Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av The National Natural Science Foundation of China (31971062, 31900326 og 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing Universitet (KF-GN-202004). Natural Science Foundation av Jiangsu Higher Education Institutions of China (19KJB320003), Levebrød og teknologi program av Suzhou City (SYS2019030), og The Research Innovation Program for College Graduates of Jiangsu-provinsen (KYCX19-1981) . Dette arbeidet støttes også av Tang Scholar of Soochow University.

Denne protokollen ble godkjent av Animal Care and Use Committee of Cambridge-Suda Genomic Resource Center (CAM-SU) ved Soochow University.
1. Intestinal organoid isolasjon og kultur
<ol><li>Isolering av tarmkrypter og enteroid kultur<ol>
<li>Euthanize en 8 uker gammel vill-type mus med CO2 innånding. Bruk vevtang og fin irissaks for å dissekere ut ca. 8 cm ileum.</li>
		<li>Skyll ut med en sprøyte med gavage fôring nål med ca 40 ml iskald Dulbeccofosfat-bufret saltvann (DPBS)...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

Denne protokollen beskriver trinnene som er nødvendige for kulturen av enteroider in vitro og kvantifisering av EdU- og PI-positive celler i enteroider ved flyt cytometri. Det er flere fordeler med denne strategien. Først brukes EdU-merking til å oppdage prolifererende celler i enteroider. Sammenlignet med tradisjonell BrdU-analyse er EdU-merkingsmetoden raskere, mer følsom og mer nøyaktig. EdU er svært lik thymine (T), som erstatter dinin i DNA-syntese under celledeling. Sammenlignet med BrdU antistoff, Er EdU let...

En grunnleggende funksjon av intestinal epitetialceller er å beskytte oppføring av luminal innhold som patogene bakterier og giftstoffer1,2. For å utføre en slik funksjon sprer tarmstamceller kontinuerlig og differensierer seg til en rekke epitelceller, inkludert enterocytter og sekretoriske celler, som danner en barriere ved å danne stramme forbindelser3. Den raske fornyelsen av intestinale epitelceller krever streng koordinering av cellespredning, celledifferensiering og celledød4,5. Redusert cellespredning eller overdreven celledød fører til epitelskade og kompromittert barrierefunksjon1,6. Dysfunksjon av tarmbarrieren har vært forbundet med inflammatoriske tarmsykdommer7,8.
En metode for å kultur tarm krypter har tidligere blitt utviklet. Ved hjelp av denne teknikken vokser isolerte musekrypter til tarmorganoider (enteroider), som har krypt-villus som strukturer og inneholder alle intestinal epitetial celle avstamning9,10. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) er en tymidin analog som er i stand til å erstatte dinmin (T) i DNA som gjennomgår replikering under cellespredning. De proliferative cellene kan raskt og nøyaktig merkes av EdU-farging. Propidium jodid (PI) er en analog av ethidium bromid som frigjør rød fluorescens ved innsetting i dobbelt-strandet DNA. PI oppdager spesifikt døde celler, siden den bare passerer gjennom den skadede cellemembranen.
I denne protokollen beskriver vi først hvordan man isolerer krypter fra murine tynntarmen og deretter kultur dem som enteroider in vitro. Vi beskriver deretter hvordan du analyserer de proliferative og døde cellene i enteroider av EdU og PI inkorporering og flyt cytometri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

Tarmepitelet fungerer som en barriere som forhindrer luminalt innhold, som patogen mikrobiota og toksiner, fra å komme inn i resten av kroppen. Epitelbarrierefunksjon krever integriteten til intestinale epitelceller. Mens epitelcellespredning opprettholder et kontinuerlig lag med celler som danner en barriere, fører epitelskade til barrieredysfunksjon. Som et resultat kan luminalt innhold over tarmbarrieren via en ubegrenset vei. Dysfunksjon av tarmbarrieren har vært forbundet med mange tarmsykdommer, som inflammatorisk tarmsykdom. Isolerte musetarmkrypter kan dyrkes og opprettholdes som krypt-villus-lignende strukturer, som kalles tarmorganoider eller "enteroider". Enteroider er ideelle for å studere spredning og celledød av intestinal epitetialceller in vitro. I denne protokollen beskriver vi en enkel metode for å kvantifisere antall proliferative og døde celler i kultiverte enteroider. 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) og propidium jodid brukes til å merke prolifererende og døde celler i enteroider, og andelen av prolifererende og døde celler analyseres deretter ved flyt cytometri. Dette er et nyttig verktøy for å teste effekten av legemiddelbehandling på intestinal epitelcellespredning og celleoverlevelse.

Små tarmkrypter ble isolert og dyrket som enteroider i kjellermembranmatrisen. Enteroider begynte å danne knopper 2 dager etter isolasjon. På dag 6 hadde enteroider mange knopper med mye rusk (døde celler) i lumen. Enteroider var klare til å bli passasjer på dette stadiet (Figur 3).
Tallrike studier har vist at inflammatoriske cytokiner er avgjørende for vedlikehold av intestinal epitelial homeostase. Unormalt uttrykk for inflammatoriske cytokiner er nært ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Den presenterte protokollen bruker flyt cytometri for å kvantifisere antall spre og døde celler i kultiverte mus enteroider. Denne metoden er nyttig for å evaluere effekten av medikamentell behandling på organoid spredning og overlevelse.

Kvantifisering av proliferative og døde celler i enteroider

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Denne protokollen er nyttig for enteroid isolasjon i en kultur i tillegg til å undersøke cellespredning og overlevelse i enteroider. Forskere kan bruke denne teknikken til kultur enteroider og å studere effekten av legemidler og inflammatoriske cytokiner på tarm epitelceller in vitro. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg til vannbehandling av inflammatorisk tarmsykdom.Vi bruker denne metoden i å finne noen terapeutiske cytokiner. Denne metoden gir innsikt i intestinal epitelspredning og overlevelse;i tillegg kan den også brukes i organoider, dyrket rundt andre vev enn tarmen. For å isolere tarmbryter og utføre enteroid kultur, bruk vevs tang og finn iris saks for å dissekere ut omtrent åtte centimeter ileum fra en euthanized åtte uker gammel vill-type mus.Bruk en sprøyte med en gavage fôr nål å skylle ileum med ca 40 milliliter iskald Dulbecco's Fosfat-Bufret Saltvann, deretter kuttet på langs med saks og åpne ileum. Skjær ileum i små biter og legg dem i fem milliliter sterile iskalde DPBS i et 15 milliliter konisk rør. Deretter rock prøven i fem minutter på is.Bruk en pipettekontroller til å aspirere DPBS og erstatte den med 10 milliliter kald buffer en. Etter gynge i 30 minutter på is, bruk pipettekontrolleren til å aspirere buffer en og erstatte med 10 milliliter kald buffer to. Deretter rister du i to til tre minutter for hånd på ca. 80 rister per minutt.Etter risting, inspiser en tjue mikro liter dråpe buffer to innhold under et mikroskop for å sikre at det er krypter med granulære Paneth celler. Filter buffer to innhold med en 70 mikron steril celle sil og samle filtrert buffer i en 50 milliliter konisk rør. Pipette 20 mikroliter filtrat på lysbildet for å telle kryptene.Overfør et tilstrekkelig volum av det filtrerte buffer to innholdet for å sikre at det er ca 500 krypter per brønn. Spinn ned på 150 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og aspirer deretter forsiktig det overnaturante. Resuspend kryptene i 50 mikroliter kjeller membran matrise per 500 krypter.Pipetten opp og ned tar vare for å unngå bobler. Plasser en 50 mikroliterdråpe kjellermembranmatrise og kryptblanding i midten av en brønn av en 24-brønnplate. Inkuber i 30 minutter ved 37 grader Celsius for å polymerisere kjellermembranmatrisen.Etter 30 minutter med polymerisering, legg forsiktig til 600 mikroliter minigut-medier til hver brønn. Returner platen til 37 grader Celsius inkubator, og observere under et mikroskop hver dag, endre media hver to til tre dager. For å passere enteroider, legg vevskulturplaten på is, aspirer media, og legg til en milliliter kald DPBS til hver brønn.Bruk en P1000-tupp til pipette opp og ned til ingen matrisebiter gjenstår. Før prøven opp gjennom en en milliliter insulinsprøyte og ned i et konisk rør på 15 milliliter. Etter å ha snurret ned i fem minutter ved 150 ganger G og fire grader Celsius, bruk en pipette til å fjerne DPBS.Re-suspendere enteroider i 50 mikroliter kjeller membran matrise per brønn. Plasser platen i 37 grader Celsius inkubator i 30 minutter for å la kjelleren membran matrise å polymerisere. Deretter legger du hver brønn over med 600 mikroliter ENR-medier og returnerer platen til inkubatoren.Vokse enteroider i fem til syv dager før passaging dem inn i en ny 24 brønnplate ved hjelp av en splitting ratio på en til to. Tilsett 600 mikroliter ENR-medium til hver brønn, og inkuber deretter enteroidene i fire til fem dager i 37 grader Celsius inkubator. Sett opp kontrollgruppen av ubehandlede enteroider og den eksperimentelle gruppen av enteroider behandlet med fem nanogram per milliliter interleukin-22.Forbered minst tre repliker for hver gruppe. Legg til 600 mikroliter edu medium til hver brønn av enteroider unntatt en brønn å bruke som en negativ kontroll for bakgrunnsundertraksjon. Inkuber platen i to timer i en 37 grader celsius inkubator.For å høste enteroider fra kjelleren membran matrise, bruk en pipette kontrolleren til å aspirere EdU medium og vaske en gang med DPBS. Deretter legger du til en milliliter DPBS. Bruk en P1000 pipettespiss til pipette opp og ned til det ikke gjenstår noen solide kjellermembranmatrisebiter.Overfør prøven til et 15 milliliter rør og spinn ned til 300 ganger G i fem minutter før du kaster det overnaturlige. Tilsett 500 mikroliter celledissosiasjonsenzymer og inkuber i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Bruk deretter en P200 pipettespiss til pipette opp og ned og bryte enteroider i enkeltceller.Deretter legger du til tre milliliter av Dulbeccos modifiserte eagle medium som inneholder 10% fosterbovinserum, og gjentatte ganger pipetter med en P1000 pipettespiss. Etter sentrifugering ved 300 ganger G i fem minutter, og aspirering av supernatanten, suspenderer vi cellene i en milliliter DPBS. For å utføre fiksering og permeabilisering av celler, først overføre cellesuspensjonen til et ett punkt fem milliliter rør, spinne ned på 300 ganger G i fem minutter, og kast det overnaturlige.Vi suspenderer cellene i en milliliter på 4% paraformaldehyd og fikser i 15 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering ved 300 ganger G i fem minutter, aspirerer du overnatanten med en pipettespiss. Vask cellene en gang med DPBS, og spinn ned igjen for å fjerne det overnaturlige.Resuspend cellene med en milliliter på 0,5% ikke-ionisk overflateaktivt middel, og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur før du vasker cellene med DPBS som før. For å oppdage EdU, legg til 100 mikroliter reaksjonscocktail til hvert 1,5 milliliter rør. Resuspend cellene, og beskytte dem mot lys, inkubere i 30 minutter ved romtemperatur.Etter sentrifugering ved 300 ganger G i fem minutter, aspirer forsiktig reaksjonsløsningen med en pipettespiss Tilsett 0,5% ikke-ionisk overflateaktivt middel til hvert rør for å vaske en gang ved romtemperatur. Etter sentrifugering som før suspenderer vi cellene i en milliliter DPBS. Filtrer de gjenbrukte cellene med en 40 mikron sil og samle de filtrerte cellene i et 15 milliliter konisk rør.Utfør fakta om maskindeteksjon så snart som mulig. Velg riktig kanal og spenning for strømningscytometrianalyse. For gating strategi, tegne en FSC-A versus SSC-A pseudocolor plott og distribuere de fleste av cellene til det synlige området av prikkkartet ved å justere spenningen.Merk cellepopulasjonen som R1 og ekskluder celleavfallet nederst til venstre. Fra R1 cellepopulasjonen, etablere en FSC-A versus FSC-H pseudocolor plot. Angi porten for å velge enkeltceller som er angitt som R2 og utelate celleclumps.Fra R2 cellepopulasjonen, etablere fluorescens intensitet versus cellenummer plott og bruke den negative kontrollen til å sette porten. Regionen av fluorescerende signalet er en positiv celleregion utpekt R3.Sammenlign forholdet mellom disse EdU positive cellene mellom eksperimentelle og kontrollgrupper. Små tarmkrypter ble isolert og kultivert som enteroider i kjelleren membran matrise.Enteroids begynte å danne knopper to dager etter isolasjon. På dag seks hadde enteroider mange knopper med mye rusk i lumen. Enteroids var klar til å bli passasjer på dette stadiet.Enteroider ble behandlet med IL-22 i 3 dager, hvorav det syntetiske DNA ble merket med EdU i rødt for å indikere cellespredning. IL-22 behandlede enteroider viste et økt antall EdU positive celler. IL-22 økte spredningsceller fra 40,1% til 83,5%som analysert av strømningscytometri.IL-22 behandling økte også celledøden i enteroider indikert ved propidiumjodidfarging i rødt. IL-22 økte døde celler fra 4,9% til 16,2%som analysert av flytcytometri. Under krypten isolasjon fremgang rettferdig risting er nødvendig etter å legge buffer for å sikre nok krypter er rystet ned.Vi anbefaler å inspisere innholdet under mikroskop. Etter denne prosedyren kan vi også kvantifisere de differensierte epiteltypene og enteroider ved hjelp av spesifikke Denne metoden vil hjelpe forskere til å undersøke tarmepiteldifferensiering i enteroider. Etter utviklingen baner dette spørsmålet en måte for forskere innen gastroenterologi å utforske utviklingsmessige eller patologiske spørsmål i kuttet.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Temporal Kvantifisering av MAPK Induced Expression i Enkeltgjærceller

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Kvantifisering av Orofacial fenotyper i<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantifisering av krystallinsk cellulose akkumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots å overvåke Tissue-spesifikke Cell Wall Modifikasjoner

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observasjon og Kvantifisering av Mating Behavior i Pinewood nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ overvåking av midlertidig dannet Molecular Anstandsdame forsamlinger i bakterier, gjær, og menneskelige celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...