Kubota ve ark. ilk tüp oluşumu deney16rapor sonra, töz çeşitli şekillerde geliştirilmiştir. Anjiyojenik veya antianjiogenik faktörleri tanımlamak, anjiyogenezde sinyal yollarını tanımlamak ve anjiyogenezi düzenleyen genleri tanımlamak için kullanılmıştır17.
Önce hasta kaynaklı iPSC-ECs durumu, araştırmacılar anjiyojensis16çalışma için öncelikle kültürlü ECs kullanılır. Ancak, endotel hücreleri için, bir virüs ile eksojen genler transduce için teknik bir meydan okumadır, ECs geçirebilir sınırlı geçiş numarası nedeniyle. Bunun nedeni, insan damarlarından ameliyat veya eşleşen onaylı donörlerden toplanacak kadar hücresel malzeme nin olmamasıdır. Shinya Yamanaka tarafından iPSC üretim tekniğinin icadı ile, insan ECs iPSCs türetilen in vitro deneylerde güvenilir bir şekilde kullanılabilir, daha önce bildirildiği gibi18.
Sınırlı sayıda ve pasajlar ile viral transekçleri kullanarak sinyal çalışmaları için yeterli olabilir, ama fonksiyonel çalışmalar için, mutant pluripotent kök hücre hatları oluşturmak için daha iyidir, (ya iPSCs veya CRISPER / Cas9 hedefli hESCs), sonra tüp oluşumu tahlilleri kullanmak anjiyogenez çalışmaları için ECs içine ayırt19. Tüp oluşumu mutasyonları taşıyan endotel hücrelerinin işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda kolay, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir yöntem olan bir μ-slide anjiyogenez plakası üzerinde tüp oluşumunu açıklar.
Aşağıdaki protokol, vasküler formasyonda spesifik genlerin rolünün araştırılması için güvenilir ve sistemik bir yöntem, in vivo ekspresyon deseni ve insan hastalığının modellenmesi için in vitro fonksiyonel nicelleştirme ayrıntıları ile birlikte sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81506</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 1-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320852</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 2-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320853</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 3-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320854</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amp 4 Alt B-FL</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 320856</td>
			<td>Signal Amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Growth factor-reduced Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>RNAase-free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Endothelial-SFM</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11111044</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td>Fixed Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease K</td>
			<td>ACD</td>
			<td>SDS 322337</td>
			<td>Digest tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>6132-04-3</td>
			<td>SSCT solution: Wash Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-165</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>78073</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount in situ hybridization in zebrafish embryos and tube formation assay in ipsc-ecs to study the role of endoglin in vascular development

Vasküler gelişim, zebra balıklarında farklı gelişim evrelerinde yerinde hibridizasyon tahlilleri ile çalışılabilen spesifik genlerin sıralı ekspresyonu ile belirlenir. Kalıtsal hemorajik telanjiektazi (HHT) gelişimi sırasında damar oluşumunda endoglin(eng) rolünü araştırmak için, zebra balığında eng'in morfolino aracılı hedefli nakavtı, temporal ekspresyonunu ve ilişkili işlevleri incelemek için kullanılır. Burada, tüm-montaj in situ RNA hibridizasyon (WISH) zebrabalığı embriyolarında eng ve downstream genlerinin analizi için istihdam edilmektedir. Ayrıca HHT hasta kaynaklı indüklenen pluripotent kök hücre-diferansiye edici endotel hücrelerinde (iPSC-ECs; eng mutasyonları ile) tüp oluşumu tahlilleri yapılmaktadır. Situ Hybridization tüm miktarı kullanarak belirli bir sinyal yükseltici sistemi – WISH geleneksel yöntemlere göre daha yüksek çözünürlük ve daha düşük arka plan sonuçları sağlar. Daha iyi bir sinyal elde etmek için, fiksasyon sonrası zaman prob hibridizasyon sonra 30 dk ayarlanır. Floresan boyama zebra balığı embriyolarında hassas olmadığından, burada diaminobezidin (DAB) boyama ile değiştirilir. Bu protokolde eng mutasyonu içeren HHT hasta kaynaklı iPSC çizgileri endotel hücrelerine ayrılır. Bir tabla37 °C'de 30 dk bodrum membran matrisi ile kaplandıktan sonra, iPSC-EC'ler tek kat olarak kuyulara seriolarak ekilir ve 37 °C'de 3 saat bekletilir. Daha sonra, tüp uzunluğu ve dalları sayısı mikroskobik görüntüler kullanılarak hesaplanır. Böylece, bu geliştirilmiş WISH protokolü ile, azaltılmış eng ekspresyonu zebrabalığı embriyolarında endotel döl oluşumunu etkilediği gösterilmiştir. Bu daha fazla HHT olan bir hastadan elde edilen iPSC-ECs kullanılarak tüp oluşumu tahlilleri ile doğrulanır. Bu tahliller erken vasküler gelişimde eng için rol onaylamak.

Yerinde hibridizasyon tüm montaj floresan rezonans enerji transferi benzer bir ilke dayanmaktadır. Zebrabalığı ISH'in hem hassasiyetini hem de özgüllüğünü artırmak ve arka plan sinyalini etkilemeden hedefe özel sinyalleri yükseltmek için tasarlanmıştır.
24 hpf zebra balığı embriyolarında, endoglin yüksek posterior kardinal ven ifade edilir (PCV), intersegmental damarlar (ISV), ve kan adaları<sup ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development at JoVE.com

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Burada sunulan zebra balığı ve tüp oluşumu tahlil de hasta kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı endotel hücrelerinde tam montaj in situ RNA hibridizasyon analizi için bir protokol vasküler oluşumunda endoglin rolünü incelemektir.

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Tüm montaj, yerinde hibridizasyon, WISH, geleneksel yöntemlere göre yüksek çözünürlük ve düşük arka plan sonucu sağlar. Ayrıca, U-slayt plakaları fare embriyoları, Drosophila embriyolar ve diğer doku işlemek zor uygulanabilir daha az WISH kullanarak aynı odak uzaklığı odak geliştirmek. Tüp oluşumu tsay kök hücre farklılaştırılmış androjen hücrelerine uygulanabilir.WISH mutasyon düzeltmesinin işlevsel anlamını anlamanızı kolaylaştırır. Prosedürü gösterecek kişi Yong Wang, laboratuvarımdan araştırma görevlisi. Mikroskop altında çalışarak, femtojet sistemini kullanarak tek hücreli embriyolara iki nanogram Morpholino ve 500 pikogram MRNA enjekte edin.Morpholinos mikroenjeksiyonu başarıyla hücrelere enjekte ve yumurta bütünlüğünü korumak kadar birçok kez uygulama. Zigotları dechorionated kadar kuluçka ya da amaçlanan deneye karşılık gelen gelişme durumuna ulaşın. El yazmasının birinci tablosunda açıklandığı gibi.Daha sonra, 1,5 mililitrelik bir tüp 20 ila 40 embriyo aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Oda sıcaklığında bir mililitre taze hazırlanmış %4 PFA çözeltisi ekleyin. Embriyoları tamir ettikten, yıkadıktan ve susuz kattıktan sonra embriyoları alt kısmında naylon örgü bulunan bir elek yerleştirin.Embriyoları sırayla %75 50 ve %25 metanol ile beşer dakika yıkayarak nemlendirin. Embriyoları PBST ile yıkadıktan sonra, embriyolarla birlikte tüpe 50 mikrolitre proteinaz K ekleyin. Sindirimden sonra, proteinaz K çıkarın ve beş dakika her zaman üç kez PBST ile embriyoları yıkayın.Embriyolar ile her tüp içine karışık hedef probları 50 ila 100 mikrolitre ekleyin. Embriyoları bir gecede 40 derecede kuluçkaya yatırın. El yazmasında açıklandığı gibi embriyoları yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca embriyoları onarmak için %4 paraformaldehit kullanın.Daha sonra embriyoları oda sıcaklığında her seferinde 15 dakika boyunca üç kez 2x SSCT çözeltisinde yıkayın. SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 mikrolitre Amp 1 ile değiştirin. Sonra embriyoları 40 derecede kuluçkaya yatırın.30 dakika sonra, 2x SSCT çözeltisi içinde her seferinde 15 dakika oda sıcaklığında embriyoları üç kez yıkayın. SSCT çözeltisini çıkarın ve 50 mikrolitre Amp 2 ekleyin. 15 dakika kuluçkave daha önce olduğu gibi embriyo yıkama sonra, Amp 3 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça tüp dokunun.Embriyoları 40 derecede kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra daha önce açıklandığı gibi embriyoları yıkayın. Sonra Amp 4 dropwise 50 mikrolitre ekleyin ve dikkatle tüp dokunun.Daha sonra embriyoları 40 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın ve SSCT ile üç kez yıkayın. Embriyoları el yazmasında açıklandığı gibi görüntüleme için hazırladıktan sonra, numuneyi lekelemek için bir DAB peroksidaz substrat kiti kullanın. Bir mililitre distile suya A, B ve C renk reaktiflerinin her birini 50 mikrolitre ekleyin.Ve tam bir DAB çalışma sıvısı elde etmek için iyice karıştırın. Sıvıyı numuneye ekleyin ve 10 dakika boyunca kapatın. Numuneleri iyice yıkadıktan sonra, onları görüntülemek için optik mikroskop kullanın.HHT iPSCs kültür ve kontrol başlamak için, kuyuların alt kapsayacak şekilde altı iyi hücre kültürü plakaları için bodrum membran matris ekleyin. Plakaları 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, kullanılan bodrum membran matris çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her kuyuya iki mililitre mTeSR 1 orta ekleyin.Daha sonra son geçitten alınan iPSC'leri yaklaşık 10'un katına, her kuyudaki altı hücreye kadar kesin. IPSC'leri yaklaşık dört gün boyunca biriktmeden sonra, hücre kültür ortamını tamamlayıcı BEL ortamıile değiştirin. Mezoderm hücreleri oluşturmak için üç gün boyunca hücreleri büyütün.Vasküler endotel hücrelerini genişletmek için, dört gün boyunca takviye BEL orta ile orta değiştirin. Ve sonra aynı ortam ve kültür ile üç ila dört gün boyunca hücreleri tedavi. Kit talimatlarına göre CD31 Dynabeads kullanarak olgun vasküler endotel hücreleri arındırın.Sonra elüsyon arabelleği tarafından CD31 pozitif hücreleri toplamak. VEGF165, bFGF ve FBS içeren EC-SFM ortamdasaflaştırılmış endotel hücrelerini koruyun ve genişletin. Endotel hücrelerini kaplamak için, anjiyogenez plakalarına her kuyuda 10 mikrolitre bazal membran matris ekleyerek başlayın.Plakaları 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Endotel hücrelerini hasat edin ve tekrar tekrar borulandırarak endotel büyüme ortamı 2'de yeniden askıya alın. Her kuyudaki katılaşmış matrise bu hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini ekleyin ve sonra hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçka 3-5 saat sonra, endotel tüpü oluşumunu değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü bir mikroskop kullanın. Her grup için en az on alanın görüntülerini yakalayın. Genel tüp uzunluğunu, tüp numarasını ve dal noktalarını inceleyin.CISH ve WISH 24 saat post-fertilizasyon embriyolarında endolin ekspresyonunu belirlemek için yapıldı. Endojen susturmanın etkisini incelemek için hemojenik endotel belirteci ve endotel atası belirteci kullanıldı. Kırmızı oklar, bu belirteçlerin, aplnrna ve npr1a'nın ifadesinin önemli ölçüde azaldığı bölgeleri gösterir.Endotel tüpü oluşum satomu endoglin mutant ve kontrol iPSC kaynaklı endotel hücrelerinde yapıldı. Tüp oluşumu değerlendirildi ve üç saat sonra fotoğraflandı. Tüp uzunluğu, tüp numarası ve dallanma ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.Mutant endotel hücreleri kontrol endotel hücrelerinden daha az dal oluşturmuştur. Ve mutant endotel hücrelerinde dalları önemli ölçüde vasküler endotelyal büyüme faktörü ile stimülasyon sonra arttı. Bu yöntem aynı zamanda periferik kandan iPS üretimi için de kullanılabilir.Ve yöntem le in vitro ve in vivo vasküler oluşumunda endokrin rolünü açıklar. Mutasyonun düzeltilmesinin anjiyogenezde bir fark yaratabileceğini bilerek, potansiyel kök hücre tedavisi için hücreleri hastalara geri nakletmek mümkündür.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...