Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
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Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 e 31601022), dalla Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Università di Nanchino (KF-GN-202004). La Natural Science Foundation delle istituzioni di istruzione superiore Jiangsu della Cina (19KJB320003), il programma di sussistenza e tecnologia di Suzhou City (SYS2019030) e il programma di innovazione della ricerca per i laureati universitari della provincia di Jiangsu (KYCX19-1981) . Questo lavoro è supportato anche da Tang Scholar dell'Università di Soochow.

Questo protocollo è stato approvato dall'Animal Care and Use Committee del Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) dell'Università di Soochow.
1. Isolamento e cultura degli organiidi intestinali
<ol><li>Isolamento di cripte intestinali e coltura enteroide<ol>
<li>Eutanasia un topo di tipo selvaggio di 8 settimane con inalazione di CO2. Utilizzare pinze tissutali e forbici dall'iride fine per sezionare circa 8 cm di ileo.</li>
		<li>Svuotare con un ago di alimentazione ga...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

Questo protocollo descrive in dettaglio i passi necessari per la coltura degli enteroidi in vitro e la quantificazione delle cellule EdU e PI-positive negli enteroidi per citometria di flusso. Questa strategia presenta diversi vantaggi. In primo luogo, l'etichettatura EdU viene utilizzata per rilevare le cellule proliferanti negli enteroidi. Rispetto al tradizionale saggio BrdU, il metodo di etichettatura EdU è più veloce, più sensibile e più preciso. EdU è molto simile alla timina (T), che sostituisce la timina nel...

Una funzione fondamentale delle cellule epiteliali intestinali è quella di proteggere l'ingresso del contenuto luminale come i batteri patogeni e le tossine1,2. Per svolgere tale funzione, le cellule staminali intestinali proliferano continuamente e si differenziano in una varietà di cellule epiteliali, tra cui enterociti e cellule secretorie, che formano una barriera formando connessioni strette3. Il rapido rinnovamento delle cellule epiteliali intestinali richiede un rigoroso coordinamento della proliferazione cellulare, della differenziazione cellulare e della morte cellulare4,5. La riduzione della proliferazione cellulare o l'eccessiva morte cellulare provocano danni epiteliali e la funzione di barriera compromessa1,6. Disfunzione della barriera intestinale è stata associata a malattie infiammatorie intestinali7,8.
In precedenza è stato sviluppato un metodo per la coltura delle cripte intestinali. Utilizzando questa tecnica, cripte di topo isolati crescono in organoidi intestinali (enteroidi), che hanno strutture cripto-villus come e contengono tutta la lignaggio delle cellule epiteliali intestinali9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) è un analogo di timina che è in grado di sostituire la timina (T) nel DNA che è sottoposto a replicazione durante la proliferazione cellulare. Le cellule proliferative possono essere etichettate rapidamente e con precisione dalla colorazione EdU. Propidium iodide (PI) è un analogo di bromuro di etidio che rilascia fluorescenza rossa dopo l'inserimento nel DNA a doppio filamento. PI rileva specificamente le cellule morte, dal momento che passa solo attraverso la membrana cellulare danneggiata.
In questo protocollo, descriviamo prima come isolare le cripte dall'intestino piccolo murino poi colture come enteroidi in vitro. Descriviamo quindi come analizzare le cellule proliferative e morte in enteroidi da EdU e PI incorporando e flusso citometria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

L'epitelio intestinale agisce come una barriera che impedisce al contenuto luminale, come il microbiota patogeno e le tossine, di entrare nel resto del corpo. La funzione di barriera epiteliale richiede l'integrità delle cellule epiteliali intestinali. Mentre la proliferazione delle cellule epiteliali mantiene uno strato continuo di cellule che forma una barriera, il danno epiteliale porta alla disfunzione della barriera. Di conseguenza, il contenuto luminale può attraversare la barriera intestinale attraverso un percorso illimitato. Disfunzione della barriera intestinale è stata associata a molte malattie intestinali, come la malattia infiammatoria intestinale. Le cripte intestinali isolate di topi possono essere coltivate e mantenute come strutture simili a cripte-villusi, che sono definite organoidi intestinali o "enteroidi". Gli enteroidi sono ideali per studiare la proliferazione e la morte cellulare delle cellule epiteliali intestinali in vitro. In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per quantificare il numero di cellule proliferative e morte negli enteroidi coltivati. 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) e iodio propidio vengono utilizzati per etichettare le cellule proliferanti e morte negli enteroidi, e la proporzione di proliferazione e cellule morte viene quindi analizzata dalla citometria di flusso. Questo è uno strumento utile per testare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione delle cellule epiteliali intestinali e sulla sopravvivenza delle cellule.

Piccole cripte intestinali sono state isolate e coltivate come enteroidi nella matrice della membrana seminterrato. Gli enteroidi hanno iniziato a formare gemme 2 giorni dopo l'isolamento. Il giorno 6, gli enteroidi avevano molte gemme con un sacco di detriti (cellule morte) nel lume. Gli enteroidi erano pronti per essere passaggiati in questa fase (Figura 3).
Numerosi studi hanno dimostrato che le citochine infiammatorie sono essenziali per il mantenimento dell'o...

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Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Il protocollo presentato utilizza la citometria di flusso per quantificare il numero di cellule proliferatie e morte negli enteroidi dei topi coltivati. Questo metodo è utile per valutare gli effetti del trattamento farmacologico sulla proliferazione e la sopravvivenza degli organiidi.

Quantificazione delle cellule morte e proliferanti negli enteroidi

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Questo protocollo è utile per l'isolamento enteroide in una coltura oltre a studiare la proliferazione cellulare e la sopravvivenza negli enteroidi. Gli scienziati possono applicare questa tecnica alla coltura degli enteroidi e allo studio dell'effetto dei farmaci e delle citochine infiammatorie sulle cellule epiteliali intestinali in vitro. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dell'acqua della malattia infiammatoria intestinale.Applichiamo questo metodo per trovare alcune citochine terapeutiche. Questo metodo fornisce approfondimenti sulla proliferazione e la sopravvivenza epiteliale intestinale;inoltre può essere utilizzato anche in organoidi, coltivati attorno a tessuti diversi dall'intestino. Per isolare le cripte intestinali ed eseguire la coltura enteroide, usa le pini tissutali e trova le forbici dell'iride per sezionare circa otto centimetri di ileo da un topo di tipo selvatico euthanizzato di otto settimane.Utilizzare una siringa con un ago di alimentazione del gavage per lavare l'ileo con circa 40 millilitri di salina tamponata al fosfato di Dulbecco, quindi tagliare longitudinalmente con le forbici e aprire l'ileo. Tagliare l'ileo a pezzetti e metterli in cinque millilitri di DPBS sterile ghiacciato in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi dondolare il campione per cinque minuti sul ghiaccio.Utilizzare un controller pipetta per aspirare il DPBS e sostituirlo con 10 millilitri di tampone freddo uno. Dopo aver dondolato per 30 minuti sul ghiaccio, utilizzare il controller della pipetta per aspirare il tampone uno e sostituire con 10 millilitri di tampone freddo due. Quindi agitare per due o tre minuti a mano a circa 80 frullati al minuto.Dopo aver tremato, ispezionare una goccia da venti micro litri di tampone due contenuti al microscopio per assicurarsi che ci siano cripte con cellule paneth granulari. Tampone filtrante due contenuti con un colino sterile a celle da 70 micron e raccogliere il tampone filtrato in un tubo conico da 50 millilitri. Pipetta 20 microlitri di filtrato sullo scivolo per contare le cripte.Trasferire un volume sufficiente del buffer filtrato di due contenuti per assicurarsi che ci siano circa 500 cripte per pozzo. Girare verso il basso a 150 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius, quindi aspirare attentamente il supernatante. Riprendo le cripte in 50 microlitri di matrice di membrana basale per 500 cripte.Pipetta su e giù facendo attenzione ad evitare bolle. Posizionare una goccia da 50 microliter di matrice di membrana basale e miscela di cripta al centro di un pozzo di una piastra di 24 pozzetti. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius per polimerizzare la matrice della membrana basale.Dopo 30 minuti di polimerizzazione, aggiungere con cura 600 microlitri di mezzi minigut ad ogni pozzo. Riportare la piastra all'incubatore di 37 gradi Celsius e osservare al microscopio ogni giorno, cambiando il supporto ogni due o tre giorni. Per passare gli enteroidi, posizionare la piastra di coltura tissutale sul ghiaccio, aspirare il supporto e aggiungere un millilitro di DPBS freddo ad ogni pozzo.Utilizzare una punta P1000 per pipettare su e giù fino a quando non rimangono blocchi di matrice. Passare il campione attraverso una siringa di insulina da un millilitro e scendere in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo aver filato per cinque minuti a 150 volte G e quattro gradi Celsius, utilizzare una pipetta per rimuovere il DPBS.Sospendere di nuovo gli enteroidi in 50 microlitri di matrice di membrana basale per pozzo. Posizionare la piastra nell'incubatore di 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire alla matrice della membrana basale di polimerizzare. Quindi, sovrapporre ogni pozzo con 600 microlitri di supporti ENR e restituire la piastra all'incubatore.Far crescere gli enteroidi da cinque a sette giorni prima di passarli in una nuova piastra da 24 pozzi usando un rapporto di scissione da uno a due. Aggiungere 600 microlitri di mezzo ENR a ciascun pozzo, quindi incubare gli enteroidi per quattro o cinque giorni nell'incubatore di 37 gradi Celsius. Impostare il gruppo di controllo degli enteroidi non trattati e il gruppo sperimentale di enteroidi trattati con cinque nanogrammi per millilitro di interleuchina-22.Preparare almeno tre repliche per ogni gruppo. Aggiungere 600 microlitri di supporto EdU ad ogni pozzo di enteroidi tranne uno da usare come controllo negativo per la sottrazione di fondo. Incubare il piatto per due ore in un incubatore di 37 gradi Celsius.Per raccogliere enteroidi dalla matrice della membrana del seminterrato, utilizzare un controller pipetta per aspirare il mezzo EdU e lavare una volta con DPBS. Quindi, aggiungere un millilitro di DPBS. Utilizzare una punta della pipetta P1000 per pipettare su e giù fino a quando non rimangono blocchi di matrice a membrana basale solida.Trasferire il campione su un tubo da 15 millilitri e girare verso il basso a 300 volte G per cinque minuti prima di scartare il supernatante. Aggiungere 500 microlitri di enzimi di dissociazione cellulare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi utilizzare una punta della pipetta P200 per pipettare su e giù e suddividere gli enteroidi in singole celle.Aggiungere quindi tre millilitri del mezzo aquila modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e pipettare ripetutamente con una punta di pipetta P1000. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti e aspirato il supernatante, sospendiamo le cellule in un millilitro di DPBS. Per eseguire la fissazione e la permeabilità delle cellule, trasferire prima la sospensione cellulare su un tubo millilitro di un punto cinque, girare verso il basso a 300 volte G per cinque minuti e scartare il supernatante.Sospendiamo le cellule in un millilitro di paraformaldeide al 4% e fissiamo per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, aspirare il supernatante con una punta di pipetta. Lavare le celle una volta con il DPBS e girare di nuovo verso il basso per rimuovere il supernatante.Rimescolare le cellule con un millilitro dello 0,5% di tensioattivo non ionico e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente prima di lavare le celle con DPBS come prima. Per rilevare l'EdU, aggiungere 100 microlitri di cocktail di reazione a ogni tubo da 1,5 millilitri. Rimorsi le cellule e proteggerle dalla luce, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Dopo aver centrifugato a 300 volte G per cinque minuti, aspirare delicatamente la soluzione di reazione con una punta di pipetta Aggiungere 0,5% di penetrante tensioattivo non ionico a ciascun tubo per lavare una volta a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione come prima, sospendiamo le cellule in un millilitro di DPBS. Filtrare le cellule rimorsi con un colino da 40 micron e raccogliere le celle filtrate in un tubo conico da 15 millilitri.Eseguire i fatti sul rilevamento della macchina il prima possibile. Selezionare il canale e la tensione appropriati per l'analisi della citometria di flusso. Per la strategia di gating, disegnare un plottaggio pseudocolore FSC-A contro SSC-A e distribuire la maggior parte delle celle nell'intervallo visibile della mappa puntiforme regolando la tensione.Selezionate la popolazione di celle come R1 ed escludete i detriti cellulari nell'angolo in basso a sinistra. Dalla popolazione cellulare R1, stabilire un grafico pseudocolore FSC-A contro FSC-H. Impostate il cancello per selezionare singole celle designate come R2 ed escludete i grumi di celle.Dalla popolazione cellulare R2, stabilire l'intensità di fluorescenza rispetto al grafico del numero di cella e utilizzare il controllo negativo per impostare il gate. La regione del segnale fluorescente è una regione a cellule positive denominata R3.Confronta il rapporto di queste cellule positive edu tra i gruppi sperimentali e di controllo. Piccole cripte intestinali erano isolate e coltivate come enteroidi nella matrice della membrana basale.Gli enteroidi iniziarono a formare gemme due giorni dopo l'isolamento. Il sesto giorno, gli enteroidi avevano molte gemme con molti detriti nel lume. Gli enteroidi erano pronti per essere passaggi in questa fase.Gli enteroidi sono stati trattati con IL-22 per 3 giorni, dopo di che il DNA sintetico è stato etichettato con EdU in rosso per indicare la proliferazione cellulare. Gli enteroidi trattati con IL-22 mostrarono un numero maggiore di cellule positive dell'EdU. IL-22 ha aumentato le cellule prolifere dal 40,1% all'83,5% come analizzato dalla citometria del flusso.Il trattamento IL-22 ha anche aumentato la morte cellulare negli enteroidi indicati dalla colorazione del propidio ioduro in rosso. IL-22 ha aumentato le cellule morte dal 4,9% al 16,2% come analizzato dalla citometria del flusso. Durante l'isolamento della cripta è necessaria una bella scossa dopo aver aggiunto un buffer per garantire che abbastanza cripte vengano scosse.Si consiglia di ispezionare i contenuti al microscopio. Seguendo questa procedura, possiamo anche quantificare i tipi di epiteliali differenziati e gli enteroidi utilizzando specifici Questo metodo aiuterà i ricercatori a indagare la differenziazione epiteliale intestinale negli enteroidi. Dopo il suo sviluppo questa domanda apre la strada ai ricercatori nel campo della gastroenterologia per esplorare le questioni dello sviluppo o patologiche nel taglio.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

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High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Un&#39;interfaccia utente grafica per il monitoraggio assistito della concentrazione di proteine ​​in protrusioni cellulari dinamiche

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...