Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31971062, 31900326, ו 31601022), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (BK20190043, BK20180838), קרן מחקר של המעבדה מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה התרופות, אוניברסיטת נאנג'ינג (KF-GN-202004). הקרן המדע הטבעי של ג'יאנגסו מוסדות ההשכלה הגבוהה של סין (19KJB320003), תוכנית פרנסה וטכנולוגיה של סאזהאו City (SYS2019030), ואת תוכנית חדשנות מחקר עבור בוגרי המכללה של מחוז ג'יאנגסו (KYCX19-1981) . עבודה זו נתמכת גם על ידי טאנג המלומד של אוניברסיטת Soochow.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים והשתמש של קיימברידג '-Suda מרכז משאבים גנומית (CAM-SU) באוניברסיטת Soochow.
1. בידוד ותרבות אורגאיד מעיים
<ol><li>בידוד של קריפטטים מעיים ותרבות בידור<ol>
<li>המתת חסד בעכבר בן 8 שבועות בסוג פראי עם שאיפת CO2 . השתמש מלקחיים רקמות ומספריים ק...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הנחוצים לתרבות של בידור באמצעות מבחנה וכימות של תאים של EdU ו-PI-חיוביים ב-enteroids על ידי הזרמת cy, try. יש מספר יתרונות של אסטרטגיה זו. ראשית, התוויות של EdU משמשות לזיהוי תאים מתרבים ב-enteroids. בהשוואה לשיטת BrdU המסורתית, שיטת התיוג של EdU היא מהירה יותר, רגישה יותר ומדויקת יותר....

פונקציה יסודית של תאים אפיתל המעי היא להגן על כניסת תוכן הלומיאל כגון חיידקים פתוגניים ורעלים1,2. כדי לבצע פונקציה כזו, תאי גזע המעיים ברציפות מתרבים ולהבדיל למגוון של תאים אפיתל, כולל בידור תאים הפרשה, אשר יוצרים מכשול על ידי יצירת קשרים הדוקים3. התחדשות מהירה של תאים אפיתל המעי דורש תיאום מחמיר של התפשטות התא, בידול התא, ואת המוות התאים4,5. הפצת תאים מופחתת או מוות מופרז של תאים מוביל נזק אפיתל ופגיעה בתפקוד המכשול1,6. תפקוד של מכשול המעיים שויך מחלות מעיים דלקתיות7,8.
שיטה לקריפטטים מעיים תרבותי פותחה בעבר. באמצעות טכניקה זו, עכבר מבודד קריפטים לגדול לתוך מעיים אורגנואידים (enteroids), אשר יש קריפטה-villus כמו מבנים ומכילים את כל השושלת האפיתל המעי תא9,10. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) הוא אנלוגי תימידין כי הוא מסוגל להחליף תימין (T) ב-DNA כי עובר שכפול במהלך הפצת תאים. התאים הניתנים להתרבות יכולים להיות מסומנים במהירות ובדייקנות על-ידי EdU מכתים. Propidium יודיד (PI) הוא אנלוגי של אתידיום ברומיד המשחרר את הזריחה האדומה בעת הכניסה לתוך ה-DNA התקוע כפול. PI מזהה באופן ספציפי תאים מתים, שכן הוא עובר רק דרך קרום התא ניזוק.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה כיצד לבודד קריפטטים מן המעי הקטן מורטין ואז לתרבות אותם כמו בידור בתוך מבחנה. לאחר מכן נתאר כיצד לנתח את התאים המתרבים והמתים ב-enteroids על ידי EdU ו-PI התאגדות וזרימה cy, לנסות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

אפיתל המעי משמש מחסום המונע תוכן הלומיאלי, כגון מיקרוביוטה פתוגניים ורעלים, מלהיכנס לשאר הגוף. תפקוד המכשול אפיתל דורש שלמות של תאים אפיתל המעי. בעוד התפשטות התא אפיתל שומרת על שכבה רציפה של תאים המהווה מחסום, נזק אפיתל מוביל לתפקוד המכשול. כתוצאה מכך, תוכן הלומיאל יכול לחצות את מחסום המעי דרך מסלול בלתי מוגבל. התפקוד של מחסום המעיים נקשר למחלות מעיים רבות, כגון מחלות מעי דלקתיות. מבודד עכבר מעיים קריפטים יכול להיות תרבותי ומתוחזק כמו קריפטה-villus מבנים כמו, אשר מכונים אורגנואידים מעיים או "enteroids". בידור הם אידיאליים ללמוד את התפשטות ומוות התאים של תאי אפיתל המעי בתוך מבחנה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לכמת את מספר התאים המתרבים והמתים בידור תרבותי. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ו propidium יודיד משמשים לתווית תאים מתרבים ומתים ב-enteroids, ושיעור של תאים מתרבים ומתים מנותח לאחר מכן על ידי מנתחים cy, לנסות. זהו כלי שימושי כדי לבדוק את ההשפעות של טיפול תרופתי על התפשטות תא אפיתל המעי הישרדות התא.

קריפטטים מעיים קטנים היו מבודדים ומתורבתים כמו בידור בתוך מטריצת קרום המרתף. בידור החל ליצור ניצנים 2 ימים לאחר בידוד. ביום 6, enteroids היו ניצנים רבים עם המון פסולת (תאים מתים) ב לומן. המונונואידים היו מוכנים להיות בשלב זה (איור 3).
מחקרים רבים הראו כי ציטוקינים דל?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

פרוטוקול זה שימושי עבור בידוד enteroid בתרבות בנוסף לחקירת התפשטות התא ואת ההישרדות enteroids. מדענים יכולים ליישם טכניקה זו על enteroids תרבות וללמוד את ההשפעה של תרופות ציטוקינות דלקתיות על תאי אפיתל המעי במבחנה. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול במים של מחלות מעי דלקתיות.אנו מיישמים שיטה זו כדי למצוא כמה ציטוקינות טיפוליות. שיטה זו מספקת תובנות על התפשטות אפיתל המעי והישרדות;בנוסף זה עשוי לשמש גם אורגנואידים, מתורבת סביב רקמות אחרות מאשר המעי. כדי לבודד קריפטות מעיים ולבצע תרבות enteroid, להשתמש במטלות רקמות ולמצוא מספריים איריס לנתח כשמונה סנטימטרים של ileum מעכבר בר בן שמונה שבועות המתת דם.השתמש מזרק עם מחט האכלה gavage לשטוף את ileum עם כ 40 מיליליטר של קרח קר פוספט-Buffered מלוחים, ואז לחתוך לאורך עם מספריים ולפתוח את ileum. חותכים את האיליום לחתיכות קטנות ומ מניחים אותם לחמישה מיליליטר של DPBS קר כקרח סטרילי בצינור חרוט 15 מיליליטר. ואז לנענע את הדגימה במשך חמש דקות על קרח.השתמש בבקר פיפטה כדי לשאפת את ה- DPBS ולהחליף אותו ב- 10 מיליליטר של מאגר קר אחד. לאחר נדנדה במשך 30 דקות על קרח, להשתמש בבקר פיפטה כדי לשווסף חיץ אחד ולהחליף עם 10 מיליליטר של חיץ קר 2. לאחר מכן יש ללחוץ במשך 2-3 דקות ביד בערך 80 שייק לדקה.לאחר רעידות, לבדוק טיפה עשרים מיקרו ליטר של חיץ שני תוכן תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שיש קריפטות עם תאים פאנית פרטניים. סנן מאגר שני תכנים עם מסננת תאים סטריליים של 70 מיקרון ואאסוף את המאגר המסונן בצינור חרוטי של 50 מיליליטר. פיפטה 20 מיקרוליטרים של סינון על השקופית כדי לספור את הקריפטות.העבר נפח מספיק של המאגר המסונן שני תכנים כדי להבטיח כי ישנם כ 500 קריפטות לכל באר. לסובב למטה ב 150 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן בזהירות שאף את supernatant. תפזרו מחדש את הקריפטות ב-50 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף לכל 500 קריפטות.פיפטה למעלה ולמטה דואגת להימנע מבועות. מניחים טיפה של 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף ותערובת קריפטה במרכז באר אחת של צלחת 24 באר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי להפוך את מטריצת קרום המרתף.לאחר 30 דקות של פולימריזציה, בזהירות להוסיף 600 microliters של מדיה minigut לכל באר. מחזירים את הצלחת לאנקובטור של 37 מעלות צלזיוס, ומתבוננים תחת מיקרוסקופ כל יום, מחליפים את המדיה כל יומיים עד שלושה ימים. כדי לעבור את enteroids, מניחים את צלחת תרבות הרקמה על קרח, שאף את התקשורת, ולהוסיף מיליליטר אחד של DPBS קר לכל באר.השתמשו בקצה P1000 כדי לצנרת למעלה ולמטה עד שלא יישארו גושי מטריצה. מעבירים את הדגימה דרך מזרק אינסולין מיליליטר אחד ומטה לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר. לאחר מסתובב למטה במשך חמש דקות ב 150 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס, להשתמש פיפטה כדי להסיר את DPBS.להשעות מחדש את enteroids ב 50 microliters של מטריצת קרום מרתף לכל באר. מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך 30 דקות כדי לאפשר מטריצת קרום המרתף כדי פולימריזציה. לאחר מכן, שכבו כל באר עם 600 מיקרוליטרים של מדיה ENR והחזירו את הצלחת לאנקובטור.לגדל enteroids במשך חמישה עד שבעה ימים לפני עובר אותם לתוך צלחת חדשה 24 באר באמצעות יחס פיצול של אחד עד שניים. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של בינוני ENR לכל באר, ולאחר מכן להתבגר enteroids במשך ארבעה עד חמישה ימים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. הגדר את קבוצת הביקורת של enteroids מטופלים ואת הקבוצה הניסיונית של enteroids שטופלו חמישה ננוגרם למיליליטר של אינטרלוקין-22.הכן לפחות שלושה שכפולים עבור כל קבוצה. הוסף 600 מיקרוליטרים של מדיום EdU לכל באר של enteroids למעט אחד גם להשתמש כבקרה שלילית עבור חיסור רקע. דוגרים את הצלחת במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.כדי לקצור enteroids מטריצת קרום המרתף, להשתמש בבקר פיפטה כדי לשאוף מדיום EdU ולשטוף פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של DPBS. השתמשו בקצה פיפטה P1000 כדי לצנרת למעלה ולמטה עד שלא יישארו גושי מטריצת קרום מרתף מוצקים.מעבירים את הדגימה לצינור 15 מיליליטר ומסתובבים למטה פי 300 G במשך חמש דקות לפני השלכת העל-טבעי. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אנזימי דיסוציאציה של תאים ודגירה למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה P200 כדי לצנרת למעלה ולמטה ולשבור enteroids לתאים בודדים.לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום הנשר המשונה של Dulbecco המכיל נסיוב חזיר עוברי של 10%, ופעמה חוזרת ונשנית עם קצה פיפטה P1000. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, ושואפים את העל טבעי, אנו להשעות את התאים במיליליטר אחד של DPBS. כדי לבצע קיבעון ו permeabilization של תאים, תחילה להעביר את ההשעיה התא לנקודה אחת חמש צינור מיליליטר, להסתובב למטה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, ולהשליך את העל טבעי.אנחנו משהים את התאים במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde ולתקן במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, שאף את supernatant עם קצה פיפטה. לשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS, ולסובב שוב למטה כדי להסיר את supernatant.תן שימוש חוזר בתאים עם מיליליטר אחד של 0.5% פעילי שטח לא יוניים, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת התאים עם DPBS כמו קודם. כדי לזהות את EdU, להוסיף 100 microliters של קוקטייל תגובה לכל צינור 1.5 מיליליטר. תדליקו מחדש את התאים, ותגנו עליהם מפני אור, הדגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות, בעדינות לשאוף את פתרון התגובה עם טיפ פיפטה להוסיף 0.5% לא יוני פעילי שטח חדירה לכל צינור לשטוף פעם אחת בטמפרטורת החדר. בעקבות צנטריפוגה כמו קודם, אנו להשעות את התאים במיליליטר אחד של DPBS. לסנן את התאים המתווסכלים עם מסננת 40 מיקרון ולאסוף את התאים המסוננים בצינור חרוט 15 מיליליטר.בצע עובדות על זיהוי מכונה בהקדם האפשרי. בחר את הערוץ והמתח המתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה. עבור אסטרטגיית gating, לצייר FSC-A לעומת SSC-A העלילה פסאודוקולור ולהפיץ את רוב התאים לטווח הנראה של מפת הנקודות על ידי התאמת המתח.בחר את אוכלוסיית התאים כ- R1 ואל תכלול את פסולת התא בפינה השמאלית התחתונה. מאוכלוסיית תא R1, להקים FSC-A לעומת FSC-H העלילה פסאודוקולור. הגדר את השער כדי לבחור תאים בודדים המוגדרים כ- R2 ולא לכלול גושי תאים.מאוכלוסיית תא R2, להקים את עוצמת הפלואורסצנטיות לעומת התוויית מספר תא ולהשתמש בפקד השלילי כדי להגדיר את השער. האזור של אות הפלואורסצנטי הוא אזור תא חיובי המיועד R3.Compare היחס של תאים חיוביים אלה EdU בין קבוצות הניסוי והבקרה. קריפטות מעיים קטנות היו מבודדות ותרבותיות כזכיות במטריצת קרום המרתף.Enteroids התחילו ליצור ניצנים יומיים לאחר הבידוד. ביום השישי, לאנתנואידים היו הרבה ניצנים עם הרבה פסולת בלומן. האסטרואידים היו מוכנים לעבור בשלב זה.Enteroids טופלו IL-22 במשך 3 ימים, לאחר מכן DNA סינתטי היה מסומן עם EdU באדום כדי להצביע על התפשטות התא. IL-22 enteroids מטופלים הציגו מספר גדל של תאים חיוביים EdU. IL-22 גדל תאים מתרבים מ 40.1% ל 83.5% כפי שנותחו על ידי ציטומטריה זרימה.IL-22 טיפול גם הגדיל את המוות התאי enteroids מסומן על ידי כתמי יודיד פרופידיום באדום. IL-22 עלה בתאים מתים מ-4.9% ל-16.2% כפי שניתח על ידי ציטומטריית זרימה. במהלך התקדמות בידוד הקריפטה יש צורך לרעוד הוגן לאחר הוספת חיץ כדי להבטיח מספיק קריפטות מזועזעות.אנו ממליצים לבדוק את התוכן תחת מיקרוסקופ. בעקבות הליך זה, אנו יכולים גם לכמת את סוגי האפיתליאלים המובחנים ואת enteroids באמצעות שיטה ספציפית שיטה זו תסייע לחוקרים לחקור דיפרנציאלי אפיתל מעיים enteroids. לאחר התפתחותה שאלה זו סוללת דרך לחוקרים בתחום הגסטרואנטרולוגיה לחקור את השאלות ההתפתחותיות או הפתולוגיות בחיתוך.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

כימות Orofacial פנוטיפים ב<em&gt; צפרדעים</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...