Name: quantification of proliferative and dead cells in enteroids
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31971062, 31900326 y 31601022), The Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20190043, BK20180838), Research Fund of State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Universidad de Nanjing (KF-GN-202004). La Fundación de Ciencias Naturales de las Instituciones de Educación Superior Jiangsu de China (19KJB320003), el Programa de Vida y Tecnología de la Ciudad de Suzhou (SYS2019030), y el Programa de Innovación en Investigación para Graduados Universitarios de la Provincia de Jiangsu (KYCX19-1981) . Este trabajo también cuenta con el apoyo de Tang Scholar de la Universidad de Soochow.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Recursos Genómicos de Cambridge-Suda (CAM-SU) de la Universidad de Soochow.
1. Aislamiento y cultivo organoides intestinales
<ol><li>Aislamiento de criptas intestinales y cultura enteroide<ol>
<li>Eutanasia un ratón de tipo salvaje de 8 semanas de edad con inhalación deCO2. Use fórceps tisulares y tijeras de iris finas para diseccionar aproximadamente 8 cm de íleon.</li>
		<li>Enjuague con u...

<ol>
	<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+epithelial+barrier:+a+therapeutic+target.">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li><li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease.">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li><li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tales+from+the+crypt:+new+insights+into+intestinal+stem+cells.">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li><li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier:+a+fundamental+role+in+health+and+disease.">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology &amp; Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li><li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut.">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094 (2019).</li><li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability.">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032 (2018).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li><li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis.">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease.">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li><li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling.">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li></ol>

Este protocolo detalla los pasos necesarios para el cultivo de enteroides in vitro y la cuantificación de células EdU y PI-positivas en los enteroides por citometría de flujo. Hay varias ventajas de esta estrategia. En primer lugar, el etiquetado EdU se utiliza para detectar células que proliferan en enteroides. En comparación con el ensayo tradicional de BrdU, el método de etiquetado EdU es más rápido, más sensible y más preciso. EdU es muy similar a la timina (T), que reemplaza la timina en la síntesis de AD...

Una función fundamental de las células epiteliales intestinales es proteger la entrada de contenidos luminales como bacterias patógenas y toxinas1,2. Para realizar tal función, las células madre intestinales proliferan y diferencian continuamente en una variedad de células epiteliales, incluyendo enterocitos y células secretoras, que forman una barrera mediante la formación de conexiones estrechas3. La rápida renovación de las células epiteliales intestinales requiere una estricta coordinación de la proliferación celular, la diferenciación celular y la muerte celular4,5. La reducción de la proliferación celular o la muerte celular excesiva conduce a daño epitelial y función de barrera comprometida1,6. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con enfermedades inflamatorias intestinales7,8.
Un método para cultivar criptas intestinales ha sido desarrollado previamente. Usando esta técnica, las criptas de ratón aisladas crecen en organoides intestinales (enteroides), que tienen estructuras similares a criptas y contienen todo el linaje celular epitelial intestinal9,10. 5-Etil-2'-desoxiuridina (EdU) es un análogo de timidina que es capaz de reemplazar la timina (T) en el ADN que se está replicando durante la proliferación celular. Las células proliferativas pueden ser etiquetadas rápida y precisamente por la tinción edU. El yoduro de propiduro (PI) es un análogo del bromuro de etidio que libera fluorescencia roja al insertarse en ADN de doble cadena. PI detecta específicamente las células muertas, ya que sólo pasa a través de la membrana celular dañada.
En este protocolo, primero describimos cómo aislar las criptas del intestino delgado murino y luego cultivarlas como enteroides in vitro. A continuación, describimos cómo analizar las células proliferativas y muertas en los enteroides por la incorporación de EdU y PI y la citometría de flujo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G gavage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm sterile cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A24863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mM EDTA in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/B6 mice</td>
			<td>Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-dissociation enzymes (TrypLE)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C10639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-sorbitol</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BBI</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENR media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Minigut media, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml Noggin, 500 ng/ml R-spondin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2037454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minigut media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonionic surfactant (Triton X)</td>
			<td>BBI</td>
			<td>TB0198-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissor (12.5 cm)</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2025785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penn/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3474-RS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IL-22</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>210-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BBI</td>
			<td>SB0498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Tansoole</td>
			<td>2026704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HC1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of proliferative and dead cells in enteroids

El epitelio intestinal actúa como una barrera que impide que el contenido luminal, como la microbiota patógena y las toxinas, entre en el resto del cuerpo. La función de barrera epitelial requiere la integridad de las células epiteliales intestinales. Mientras que la proliferación de células epiteliales mantiene una capa continua de células que forma una barrera, daño epitelial conduce a la disfunción de barrera. Como resultado, el contenido luminal puede atravesar la barrera intestinal a través de una vía sin restricciones. La disfunción de la barrera intestinal se ha asociado con muchas enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal. Las criptas intestinales aisladas del ratón se pueden cultivar y mantener como estructuras similares a la cripta, que se denominan organoides intestinales o "enteroides". Los enteroides son ideales para estudiar la proliferación y muerte celular de las células epiteliales intestinales in vitro. En este protocolo, describimos un método simple para cuantificar el número de células proliferativas y muertas en enteroides cultivados. 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU) y yoduro de propidium se utilizan para etiquetar células proliferantes y muertas en enteroides, y la proporción de células muertas y proliferantes se analizan por citometría de flujo. Esta es una herramienta útil para probar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación de células epiteliales intestinales y la supervivencia celular.

Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano. Enteroids comenzó a formar brotes 2 días después del aislamiento. En el día 6, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos desechos (células muertas) en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser repasados en esta etapa(Figura 3).
Numerosos estudios han demostrado que las citoquinas inflamatorias son esenciales para el mantenimiento de...

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Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

El protocolo presentado utiliza citometría de flujo para cuantificar el número de células muertas y proliferantes en enteroides de ratón cultivados. Este método es útil para evaluar los efectos del tratamiento farmacológico en la proliferación y supervivencia de los organoides.

Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Este protocolo es útil para el aislamiento enteroide en un cultivo, además de investigar la proliferación celular y la supervivencia en enteroides. Los científicos pueden aplicar esta técnica a los enteroides de cultivo y para estudiar el efecto de los medicamentos y las citoquinas inflamatorias en las células epiteliales intestinales in vitro. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de agua de la enfermedad inflamatoria intestinal.Aplicamos este método para encontrar algunas citoquinas terapéuticas. Este método proporciona información sobre la proliferación epitelial intestinal y la supervivencia;además también se puede utilizar en organoides, cultivados alrededor de tejidos distintos del intestino. Para aislar criptas intestinales y realizar cultivos enteroides, utilice fórceps tisulares y encuentre tijeras de iris para diseccionar aproximadamente ocho centímetros de íleon de un ratón de tipo salvaje eutanizado de ocho semanas de edad.Utilice una jeringa con una aguja de alimentación de gavage para lavar el íleon con unos 40 mililitros de hielo frío Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, luego corte longitudinalmente con tijeras y abra el íleon. Corte el íleon en trozos pequeños y colóquelos en cinco mililitros de DPBS estériles helados en un tubo cónico de 15 mililitros. Luego mece la muestra durante cinco minutos sobre hielo.Utilice un controlador de pipeta para aspirar el DPBS y reemplazarlo con 10 mililitros de tampón frío uno. Después de balancear durante 30 minutos sobre hielo, utilice el controlador de pipeta para aspirar el buffer uno y reemplazarlo con 10 mililitros de tampón frío dos. A continuación, agitar durante dos o tres minutos a mano a aproximadamente 80 batidos por minuto.Después de agitar, inspeccione una gota de veinte micro litros de buffer dos contenidos bajo un microscopio para asegurarse de que hay criptas con células Paneth granulares. Filtre el búfer dos contenidos con un colador celular estéril de 70 micras y recoja el búfer filtrado en un tubo cónico de 50 mililitros. Pipetear 20 microlitros de filtrado en la diapositiva para contar las criptas.Transfiera un volumen suficiente del búfer filtrado dos contenidos para asegurarse de que hay aproximadamente 500 criptas por pozo. Gire a 150 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y luego aspire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las criptas en 50 microlitros de matriz de membrana sótano por 500 criptas.Pipetear hacia arriba y hacia abajo teniendo cuidado de evitar burbujas. Coloque una gota de 50 microlitros de matriz de membrana de sótano y mezcla de cripta en el centro de un pozo de una placa de 24 pozos. Incubar durante 30 minutos a 37 grados Celsius para polimerizar la matriz de membrana del sótano.Después de 30 minutos de polimerización, agregue cuidadosamente 600 microlitros de medios minigut a cada pozo. Devuelva la placa a la incubadora de 37 grados Celsius, y observe bajo un microscopio cada día, cambiando los medios cada dos o tres días. Para pasar los enteroides, coloque la placa de cultivo de tejido sobre hielo, aspire los medios y agregue un mililitro de DPBS frío a cada pozo.Utilice una punta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos de matriz. Pase la muestra a través de una jeringa de insulina de un mililitro y hacia abajo en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de girar hacia abajo durante cinco minutos a 150 veces G y cuatro grados Celsius, utilice una pipeta para quitar el DPBS.Vuelva a suspender los enteroides en 50 microlitros de matriz de membrana sótano por pozo. Coloque la placa en la incubadora de 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir que la matriz de membrana del sótano se polimerice. A continuación, superponga cada pozo con 600 microlitros de medios ENR y devuelva la placa a la incubadora.Cultivar enteroides durante cinco a siete días antes de pasarlos en una nueva placa de 24 pozos usando una relación de división de uno a dos. Añadir 600 microlitros de medio ENR a cada pozo, y luego incubar los enteroides durante cuatro a cinco días en la incubadora de 37 grados Celsius. Configurar el grupo de control de enteroides no tratados y el grupo experimental de enteroides tratados con cinco nanogramos por mililitro de interleucina-22.Prepare al menos tres réplicas para cada grupo. Añadir 600 microlitros de medio EdU a cada pozo de enteroides, excepto uno bien para usar como control negativo para la resta de fondo. Incubar la placa durante dos horas en una incubadora de 37 grados centígrados.Para cosechar enteroides de la matriz de membrana del sótano, utilice un controlador de pipeta para aspirar el medio EdU y lavar una vez con DPBS. A continuación, agregue un mililitro de DPBS. Utilice una punta de pipeta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que no queden trozos sólidos de matriz de membrana de sótano.Transfiera la muestra a un tubo de 15 mililitros y gire hacia abajo a 300 veces G durante cinco minutos antes de desechar el sobrenadante. Añadir 500 microlitros de enzimas de disociación celular e incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, utilice una punta de pipeta P200 para pipetear hacia arriba y hacia abajo y descomponer enteroides en células individuales.A continuación, añada tres mililitros del medio de águila modificada de Dulbecco que contenga un suero bovino 10% fetal, y pipetear repetidamente con una punta de pipeta P1000. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, y aspirar el sobrenadante, suspendemos las células en un mililitro de DPBS. Para realizar la fijación y permeabilización de las células, primero transfiera la suspensión celular a un tubo de un punto y cinco mililitros, gire hacia abajo a 300 veces G durante cinco minutos y deseche el sobrenadante.Suspendemos las células en un mililitro de 4%paraformaldehído y arreglamos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante con una punta de pipeta. Lave las células una vez con el DPBS, y gire hacia abajo de nuevo para quitar el sobrenadante.Resuspender las células con un mililitro de 0.5%surfactante no iónico, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de lavar las células con DPBS como antes. Para detectar el EdU, añada 100 microlitros de cóctel de reacción a cada tubo de 1,5 mililitros. Resuspender las células, y protegerlas de la luz, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos, aspirar suavemente la solución de reacción con una punta de pipeta Añadir 0.5% tensioactivo no iónico penetrante a cada tubo para lavar una vez a temperatura ambiente. Después de la centrifugación como antes, suspendemos las células en un mililitro de DPBS. Filtrar las células resuspendidas con un colador de 40 micras y recoger las células filtradas en un tubo cónico de 15 mililitros.Realice los hechos sobre la detección de la máquina tan pronto como sea posible. Seleccione el canal y la tensión adecuados para el análisis de citometría de flujo. Para la estrategia de medición, dibuje una gráfica pseudocolor FSC-A frente a SSC-A y distribuya la mayoría de las celdas al rango visible del mapa de puntos ajustando el voltaje.Seleccione la población de celdas como R1 y excluya los restos de celda en la esquina inferior izquierda. A partir de la población celular R1, establezca una gráfica pseudocolor FSC-A versus FSC-H. Establezca la puerta para seleccionar celdas individuales designadas como R2 y excluir grumos de celda.Desde la población de células R2, establezca la intensidad de fluorescencia frente a la gráfica de número de celda y utilice el control negativo para establecer la puerta. La región de la señal fluorescente es una región celular positiva designada R3.Compare la relación de estas células positivas EdU entre los grupos experimentales y de control. Pequeñas criptas intestinales fueron aisladas y cultivadas como enteroides en la matriz de membrana del sótano.Los enteroides comenzaron a formar brotes dos días después del aislamiento. En el sexto día, los enteroides tenían muchos cogollos con muchos escombros en el lumen. Los enteroides estaban listos para ser pasados en esta etapa.Los enteroides fueron tratados con IL-22 durante 3 días, después de lo cual el ADN sintético fue etiquetado con EdU en rojo para indicar la proliferación celular. Los enteroides tratados IL-22 mostraron un mayor número de células positivas de EdU. IL-22 aumentó las células proliferantes del 40,1% al 83,5% según lo analizado por la citometría de flujo.El tratamiento con IL-22 también aumentó la muerte celular en enteroides indicados por la tinción de yoduro propidium en rojo. IL-22 aumentó las células muertas del 4,9% al 16,2% según lo analizado por la citometría de flujo. Durante el progreso de aislamiento de la cripta se necesita un temblor justo después de agregar búfer para asegurarse de que se sacuden suficientes criptas.Aconsejamos inspeccionar el contenido bajo microscopio. Después de este procedimiento, también podemos cuantificar los tipos de epiteliales y enteroides diferenciados mediante el uso específico Este método ayudará a los investigadores a investigar la diferenciación epitelial intestinal en enteroides. Después de su desarrollo, esta pregunta allana un camino para que los investigadores en el campo de la gastroenterología exploren las cuestiones de desarrollo o patológicas en el corte.

Research

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Biology

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Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

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A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...