Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Эта работа поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (31971062, 31900326 и 31601022), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20190043, BK20180838), Научно-исследовательским фондом Государственной ключевой лаборатории фармацевтической биотехнологии, Нанкинский университет (KF-GN-202004). Фонд естественных наук высших учебных заведений Китая Цзянсу (19KJB320003), программа обеспечения жизни и технологии города Сучжоу (SYS2019030) и Программа научно-исследовательской инновационной программы для выпускников колледжей провинции Цзянсу (KYCX19-1981) . Эта работа также поддерживается Тан ученый Университета Soochow.

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Кембриджского-Судаского геномного ресурсного центра (CAM-SU) при Университете Соохова.
1. Кишечная органоидная изоляция и культура
<ol><li>Изоляция кишечных склепов и энтероидной культуры<ol>
<li>Эвтаназия 8-?...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

Этот протокол детализирует шаги, необходимые для культуры enteroids in vitro и количественной оценки EdU- и PI-положительных клеток в enteroids цитометрией потока. Есть несколько преимуществ этой стратегии. Во-первых, маркировка EdU используется для обнаружения размножающихся клеток в ветроидающих. П?...

Фундаментальная функция кишечных эпителиальных клеток заключается в защите попадания содержимого светила, таких как патогенные бактерии и токсины1,2. Для выполнения такой функции, кишечные стволовые клетки непрерывно размножаться и дифференцироваться в различные эпителиальные клетки, в том числе энтероцитов и секреторных клеток, которые образуют барьер, образуя тесные соединения3. Быстрое обновление кишечных эпителиальных клеток требует строгой координации пролиферации клеток, дифференциации клеток и гибели клеток4,5. Снижение пролиферации клеток или чрезмерная гибель клеток приводит к эпителиальному повреждению и скомпрометированной функциибарьера1,6. Дисфункция кишечного барьера была связана с воспалительными заболеваниями кишечника7,8.
Ранее был разработан метод культуры кишечных склепов. Используя этот метод, изолированные мыши ные склепы растут в кишечные органоиды (enteroids), которые имеют crypt-villus как структуры и содержат все кишечной эпителиальной линии клеток9,10. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) является аналогом тимидина, который способен заменить тимин (T) в ДНК, которая проходит репликацию во время пролиферации клеток. Пролиферативные клетки могут быть быстро и точно помечены EdU окрашивания. Propidium iodide (PI) является аналогом бромида этидия, который высвобождает красную флуоресценцию при вставке в двухцепочечную ДНК. PI специально обнаруживает мертвые клетки, так как он проходит только через поврежденную мембрану клетки.
В этом протоколе мы сначала описываем, как изолировать склепы из тонкой кишки, а затем культивировать их как ветероиды in vitro. Затем мы описываем, как анализировать пролиферативные и мертвые клетки в enteroids EdU и PI включения и потока цитометрии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

Кишечный эпителий действует как барьер, который предотвращает проникновение в остальную часть тела содержимого светила, например патогенной микробиоты и токсинов. Функция эпителиального барьера требует целостности кишечных эпителиальных клеток. В то время как эпителиальная пролиферация клеток поддерживает непрерывный слой клеток, который образует барьер, эпителиальный ущерб приводит к барьерной дисфункции. В результате содержимое светильника может пересекать кишечный барьер неограниченным путем. Дисфункция кишечного барьера была связана со многими кишечными заболеваниями, такими как воспалительные заболевания кишечника. Изолированные мыши кишечные склепы могут быть культивированы и поддерживается как склеповидные структуры, которые называются кишечными органоидами или "энтероидами". Энтероиды идеально подходят для изучения пролиферации и клеточной смерти кишечных эпителиальных клеток in vitro. В этом протоколе мы описываем простой метод количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных энтероидах. 5-этинил-2'-deoxyuridine (EdU) и пропидий йодид используются для обозначения размножающихся и мертвых клеток в энтероидах, а доля размножающихся и мертвых клеток затем анализируется цитометрией потока. Это полезный инструмент для проверки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию эпителиальных клеток кишечника и выживание клеток.

Небольшие кишечные склепы были изолированы и культивированы как enteroids в подвальной мембранной матрице. Энтероиды начали образовывать бутоны через 2 дня после изоляции. На 6-й день, enteroids было много почек с большим количеством мусора (мертвые клетки) в просвете. Enteroids были готовы к прохожд?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids at JoVE.com

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

Представленный протокол использует цитометрию потока для количественной оценки количества размножающихся и мертвых клеток в культивированных вратах мыши. Этот метод полезен для оценки влияния медикаментозного лечения на пролиферацию и выживание органов.

Количественная оценка пролиферативной и мертвой клетки в Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Этот протокол полезен для энтероидной изоляции в культуре в дополнение к расследованию пролиферации клеток и выживания в энтероидах. Ученые могут применять этот метод для культуры энтероидов и для изучения влияния наркотиков и воспалительных цитокинов на кишечные эпителиальные клетки in vitro. Последствия этого метода распространяются на водную терапию воспалительных заболеваний кишечника.Мы применяем этот метод, чтобы найти некоторые терапевтические цитокины. Этот метод дает представление о кишечной эпителиальной пролиферации и выживания; кроме того, он также может быть использован в органоидов, культурных вокруг тканей, кроме кишечника. Чтобы изолировать кишечные склепы и выполнить энтероидной культуры, использовать ткани миппы и найти ножницы радужной оболочки, чтобы вскрыть примерно восемь сантиметров илея от усыпляется восемь недель дикий тип мыши.Используйте шприц с иглой для кормления гаважа, чтобы промыть илеум с около 40 миллилитров ледяной Dulbecco в фосфат-buffered солевой, а затем вырезать вдоль ножницами и открыть илеум. Разрежьте илеум на мелкие кусочки и поместите их на пять миллилитров стерильных ледяных DPBS в 15 миллилитров конической трубки. Затем раскачивать образец в течение пяти минут на льду.Используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать DPBS и заменить его на 10 миллилитров холодного буфера. После раскачивания в течение 30 минут на льду, используйте контроллер пипетки, чтобы аспирировать буфер один и заменить 10 миллилитров холодного буфера два. Затем встряхните в течение двух-трех минут вручную примерно при 80 коктейлях в минуту.После встряхивания, проинспектировать двадцать микро-литровую каплю буфера два содержимого под микроскопом, чтобы обеспечить Есть склепы с гранулированными клетками Панет. Фильтр буфера два содержимого с 70 микрон стерильных клеток ситечко и собирать фильтрованный буфер в 50 миллилитров конической трубки. Pipette 20 микролитров фильтрата на слайде, чтобы подсчитать склепы.Передача достаточного объема отфильтрованного буфера два содержимого, чтобы убедиться, что Есть около 500 склепов на колодец. Спин вниз при 150 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию, а затем тщательно аспирировать супернатант. Перепроходить склепы в 50 микролитров мембранной матрицы подвала на 500 склепов.Pipette вверх и вниз, заботясь, чтобы избежать пузырьков. Поместите 50 микролитров капли мембранной матрицы подвала и склеп смеси в центре одного колодец из 24 хорошо пластины. Инкубация в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия для полимеризации мембранной матрицы подвала.После 30 минут полимеризации, тщательно добавьте 600 микролитров минигут-медиа к каждой хорошо. Вернуть пластину в 37 градусов по Цельсию инкубатор, и наблюдать под микроскопом каждый день, меняя средства массовой информации каждые два-три дня. Чтобы пройти энтероиды, поместите пластину культуры тканей на лед, аспирировать средства массовой информации, и добавить один миллилитр холодного DPBS к каждому хорошо.Используйте наконечник P1000 для пипетки вверх и вниз, пока не останется никаких матричных кусков. Перейдите образец через один миллилитр инсулина шприц и вниз в 15 миллилитров конической трубки. После вращения вниз в течение пяти минут при 150 раз G и четыре градуса по Цельсию, используйте пипетки для удаления DPBS.Повторно приостанавливать энтероиды в 50 микролитров мембранной матрицы подвала на колодец. Поместите пластину в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы позволить матрице мембраны подвала полимеризировать. Затем наложить каждый колодец с 600 микролитров ENR-медиа и вернуть пластину в инкубатор.Выращивайте энтероиды в течение пяти-семи дней, прежде чем передать их в новую пластину 24 хорошо, используя коэффициент расщепления один к двум. Добавьте 600 микролитров среды ENR к каждой хорошо, а затем инкубировать энтероиды в течение четырех-пяти дней в инкубаторе 37 градусов по Цельсию. Настройка контрольной группы необработанных энтероидов и экспериментальной группы энтероидов, обработанных пятью нанограммами на миллилитр интерлейкина-22.Подготовь по крайней мере три репликации для каждой группы. Добавьте 600 микролитров среды EdU к каждой хорошо энтероидов, за исключением одного хорошо использовать в качестве отрицательного контроля для фонового вычитания. Инкубировать пластину в течение двух часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию.Для сбора энтероидов из мембранной матрицы подвала используйте контроллер пипетки для аспирации среды EdU и вымойте один раз с помощью DPBS. Затем добавьте один миллилитр DPBS. Используйте P1000 пипетки отзыв пипетки вверх и вниз, пока не твердые мембраны мембраны куски остаются.Перенесите образец в 15-миллилитровую трубку и вращайте вниз при 300 раз G в течение пяти минут, прежде чем сбросить супернатант. Добавьте 500 микролитров ферментов диссоциации клеток и инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах цельсия. Затем используйте наконечник пипетки P200 для пипетки вверх и вниз и разбить энтероиды на одиночные клетки.Далее добавьте три миллилитров модифицированного орлиного медиума Dulbecco, содержащего 10%fetal бычьей сыворотки, и неоднократно пипетку с наконечником пипетки P1000. После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут, и аспирации супернатанта, мы приостанавливаем клетки в один миллилитр DPBS. Для выполнения фиксации и пермеабилизации клеток сначала перенесите подвеску клетки в одну точку пятими миллилитровую трубку, вращайте вниз при 300 Г в течение пяти минут и отбрасывайте супернатант.Мы приостанавливаем клетки в один миллилитр 4%paraformaldehyde и исправить в течение 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут, аспирировать супернатант с наконечником пипетки. Вымойте клетки один раз с DPBS, и спина вниз снова, чтобы удалить супернатант.Resuspend клетки с одним миллилитром 0.5%non-ionic surfactant, и инкубируют на 10 минут на комнатной температуре перед мытьем клеток с DPBS как раньше. Чтобы обнаружить EdU, добавьте 100 микролитров реакционной коктейля в каждую 1,5 миллилитровую трубку. Повторное течение клеток, и защитить их от света, инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.После центрифугирования в 300 раз G в течение пяти минут, осторожно аспирировать раствор реакции с наконечником пипетки Добавить 0,5%non-ionic surfactant пенетрант для каждой трубки, чтобы вымыть один раз при комнатной температуре. После центрифугации, как и прежде, мы приостанавливаем клетки в один миллилитр DPBS. Фильтровать повторно начерщенные клетки с 40 микрон ситечко и собирать фильтрованные клетки в 15 миллилитров конической трубки.Выполните факты по обнаружению машины как можно скорее. Выберите соответствующий канал и напряжение для анализа цитометрии потока. Для стратегии gating нарисуйте участок псевдоцвета FSC-A против SSC-A и распределите большую часть ячеек в видимый диапазон точечной карты, регулируя напряжение.Выберите популяцию ячейки в качестве R1 и исключите клеточный мусор в левом нижнем углу. Из популяции ячеек R1 создать FSC-A против FSC-H псевдоцветный сюжет. Установите ворота, чтобы выбрать одиночные ячейки, обозначенные как R2, и исключить скопления клеток.Из популяции клеток R2 установите интенсивность флуоресценции по сравнению с участком числа клеток и используйте отрицательный контроль для установления ворот. Область флуоресцентного сигнала является положительной клеточной областью, обозначенной R3.Сравните соотношение этих положительных клеток EdU между экспериментальными и контрольными группами. Небольшие кишечные склепы были изолированы и выучены как энтероиды в мембранной матрице подвала.Энтероиды начали образовывать почки через два дня после изоляции. На шестой день у энтероидов было много почек с большим количеством мусора в люмене. Энтероиды были готовы к прохождению на данном этапе.Энтероиды лечились ИЛ-22 в течение 3 дней, после чего синтетическая ДНК была помечена Эду красным цветом, чтобы указать на пролиферацию клеток. ИЛ-22 обработанных энтероидов отображается увеличение числа Эду положительных клеток. IL-22 увеличил размножающиеся клетки с 40,1% до 83,5%, как анализируется цитометрией потока.Лечение ИЛ-22 также увеличило гибель клеток в энтероидах, о чем свидетельствует окрашивание йодида пропидия в красный цвет. IL-22 увеличил мертвые клетки с 4,9% до 16,2%, как анализируется цитометрией потока. Во время склепа изоляции прогресс справедливой встряхивания необходимо после добавления буфера для обеспечения достаточного количества склепов сотрясаются.Мы советуем проверять содержимое под микроскопом. После этой процедуры, мы также можем количественно дифференцированных типов эпителий и энтероидов с помощью конкретных Этот метод поможет исследователям исследовать кишечной эпителиальной дифференциации в энтероидов. После своего развития этот вопрос прокладывает путь для исследователей в области гастроэнтерологии для изучения развития или патологических вопросов в разрезе.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Количественная оценка Орофациальные фенотипов в<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Наблюдение и Количественное брачного поведения в Pinewood нематоды,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...