Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 en 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University (KF-GN-202004). De Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030), en The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Dit werk wordt ook ondersteund door Tang Scholar van Soochow University.

Dit protocol werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) van soochow University.
1. Intestinale isolatie en cultuur
<ol><li>Isolatie van darmcrypten en enteroïdecultuur<ol>
<li>Euthanaser een 8 weken oude wild-type muis met CO 2-inademing. Gebruik weefseltangen en fijne irisschaar om ongeveer 8 cm ileum uit te ontleden.</li>
		<li>Spoel uit met behulp van een spuit met gavage voeding naald met ongeveer 40 mL van ijsk...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor de cultuur van enteroïden in vitro en kwantificering van EdU- en PI-positieve cellen in de enteroïden door stroomcytometrie. Er zijn verschillende voordelen van deze strategie. Ten eerste wordt EdU-etikettering gebruikt om woekercellen in enteroïden te detecteren. In vergelijking met traditionele BrdU-test is de EdU-etiketteringsmethode sneller, gevoeliger en nauwkeuriger. EdU is zeer vergelijkbaar met thymine (T), die thymine vervangt in DNA-synthese tijdens de c...

Een fundamentele functie van darmepitheelcellen is het beschermen van de intrede van luminale inhoud zoals pathogene bacteriën en toxines1,2. Om een dergelijke functie uit te voeren, vermenigvuldigen darmstamcellen zich voortdurend en onderscheiden ze zich in een verscheidenheid van epitheelcellen, waaronder enterocyten en secretoire cellen, die een barrière vormen door het vormen van nauwe verbindingen3. De snelle vernieuwing van darmepitheelcellen vereist een strikte coördinatie van celproliferatie, celdifferentiatie en celdood4,5. Verminderde celproliferatie of overmatige celdood leidt tot epitheelschade en gecompromitteerde barrièrefunctie1,6. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met inflammatoire darmziekten7,8.
Een methode om darmcrypten te kweken is eerder ontwikkeld. Met behulp van deze techniek groeien geïsoleerde muiscrypten uit tot darmorganoïden (enteroïden), die crypte-villusachtige structuren hebben en alle darmepitheelcellijn9,10bevatten. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is een thymidine analoog die in staat is om thymine (T) te vervangen in DNA dat replicatie ondergaat tijdens celproliferatie. De proliferative cellen kunnen snel en nauwkeurig worden gelabeld door EdU kleuring. Propidiumjodide (PI) is een analoog van ethidiumbromide die rode fluorescentie vrijgeeft bij het inbrengen in dubbelstrengs DNA. PI detecteert specifiek dode cellen, omdat het alleen door het beschadigde celmembraan gaat.
In dit protocol beschrijven we eerst hoe crypten uit de dunne darm van murine te isoleren en ze vervolgens te kweken als enteroïden in vitro. Vervolgens beschrijven we hoe de proliferative en dode cellen in enteroïden te analyseren door EdU en PI integratie en flow cytometrie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

Het darmepitheel fungeert als een barrière die voorkomt dat de inhoud van de armatuur, zoals pathogene microbiota en toxines, de rest van het lichaam binnendringt. Epitheliale barrière functie vereist de integriteit van darmepitheelcellen. Terwijl epitheelcelproliferatie een continue laag cellen onderhoudt die een barrière vormt, leidt epitheelschade tot barrièredisfunctie. Als gevolg hiervan kan de luminaalinhoud via een onbeperkt pad over de darmbarrière lopen. Disfunctie van de darmbarrière is geassocieerd met veel darmziekten, zoals inflammatoire darmziekte. Geïsoleerde muis darmcrypten kunnen worden gekweekt en onderhouden als crypt-villus-achtige structuren, die worden genoemd intestinale organoïden of "enteroïden". Enteroïden zijn ideaal om de proliferatie en celdood van darmepitheelcellen in vitro te bestuderen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode om het aantal proliferative en dode cellen in gekweekte enteroïden te kwantificeren. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en propidiumjodide worden gebruikt om woekerende en dode cellen in enteroïden te etiketteren, en het aandeel van vermenigvuldigende en dode cellen wordt vervolgens geanalyseerd door stroomcytometrie. Dit is een nuttig hulpmiddel om de effecten van medicamenteuze behandeling op darmepitheliale celproliferatie en celoverleving te testen.

Kleine darmcrypten werden geïsoleerd en gekweekt als enteroïden in kelder membraan matrix. Enteroïden begonnen knoppen te vormen 2 dagen na isolatie. Op dag 6 hadden enteroïden veel knoppen met veel puin (dode cellen) in het lumen. Enteroïden waren klaar om te worden doorgegeven in dit stadium (figuur 3).
Talrijke studies hebben aangetoond dat ontstekingscytokinen essentieel zijn voor het behoud van darmepitheelhomeostase. Abnormale expressie van ontstekingsc...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van flow cytometrie om het aantal vermenigvuldigende en dode cellen in gekweekte muisenteroïden te kwantificeren. Deze methode is nuttig om de effecten van medicamenteuze behandeling op organoïde proliferatie en overleving te evalueren.

Kwantificering van proliferative en dode cellen in Enteroïden

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Dit protocol is nuttig voor enteroïde isolatie in een cultuur naast het onderzoeken van celproliferatie en de overleving in enteroïden. Wetenschappers kunnen deze techniek toepassen op kweek enteroïden en het effect van geneesmiddelen en inflammatoire cytokinen op darmeppitheelcellen in vitro bestuderen. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot watertherapie van inflammatoire darmziekte.We passen deze methode toe om een aantal therapeutische cytokinen te vinden. Deze methode biedt inzicht in darmeppitheelproliferatie en overleving;daarnaast kan het ook worden gebruikt in organoïden, gekweekt rond andere weefsels dan de darm. Om darmcrypten te isoleren en enteroïde cultuur uit te voeren, gebruik maken van weefsel tangen en vinden iris schaar te ontleden ongeveer acht centimeter ileum van een geëuthanaseerde acht weken oude wild-type muis.Gebruik een spuit met een gavage voernaald om het ileum door te spoelen met ongeveer 40 milliliter ijskoude Dulbecco's Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing, snijd vervolgens in de lengte met een schaar en open het ileum. Snijd het ileum in kleine stukjes en leg ze in vijf milliliter steriele ijskoude DPBS in een conische buis van 15 milliliter. Dan rock het monster voor vijf minuten op ijs.Gebruik een pipet controller om de DPBS aan tezuilen en te vervangen door 10 milliliter koude buffer een. Na 30 minuten op ijs te hebben gegesteenten, gebruikt u de pipetcontroller om buffer één aan te trekken en te vervangen door 10 milliliter koude buffer twee. Dan schudden voor twee tot drie minuten met de hand op ongeveer 80 shakes per minuut.Na het schudden, inspecteer een twintig micro liter druppel buffer twee inhoud onder een microscoop om ervoor te zorgen dat er crypten met korrelige Paneth cellen. Filter buffer twee inhoud met een 70 micron steriele celzeef en verzamel de gefilterde buffer in een conische buis van 50 milliliter. Pipette 20 microliter filtraat op de dia om de crypten te tellen.Breng een voldoende volume van de gefilterde buffer twee inhoud om ervoor te zorgen dat er ongeveer 500 crypten per goed. Draai naar beneden op 150 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, en dan zorgvuldig aspirate de supernatant. Resuspend de crypten in 50 microliter van kelder membraan matrix per 500 crypten.Pipet op en neer zorgen om bubbels te voorkomen. Plaats een 50 microliter druppel van kelder membraan matrix en crypte mix in het midden van een put van een 24 put plaat. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius om de keldermembraanmatrix te polymeriseren.Na 30 minuten van polymerisatie, zorgvuldig toe te voegen 600 microliter van minigut media aan elke put. Breng de plaat terug naar de 37 graden Celsius incubator, en observeer elke dag onder een microscoop, waardoor de media om de twee tot drie dagen veranderen. Om de enteroïden door te geven, plaats de weefselkweekplaat op ijs, aspirate de media, en voeg een milliliter koude DPBS aan elke put.Gebruik een P1000-tip om op en neer te pipetten totdat er geen matrixbrokken overblijven. Geef het monster door een insulinespuit van één milliliter en naar beneden in een conische buis van 15 milliliter. Na vijf minuten naar beneden te hebben gedran rondgedraaid op 150 keer G en vier graden Celsius, gebruikt u een pipet om de DPBS te verwijderen.Stel de enteroïden opnieuw op in 50 microliter van keldermembraanmatrix per put. Plaats de plaat in de 37 graden Celsius incubator gedurende 30 minuten om de kelder membraan matrix te polymeriseren. Dan, overlay elk goed met 600 microliters van ENR media en de plaat terug te keren naar de incubator.Groeien enteroïden voor vijf tot zeven dagen voordat ze doorgeven in een nieuwe 24 put plaat met behulp van een splitsing verhouding van een tot twee. Voeg 600 microliters van ENR-medium toe aan elke put en broed de enteroïden vervolgens vier tot vijf dagen in de 37 graden Celsius-incubator. Stel de controlegroep van onbehandelde enteroïden en de experimentele groep enteroïden op die behandeld worden met vijf nanogram per milliliter interleukine-22.Bereid ten minste drie replicaties voor elke groep. Voeg 600 microliters van EdU medium toe aan elke put van enteroïden, behalve een put om te gebruiken als een negatieve controle voor achtergrondaftrekking. Broed de plaat twee uur in een couveuse van 37 graden Celsius.Om enteroïden uit de keldermembraanmatrix te oogsten, gebruikt u een pipetcontroller om EdU-medium aan tezuigen en één keer te wassen met DPBS. Voeg vervolgens een milliliter DPBS toe. Gebruik een P1000 pipette tip om pipet op en neer totdat er geen solide kelder membraan matrix brokken blijven.Breng het monster naar een 15 milliliter buis en spin naar beneden op 300 keer G gedurende vijf minuten voor het weggooien van de supernatant. Voeg 500 microliter van celdissociatie enzymen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een P200 pipettip om op en neer te pipetten en enteroïden in enkele cellen te breken.Voeg vervolgens drie milliliter van Dulbecco's Modified Eagle Medium toe met 10%foetaal runderserum en herhaaldelijk pipet met een P1000 pipettip. Na vijf minuten centrifugeren op 300 keer G en het opslokken van de supernatant, schorten we de cellen op in één milliliter DPBS. Om fixatie en permeabilisatie van cellen uit te voeren, breng je eerst de celsuspensie over naar een enkele vijf milliliter buis, spin je vijf minuten naar beneden op 300 keer G en gooi je de supernatant weg.We schorten de cellen op in één milliliter van 4%paraformaldehyde en stellen gedurende 15 minuten vast bij kamertemperatuur. Na vijf minuten centrifugeren op 300 keer G, de supernatant aanzuigen met een pipetpunt. Was de cellen eenmaal met de DPBS en draai weer naar beneden om de supernatant te verwijderen.Resuspend de cellen met een milliliter van 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve, en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voor het wassen van de cellen met DPBS als voorheen. Om de EdU te detecteren, voeg 100 microliter reactiecocktail toe aan elke 1,5 milliliter buis. Resuspend de cellen, en hen te beschermen tegen licht, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Na het centrifugeren op 300 keer G gedurende vijf minuten, voorzichtig aanzuigen de reactie oplossing met een pipette tip Voeg 0,5% niet-ionische oppervlakteactieve penetrant aan elke buis te wassen een keer bij kamertemperatuur. Na centrifugatie zoals voorheen, schorten we de cellen op in één milliliter DPBS. Filter de geresuspendeerde cellen met een 40 micron zeef en verzamel de gefilterde cellen in een 15 milliliter conische buis.Voer feiten over machinedetectie zo snel mogelijk uit. Selecteer het juiste kanaal en de juiste spanning voor de analyse van de stroomcytometrie. Teken voor de gatingstrategie een FSC-A versus SSC-A pseudocolor plot en verdeel de meeste cellen naar het zichtbare bereik van de puntkaart door de spanning aan te passen.Selecteer de celpopulatie als R1 en sluit het celpuin in de linkerbenedenhoek uit. Van de R1 cel populatie, stel een FSC-A versus FSC-H pseudocolor plot. Stel de poort in om afzonderlijke cellen te selecteren die als R2 zijn aangeduid en celklonen uit te sluiten.Van de R2 cel populatie, vast te stellen de fluorescentie intensiteit versus celnummer plot en gebruik maken van de negatieve controle om de poort in te stellen. Het gebied van het fluorescerende signaal is een positief celgebied aangeduid als R3.Vergelijk de verhouding van deze EdU-positieve cellen tussen de experimentele en controlegroepen. Kleine darmcrypten werden geïsoleerd en gekweekt als enteroïden in de kelder membraan matrix.Enteroïden begonnen twee dagen na isolatie knoppen te vormen. Op dag zes, enteroïden had veel knoppen met veel puin in het lumen. Enteroïden waren klaar om te worden doorgevoerd in dit stadium.Enteroïden werden behandeld met IL-22 gedurende 3 dagen, waarna het synthetische DNA werd gelabeld met EdU in het rood om celproliferatie aan te geven. IL-22 behandelde enteroïden vertoonden een verhoogd aantal EdU-positieve cellen. IL-22 verhoogde vermenigvuldigende cellen van 40,1% tot 83,5%, zoals geanalyseerd door flow cytometrie.IL-22 behandeling verhoogde ook de celdood in enteroïden aangegeven door propidium jodide kleuring in rood. IL-22 verhoogde dode cellen van 4,9% tot 16,2%, zoals geanalyseerd door flow cytometrie. Tijdens de crypt isolatie vooruitgang eerlijke schudden is nodig na het toevoegen van buffer om ervoor te zorgen genoeg crypten worden geschud.Wij adviseren het inspecteren van inhoud onder de microscoop. Na deze procedure kunnen we ook de gedifferentieerde epitheelentypes en enteroïden kwantificeren met behulp van specifieke Deze methode zal onderzoekers helpen om darmeppitheeldifferentiatie in enteroïden te onderzoeken. Na de ontwikkeling van deze vraag maakt een manier voor onderzoekers op het gebied van gastro-enterologie om de ontwikkelings- of pathologische vragen in de snede te verkennen.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Kwantificering van Orofacial Phenotypes in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observatie en kwantificering van paargedrag in het dennenaaltje,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...