Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
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这项工作得到了国家自然科学基金（31971062、31900326、31601022）、江苏省自然科学基金（BK20190043、BK20180838）、药物生物技术国家重点实验室研究基金、江苏省自然科学基金、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、中国科学院、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、江苏省自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金委员会、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学、科技攻关、科技攻关计划、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金、国家自然科学基金南京大学（KF-GN-202004）。中国江苏省高等院校自然科学基金（19KJB320003）、苏州市民生与技术计划（SYS2019030）和江苏省高校毕业生研究创新计划（KYCX19-1981）.这项工作也得到了苏中大学的唐学者的支持。

该协议得到了苏科大学剑桥-苏达基因组资源中心（CAM-SU）动物护理和使用委员会的批准。
1. 肠道器官分离与培养
<ol><li>肠道墓穴和肠癌培养的分离<ol>
<li>用CO2吸入8周大的野生型小鼠安乐死。使用组织钳和细虹膜剪刀解剖出约8厘米的回肠。</li>
		<li>使用带有加韦奇喂养针的注射器冲洗出来，用约 40 mL 的冰冷 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），然后用剪刀纵向切割并...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

该协议详细说明了在体外培养肠子的必要步骤，并通过流式细胞测定对肠细胞中的EdU和PI阳性细胞进行定量。这种策略有几个优点。首先，EdU标签用于检测肠细胞中的增殖细胞。与传统的BrdU测定法相比，EdU标签方法更快、更灵敏、更准确。EdU与胸腺素（T）非常相似，在细胞分裂期间，在DNA合成中取代胸腺素。与BrdU抗体相比，EdU更容易扩散到细胞中，EdU的检测不需要DNA变性和抗原抗体反应。其次?...

肠道上皮细胞的一个基本功能是保护光细胞的进入，如致病菌和毒素1，2。为了发挥这种功能，肠道干细胞不断增殖和分化成各种上皮细胞，包括肠细胞和分泌细胞，它们通过形成紧密的连接形成屏障3。肠道上皮细胞的快速更新需要严格协调细胞增殖、细胞分化和细胞死亡4、5。细胞增殖减少或细胞过度死亡会导致上皮损伤和屏障功能受损1，6。肠道屏障功能障碍与炎症性肠病7、8有关。
以前已经开发出一种培养肠道墓穴的方法。使用这种技术，分离的小鼠密码生长成肠道器官（肠状体），具有像结构一样的隐液，并包含所有肠道上皮细胞系9，10。5-Ethynyl-2'-脱氧尿碱（EdU）是一种胸腺素模拟物，能够取代在细胞增殖过程中正在复制的DNA中的胸腺素（T）。增殖细胞可以通过EdU染色快速准确地标记。碘化钠（PI）是溴化铀的模拟，在插入双链DNA后释放红色荧光。PI 专门检测死细胞，因为它只通过受损的细胞膜。
在这个协议中，我们首先描述如何从鼠小肠中分离出墓穴，然后在体外将它们培养成肠状体。然后，我们描述了如何通过EdU和PI结合和流动细胞学分析肠细胞中的增殖细胞和死细胞。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

肠道上皮作为屏障，阻止光质成分，如致病微生物群和毒素，进入身体的其余部分。上皮屏障功能需要肠道上皮细胞的完整性。上皮细胞增殖维持一个连续的细胞层，形成屏障，上皮损伤导致屏障功能障碍。因此，发光物可以通过不受限制的路径穿过肠道屏障。肠道屏障功能障碍与许多肠道疾病有关，如炎症性肠病。分离的小鼠肠道墓穴可以培养和维持为隐晦状结构，称为肠道器官或"肠状物"。肠类是研究肠道上皮细胞在体外增殖和细胞死亡的理想选择。在这个协议中，我们描述了一种简单的方法来量化培养的肠细胞中的增殖细胞和死细胞的数量。5-ethynyl-2'-脱氧尿碱（EdU）和碘化钠用于标记肠子中的增殖和死细胞，然后通过流动细胞学分析增殖和死细胞的比例。这是一个有用的工具，以测试药物治疗对肠道上皮细胞增殖和细胞生存的影响。

小肠墓穴在基底膜基质中分离和培养为肠状物。隔离后2天，肠小病开始形成芽。在第6天，肠子有许多芽，在流明中有很多碎片（死细胞）。在这个阶段，肠子已经准备好通过（图3）。
许多研究表明，炎症细胞因子对于维持肠道上皮平衡至关重要。炎症细胞因子的异常表达与炎症性肠病的发生密切相关11。例如，我们以前的研究表明，...

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Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

提出的协议使用流细胞测定来量化培养小鼠肠细胞中的增殖和死细胞数量。该方法有助于评价药物治疗对器官增殖和存活的影响。

肠内增殖细胞和死细胞的定量

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

除了研究细胞增殖和肠体存活率外，此协议还可用于培养中的肠体分离。科学家可以应用这项技术进行培养性肠体，并研究药物和炎症细胞因子对体外肠道上皮细胞的影响。这项技术的影响延伸到炎症性肠病的水疗法。我们应用这种方法来寻找一些治疗性细胞因子。这种方法提供了对肠道上皮增殖和生存的见解;此外，它也可用于器官，在肠道以外的组织周围培养。为了分离肠道墓穴并进行肠道培养，请使用组织钳子，并找到虹膜剪刀，从安乐死八周大的野生型小鼠中解剖出大约八厘米的虹膜。使用带加瓦奇喂养针的注射器，用约40毫升的冰冷Dulbecco磷酸盐缓冲盐水冲洗水，然后用剪刀剪长，然后打开盐水。将 ileum 切成小块，在 15 毫升锥形管中将它们放入 5 毫升无菌冰冷 DPBS 中。然后在冰上摇动样品五分钟。使用移液器控制器吸气 DPBS 并将其替换为 10 毫升的冷缓冲器。在冰上摇动30分钟后，使用移液器控制器吸气缓冲器一，代之以10毫升的冷缓冲器二。然后用手握手两到三分钟，每分钟大约 80 次摇动。摇动后，在显微镜下检查20微升缓冲液的缓冲液，以确保有颗粒的Panth细胞的墓穴。使用 70 微米无菌细胞滤株过滤缓冲两个内容物，并在 50 毫升锥形管中收集过滤缓冲液。将 20 微升滤液移到幻灯片上，以计算墓穴。传输足够体积的过滤缓冲器两个内容，以确保有大约500个墓穴每井。在 4 摄氏度下以 150 倍 G 旋转 10 分钟，然后小心吸进上一液。每 500 个墓穴将 50 微升的地下室膜基质重新暂停。上下移位小心，避免气泡。将 50 微升的基底膜基质液滴和墓穴混合在 24 孔板的一个孔的中心。在37摄氏度下孵育30分钟，以聚合地下室膜基质。聚合30分钟后，仔细向每井添加600微升微升微糖介质。将板返回37摄氏度的培养箱，每天在显微镜下观察，每两到三天更换一次介质。要通过肠子，请将组织培养板放在冰上，吸气介质，并在每个井中加入一毫升冷DBS。使用 P1000 尖端上下移液器，直到没有矩阵区块保留。通过一毫升胰岛素注射器将样品向上传递，并放入15毫升的圆锥管中。在 150 倍 G 和 4 摄氏度下旋转 5 分钟后，使用移液器取出 DPBS。每孔50微升基膜基质中重新悬浮内层。将板放在37摄氏度的培养箱中30分钟，使地下室膜基质聚合。然后，将每一个井与 600 微升的 ENR 介质覆盖，然后将板返回孵化器。使用一到二的分裂比将肠子生长五到七天，然后将它们传递到新的24井板中。在每个井中加入600微升ENR介质，然后在37摄氏度的培养箱中孵育4至5天。建立未经治疗的肠子对照组和每毫升白细胞-22用5毫微克治疗的肠状细胞的实验组。准备每个组至少三个副本。将 600 微升 EdU 介质添加到每个输入的井中，但一个井用作背景减法的负控。在37摄氏度的培养箱中孵育板两小时。要从地下室膜基质中采集肠子，请使用移液器控制器吸气 EdU 介质并使用 DPBS 洗涤一次。然后，添加一毫升的 DPBS。使用 P1000 移液器尖端上下移液器，直到没有固体地下室膜基块仍然存在。将样品转移到15毫升管中，在G下旋转300次5分钟，然后丢弃上一液。加入500微升细胞分离酶，在37摄氏度下孵育15分钟。然后使用 P200 移液器尖端上下移液器，将肠状体分解成单个细胞。接下来，加入三毫升的Dulbecco的修改鹰介质含有10%的胎儿牛血清，并反复移液器与P1000移液器尖端。在300次G离心5分钟后，吸升液，我们悬浮在DPBS的一毫升细胞。要对细胞进行固定和渗透，首先将细胞悬浮液转移到一点五毫升管中，在300次G下旋转5分钟，然后丢弃上经剂。我们悬浮在4%甲醛的一毫升细胞，并在室温下固定15分钟。在 300 次 G 下离心 5 分钟后，用移液器尖端吸出上经剂。用 DPBS 清洗细胞一次，然后再次向下旋转以去除上一液。用1毫升0.5%非离子表面活性剂重新暂停细胞，并在室温下孵育10分钟，然后像以前一样用DPBS清洗细胞。要检测EdU，在每根1.5毫升的管中加入100微升的反应鸡尾酒。重新暂停细胞，并保护它们免受光，在室温下孵育30分钟。在300次G下离心5分钟后，用移液器尖端轻轻吸气反应溶液，将0.5%的非离子表面活性剂进入每个管子，在室温下清洗一次。离心后，和以前一样，我们暂停在一毫升的DPBS细胞。用40微米滤株过滤再增的细胞，并在15毫升的圆锥管中收集过滤的细胞。尽快对机器检测执行事实。选择适当的通道和电压进行流量细胞仪分析。对于浇注策略，绘制 FSC-A 与 SSC-A 伪色图，通过调整电压将大部分单元分布到点贴图的可见范围。选择单元格总体为 R1 并排除左下角的单元格碎片。从 R1 单元格总体，建立 FSC-A 与 FSC-H 伪色图。设置栅极以选择指定为 R2 的单单元并排除细胞团。从R2细胞总体，建立荧光强度与细胞数图，并使用负控设置门。荧光信号区域为正细胞区域，指定R3.比较实验组与对照组之间这些EdU阳性细胞的比例。小肠道墓穴被分离，并在地下室膜基质中作为肠状体进行培养。肠黄体在隔离两天后开始形成芽。在第六天，肠子有许多芽，流明中有很多碎片。进入者准备在这个阶段通过。肠子用IL-22治疗3天，之后合成DNA被标记为红色EdU，以指示细胞增殖。IL-22治疗的肠状细胞显示EdU阳性细胞的数量增加。IL-22通过流式细胞分析，增殖细胞从40.1%增加到83.5%。IL-22治疗也增加了由红色碘化染色表明的肠状细胞死亡。IL-22通过流式细胞测定分析，死细胞从4.9%增加到16.2%。在加密分离过程中，需要添加缓冲区后进行公平晃动，以确保有足够的加密器被摇动下来。我们建议在显微镜下检查内容物。遵循这个程序，我们还可以量化分化的上皮分型和肠体使用特定的这种方法将帮助研究人员研究肠道上皮分化的肠状体。这个问题在开发之后，为胃肠病学领域的研究人员探索切中发育或病理问题铺平了道路。

Research

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