Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
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Diese Arbeit wird unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 und 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing Universität (KF-GN-202004). Die Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), The Livelihood and Technology Program of Suzhou City (SYS2019030) und The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu Province (KYCX19-1981) . Diese Arbeit wird auch von Tang Scholar von der Soochow University unterstützt.

Dieses Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) an der Soochow University genehmigt.
1. DarmorganoidIsolation und Kultur
<ol><li>Isolierung von Darmkrypten und enteroiden Kulturen<ol>
<li>Euthanisieren Sie eine 8 Wochen alte Wild-Typ-Maus mit CO2-Inhalation. Verwenden Sie TissueZangen und feine Irisschere, um ca. 8 cm Ileum zu sezieren.</li>
		<li>Mit einer Spritze mit gavage Fütterungsnadel mit ca. 40 ml eiskaltem Dulb...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für die Kultur der Enteroide in vitro und die Quantifizierung von EdU- und PI-positiven Zellen in den Enteroiden durch Durchflusszytometrie erforderlich sind. Diese Strategie hat mehrere Vorteile. Erstens wird die EdU-Kennzeichnung verwendet, um vermehrende Zellen in Enteroiden zu erkennen. Im Vergleich zum herkömmlichen BrdU-Test ist die EdU-Kennzeichnungsmethode schneller, empfindlicher und genauer. EdU ist sehr ähnlich zu Thymin (T), das Thymin in der DNA-Synthese währ...

Eine grundlegende Funktion der Darmepithelzellen ist es, den Eintrag von leuchtdichtem Inhalt wie pathogenen Bakterien und Toxinen1,2zu schützen. Um eine solche Funktion auszuführen, vermehren sich Darmstammzellen kontinuierlich und differenzieren sich in eine Vielzahl von Epithelzellen, einschließlich Enterozyten und Sekretoretenzellen, die eine Barriere bilden, indem sie enge Verbindungen bilden3. Die schnelle Erneuerung der Darmepithelzellen erfordert eine strikte Koordination der Zellproliferation, Zelldifferenzierung und zelltodigeZellabnutzung 4,5. Reduzierte Zellproliferation oder übermäßiger Zelltod führt zu Epithelschäden und kompromittierter Barrierefunktion1,6. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht7,8.
Eine Methode zur Kultur von Darmkrypen wurde bereits entwickelt. Mit dieser Technik wachsen isolierte Mauskrypten zu Darmorganoiden (Enteroiden), die krypto-villus-ähnliche Strukturen haben und alle Darmepithelzelllinien9,10enthalten. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) ist ein Thymidin-Analog, das in der Lage ist, Thymin (T) in der DNA zu ersetzen, die während der Zellproliferation vermehrt wird. Die proliferativen Zellen können durch EdU-Färbung schnell und genau beschriftet werden. Propidiumiodid (PI) ist ein Analogon von Ethidiumbromid, das rote Fluoreszenz bei der Einfügung in doppelsträngige DNA freisetzt. PI erkennt gezielt abgestorbene Zellen, da sie nur durch die beschädigte Zellmembran verläuft.
In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst, wie man Krypten aus dem murinen Dünndarm isoliert und sie dann als Enteroide in vitro kultiviert. Wir beschreiben dann, wie man die proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden durch EdU und PI-Integration und Durchflusszytometrie analysiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

Das Darmepithel wirkt als Barriere, die verhindert, dass Luminalgehalte wie pathogene Mikrobiota und Toxine in den Rest des Körpers gelangen. Die Epithelbarrierefunktion erfordert die Integrität von Darmepithelzellen. Während die Epithelzellproliferation eine kontinuierliche Schicht von Zellen aufrechterhält, die eine Barriere bildet, führt Epithelschädigung zu Barrierestörungen. Dadurch können luminale Inhalte über einen unbeschränkten Weg über die Darmbarriere hinweg. Dysfunktion der Darmbarriere wurde mit vielen Darmerkrankungen verbunden, wie entzündliche Darmerkrankungen. Isolierte Maus-Darmkrypen können als krypto-villus-ähnliche Strukturen kultiviert und gepflegt werden, die als Darmorganoide oder "Enteroide" bezeichnet werden. Enteroide sind ideal, um die Proliferation und den Zelltod von Darmepithelzellen in vitro zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Methode, um die Anzahl der proliferativen und abgestorbenen Zellen in kultivierten Enteroiden zu quantifizieren. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin (EdU) und Propidiumiodid werden verwendet, um wulässige und abgestorbene Zellen in Enteroiden zu kennzeichnen, und der Anteil der vermehrenden und abgestorbenen Zellen wird dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Dies ist ein nützliches Werkzeug, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Proliferation von Darmepithelzellen und das Überleben von Zellen zu testen.

Kleine Darmkrypten wurden isoliert und als Enteroide in der Kellermembranmatrix kultiviert. Enteroide begannen 2 Tage nach der Isolation Knospen zu bilden. Am 6. Tag hatten Enteroide viele Knospen mit vielen Schutt (tote Zellen) im Lumen. Enteroide waren in diesem Stadium für den Durchgang bereit (Abbildung 3).
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass entzündliche Zytokine für die Aufrechterhaltung der Darmepithelhomöostase unerlässlich sind. Abnormale Expressi...

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Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Das vorgestellte Protokoll verwendet Diedurchflusszytometrie, um die Anzahl der sich ausbreitenden und abgestorbenen Zellen in kultivierten Mausenteroiden zu quantifizieren. Diese Methode ist hilfreich, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf die Organoidproliferation und das Überleben zu bewerten.

Quantifizierung von proliferativen und abgestorbenen Zellen in Enteroiden

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Dieses Protokoll ist nützlich für die enteroide Isolation in einer Kultur zusätzlich zur Untersuchung der Zellproliferation und des Überlebens in Enteroiden. Wissenschaftler können diese Technik auf Kulturenteroide anwenden und die Wirkung von Medikamenten und entzündlichen Zytokinen auf Darmepithelzellen in vitro untersuchen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Wassertherapie bei entzündlichen Darmerkrankungen.Wir wenden diese Methode an, um einige therapeutische Zytokine zu finden. Diese Methode bietet Einblicke in DiedarmepithelProliferation und Überleben;zusätzlich kann es auch in Organoiden verwendet werden, kultiviert um Gewebe andere als den Darm. Um Darmkrypen zu isolieren und enteroide Kultur durchzuführen, verwenden Sie Tissue Zangen und finden Irisschere, um etwa acht Zentimeter Ileum von einer eingeschläferten acht Wochen alten Wild-Typ-Maus zu dissektieren.Verwenden Sie eine Spritze mit einer Gavage-Fütterungsnadel, um das Ileum mit etwa 40 Millilitere eiskalte Dulbecco-Phosphat-Gepufferte Saline zu spülen, dann längs mit einer Schere schneiden und das Ileum öffnen. Das Ileum in kleine Stücke schneiden und in fünf Milliliter sterile eiskalte DPBS in einem 15 Milliliter konischen Rohr aufteilen. Dann die Probe für fünf Minuten auf Eis schaukeln.Verwenden Sie einen Pipettenregler, um den DPBS zu saugen und durch 10 Milliliter Kaltpuffer zu ersetzen. Nach 30 Minuten Schaukeln auf Eis verwenden Sie den Pipettenregler, um Puffer eins zu aspirieren und durch 10 Milliliter Kaltpuffer zwei zu ersetzen. Dann zwei bis drei Minuten von Hand schütteln bei ca. 80 Shakes pro Minute.Nach dem Schütteln, inspizieren Sie ein zwanzig Mikroliter Tröpfchen Puffer zwei Inhalt unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass es Krypten mit körnigen Paneth-Zellen. Filtern Sie zwei Inhalte mit einem 70 Mikron sterilen Zellsieb und sammeln Sie den gefilterten Puffer in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Pipette 20 Mikroliter Filtrat auf die Folie, um die Krypten zu zählen.Übertragen Sie ein ausreichendes Volumen des gefilterten Puffers zwei Inhalte, um sicherzustellen, dass es etwa 500 Krypten pro Brunnen gibt. Drehen Sie bei 150 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, und dann vorsichtig den Überstand aspirieren. Setzen Sie die Krypten in 50 Mikroliter Kellermembranmatrix pro 500 Krypten aus.Pipette rauf und runter unter Der pflegen, um Blasen zu vermeiden. Legen Sie ein 50 Mikroliter Tröpfchen Keller Membran Matrix und Krypta mischen in der Mitte eines Brunnens einer 24 Brunnenplatte. 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um die Kellermembranmatrix zu polymerisieren.Nach 30 Minuten Polymerisation, sorgfältig 600 Mikroliter Minigut-Medien zu jedem Brunnen hinzufügen. Bringen Sie die Platte auf den 37 Grad Celsius Brutkasten zurück und beobachten Sie jeden Tag unter dem Mikroskop, indem Sie alle zwei bis drei Tage die Medien wechseln. Um die Enteroide zu durchdringen, legen Sie die Gewebekulturplatte auf Eis, aspirieren Sie die Medien und fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter kalten DPBS hinzu.Verwenden Sie eine P1000-Spitze, um Pipette nach oben und unten zu pipette, bis keine Matrix-Stücke übrig bleiben. Geben Sie die Probe durch eine Ein-Milliliter-Insulinspritze und in eine 15 Milliliter konische Röhre. Nachdem Sie fünf Minuten bei 150 mal G und vier Grad Celsius nach unten gewirkt haben, verwenden Sie eine Pipette, um die DPBS zu entfernen.Die Enteroide in 50 Mikroliter Neiner-Membranmatrix pro Brunnen wieder aussetzen. Legen Sie die Platte 30 Minuten lang in den 37 Grad Celsius Inkubator, damit die Kellermembranmatrix polymerisiert werden kann. Dann überlagern Sie jeden Brunnen mit 600 Mikroliter ENR-Medien und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.Wachsen Sie Enteroide für fünf bis sieben Tage, bevor Sie sie in eine neue 24 Well Platte mit einem Spaltverhältnis von eins zu zwei übergeben. Fügen Sie 600 Mikroliter ENR-Medium zu jedem Brunnen hinzu, und brüten Sie dann die Enteroide für vier bis fünf Tage im 37 Grad Celsius Inkubator. Richten Sie die Kontrollgruppe der unbehandelten Enteroide und die experimentelle Gruppe der mit fünf Nanogramm pro Milliliter Interleukin-22 behandelten Enteroide ein.Bereiten Sie mindestens drei Replikationen für jede Gruppe vor. Fügen Sie 600 Mikroliter EdU-Medium zu jedem Brunnen von Enteroiden, außer einem Gut als negative Kontrolle für Hintergrundsubtraktion zu verwenden. Inkubieren Sie die Platte für zwei Stunden in einem 37 Grad Celsius Inkubator.Um Enteroide aus der Kellermembranmatrix zu ernten, verwenden Sie einen Pipettenregler, um EdU-Medium zu aspirieren und einmal mit DPBS zu waschen. Fügen Sie dann einen Milliliter DPBS hinzu. Verwenden Sie eine P1000 Pipettenspitze, um Pipetten nach oben und unten zu pipette, bis keine festen Kellermembran-Matrix-Stücke übrig bleiben.Die Probe in ein 15-Milliliter-Rohr geben und fünf Minuten lang bei 300-fachm G nach unten drehen, bevor der Überstand entsorgt wird. Fügen Sie 500 Mikroliter Zelldissoziationsenzyme hinzu und brüten sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann eine P200 Pipettenspitze, um Pipetten nach oben und unten zu pipette und Enteroide in einzelne Zellen zu brechen.Als nächstes fügen Sie drei Milliliter von Dulbeccos Modified Eagle Medium hinzu, das 10% fetales Rinderserum enthält, und wiederholt Pipette mit einer P1000 PipetteSpitze. Nach der Zentrifugierung bei 300 mal G für fünf Minuten und der Ansaugung des Überstandes setzen wir die Zellen in einem Milliliter DPBS aus. Um die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen durchzuführen, übertragen Sie zuerst die Zellsuspension auf ein ein Punkt-Fünf-Milliliter-Rohr, drehen Sie bei 300 mal G für fünf Minuten, und entsorgen Sie den Überstand.Wir suspendieren die Zellen in einem Milliliter 4%Paraformaldehyd und fixieren 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugierung bei 300 mal G für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze. Waschen Sie die Zellen einmal mit dem DPBS, und drehen Sie wieder nach unten, um den Überstand zu entfernen.Setzen Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,5% nichtionisches Tensid wieder aus und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie die Zellen wie zuvor mit DPBS waschen. Um die EdU zu erkennen, fügen Sie 100 Mikroliter Reaktionscocktail zu jeder 1,5 Milliliter Tube hinzu. Setzen Sie die Zellen wieder auf und schützen Sie sie vor Licht, und brüten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.Nach der Zentrifugierung bei 300 mal G für fünf Minuten, vorsichtig die Reaktionslösung mit einer Pipettenspitze ansaugen Fügen Sie 0,5% nicht-ionisches Tensid penetrant in jedes Rohr, um einmal bei Raumtemperatur zu waschen. Nach der Zentrifugation wie bisher setzen wir die Zellen in einem Milliliter DPBS aus. Filtern Sie die resuspendierten Zellen mit einem 40-Mikron-Sieb und sammeln Sie die gefilterten Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr.Führen Sie so schnell wie möglich Fakten zur Maschinenerkennung aus. Wählen Sie den geeigneten Kanal und die entsprechende Spannung für die Durchflusszytometrieanalyse aus. Zeichnen Sie für die Gating-Strategie ein Pseudofarbdiagramm FSC-A versus SSC-A und verteilen Sie die meisten Zellen an den sichtbaren Bereich der Punktkarte, indem Sie die Spannung anpassen.Wählen Sie die Zellenpopulation als R1 aus, und schließen Sie die Zellablagerungen in der linken unteren Ecke aus. Erstellen Sie aus der R1-Zellpopulation ein FSC-A-versus FSC-H-Pseudofarbdiagramm. Legen Sie das Tor fest, um einzelne Zellen auszuwählen, die als R2 gekennzeichnet sind, und zellenverlumps auszuschließen.Legen Sie aus der R2-Zellpopulation die Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Zellzahlendiagramm fest und verwenden Sie die negative Steuerung, um das Tor festzulegen. Der Bereich des Fluoreszenzsignals ist ein positiver Zellbereich mit der Bezeichnung R3. Vergleichen Sie das Verhältnis dieser EdU-positiven Zellen zwischen den Versuchs- und Kontrollgruppen. Kleine Darmkrypten wurden isoliert und als Enteroide in der Kellermembranmatrix kultiviert.Enteroids begannen zwei Tage nach der Isolation Knospen zu bilden. Am sechsten Tag hatten Enteroide viele Knospen mit vielen Schutt im Lumen. Enteroide waren zu diesem Zeitpunkt bereit, durchgesieben zu werden.Enteroide wurden 3 Tage lang mit IL-22 behandelt, danach wurde die synthetische DNA mit EdU in Rot gekennzeichnet, um auf die Zellproliferation hinzuweisen. IL-22 behandelte Enteroide zeigten eine erhöhte Anzahl von EdU-positiven Zellen. IL-22 erhöhte die Proliferierungszellen von 40,1% auf 83,5%, wie durch Durchflusszytometrie analysiert.Die Behandlung von IL-22 erhöhte auch den Zelltod bei Enteroiden, die durch Propidiumjodidfärbung in Rot angezeigt wurden. IL-22 erhöhte abgestorbene Zellen von 4,9% auf 16,2%, wie durch Durchflusszytometrie analysiert. Während der Krypto-Isolation Fortschritt ist faires Schütteln erforderlich, nachdem Puffer hinzugefügt wird, um sicherzustellen, dass genügend Krypten abgeschüttelt werden.Wir empfehlen, inhalte unter dem Mikroskop zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können wir auch die differenzierten Epitheltypen und Enteroide quantifizieren, indem wir spezifische Diese Methode verwendet, die Forschern helfen wird, die darmepitheliale Differenzierung in Enteroiden zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Frage Forschern auf dem Gebiet der Gastroenterologie den Weg, die entwicklungs- oder pathologischen Fragen im Schnitt zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Forschung

Biologie

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantifizierung der Orofacial Phänotypen in<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...