Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لبحوث طب الأسنان والجمجمة (R01DE022988) ومعهد يونيس كينيدي شريفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (P01HD078233). ويشكر المؤلفون المستودع الحيوي والامراض الاساسيه للوصول إلى منصة لأيكا LMD 6500 في مدرسه Icahn للطب في جبل سيناء.

وتم الحصول علي الانسجه من الفئران وفقا لدليل المعاهد الصحية الوطنية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية ، وتمت الموافقة علي بروتوكولات الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام في كليه الطب في إياهن في جبل سيناء.
1. اعداد العينات المجمدة الطازجة
<ol><li>تشر...

يتيح LCM عزل الخلايا المخصبة أو متجانسة من الانسجه غير المتجانسة. وتشمل مزاياه القبض السريع والدقيق للخلايا في سياقها المجري ، في حين ان المساوئ المحتملة تشمل ان تكون مضيعه للوقت ، ومكلفه ، ومحدوده بالحاجة إلى ان يتعرف المستخدم علي السكان الفرعيين المتميزين ضمن عينه محدده30</s...

الجهاز العضلي الهيكلي هو نظام متعدد المكونات يتكون من العضلات, النسيج الضام, وتر, الرباط, الغضروف, والعظام, العصبية من الأعصاب والاوعيه الدموية بواسطة أوعيه دموية1. تتطور انسجه الهيكل العظمي مع زيادة التغاير الخلوي والتعقيد الهيكلي. الغضروف والعظام تتطور من نفس النسب أوستيوتشوندروبروجينيتور وذات الصلة للغاية. الغضروف الجنيني والعظام تتطور بالتعاون مع العضلات والأعصاب والاوعيه الدموية ، وغير متمايزة مسسبي. ويمكن أيضا ان يكون الغضروف محاطا بالعظم ، مثل غضروف ميكيل والغضروف المخروطي داخل عظم الفك. هذه الانسجه هي المرتبطة تشريحيا وتتفاعل مع بعضها البعض من خلال إشارات خارج الخلية اثناء التنمية. في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضروف والعظام ، عقبه واحده هي تغاير الهياكل الهيكلية التي تتالف من أنواع متعددة من الانسجه. العزل الدقيق للانسجه المحددة ذات الاهتمام هو المفتاح للتحليل الناجح للتحويل.
التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا أو مناطق الاهتمام داخل الانسجه غير المتجانسة ، وهي قابله للتكرار وحساسة لمستوي الخلية الواحدة2. يمكن ان تستهدف بدقه والتقاط الخلايا من الفائدة لمجموعه واسعه من الاختبارات المصب في النسخ ، والجينوم ، وبروبروتيميكس3،4. ويمكن تقييم نوعيه الحمض النووي الريبي المعزول أو الدنا أو البروتين باستخدام محلل حيوي أو منصة مكافئه. مثلا, [رنا] أشرت نوعيه ب ال [رنا] نزاهة رقم ([رين])5.
هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتلطيخ السريع والعزلة من الغضروف والعظام من قبل LCM من الانسجه المجمدة الطازجة. نحن نستخدم الجنين الفار لإثبات ان هذا البروتوكول غله عاليه الجودة الجيش النيبالي الممتاز للتحليل اللاحقة الناسخ ، مثل التسلسل RNA (RNA-seq).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا المحددة أو المناطق ذات الاهتمام من الانسجه غير المتجانسة. التعقيد الخلوي والجزيئي للعناصر الهيكل العظمي يزيد مع التنمية. تغاير الانسجه ، مثل في واجهه العناصر الغضروفية والعظمية مع بعضها البعض أو مع الانسجه المحيطة بها ، هو عقبه واحده لدراسة تطوير الغضروف والعظام. بروتوكولنا يوفر طريقه سريعة لمعالجه الانسجه وعزل الغضروف والعظام التي تعطي الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة لتحليل التعبير الجيني. يتم تقسيم الانسجه المجمدة الطازجة من الاجنه الماوس ويتم استخدام قصيرة البنفسجية التلون الأرجواني لتصور الغضروف والعظم مع ألوان المتميزة من الانسجه المحيطة بها. ثم يتم تجفيف الشرائح بسرعة ، ويتم عزل الغضروف والعظم في وقت لاحق من قبل LCM. التقليل من التعرض للحلول المائية اثناء هذه العملية يحافظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي. تم جمع بنجاح الغضروف الماوس Meckel وعظم فك في E 16.5 وتحليل التعبير الجيني أظهرت التعبير التفاضلي من الجينات علامة لعظم ، والخلايا العظمية ، والعظم ، والغضروفي. كما تم عزل الحمض الريبي عالي الجودة من مجموعه من الانسجه والاعمار الجنينية. هذا البروتوكول تفاصيل اعداد العينة ل LCM بما في ذلك كريومبيدينج ، التقطيع ، تلطيخ وتجفيف الانسجه المجمدة الطازجة ، وعزل دقيق من الغضروف والعظم من قبل LCM مما ادي إلى الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.

وقد استخدمت المقاطع الاكليليه من انسجه الفئران المجمدة الطازجة في البريد 16.5 لإظهار العزلة وجمع الغضروف meckel (MC) ، والغضروف فيزيولوجي ، وعظم فك من قبل lcm. تم تشريح أجنه الفئران في البريد 16.5 وجزءا لا يتجزا في قوالب المبردة مع مجمع أكتوبر. وجمدت العينات في قوالب بسرعة في الجليد الجاف وحمام ميثي?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

يصف هذا البروتوكول التشريح المجهري للتقاط الليزر لعزل الغضروف والعظم من الأجزاء المجمدة الطازجة من جنين الفاره. الغضروف والعظم يمكن تصورها بسرعة بواسطة تلطيخ البنفسج كريريل وجمعت علي وجه التحديد لإنتاج الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.

الليزر التقاط ميكروتشريح الغضروف الجنيني الماوس والعظام لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

عدم تجانس الهياكل العظمية هو عقبة واحدة في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضاريف والعظام. يوفر هذا البروتوكول طريقة للعزل الدقيق للأنسجة المجاورة ولكن مختلفة. نحن تحسين التقاط الليزر microdissection للغضاريف والعظام باستخدام البقع البنفسجية كريسيل لتصور هذه الأنسجة لجمع دقيق من خلال الحفاظ على سلامة RNA عالية للتحليل اللاحق.يمكن عزل الأنسجة الأخرى إذا توفر بنفسجي الكريسيل تمييزًا كافيًا للأنسجة المستهدفة وتظل جودة الحمض النووي الريبي عالية بعد طريقة المعالجة لدينا. وتشمل هذه الأنسجة الغرز القحفية و الدماغ. التكرير هو المهارة الأكثر تطلبا في هذا البروتوكول.تأكد من أن الأنسجة هي تشريح وجزءا لا يتجزأ بسرعة للحفاظ على أعلى سلامة من الجيش الملكي النيبالي. لبدء هذا الإجراء، تشريح الجنين أو الأنسجة ذات الاهتمام. تضمين العينة في قالب التضمين المتاح مع مركب درجة حرارة القطع الأمثل ، وضبط اتجاه العينة مع طرف أو إبرة.تجميد العينات بسرعة في الجليد الجاف و الميثيل-2-حمام بوتين. المقبل، وإعداد حاوية مغطّى مع الثلج الجاف عن طريق وضع ورقة من رقائق الألومنيوم على الجليد الجاف لتخزين مؤقت من الشرائح عينة تشريح أثناء التبريد. نقل العينة المجمدة الطازجة في دلو من الجليد الجاف.ضع طبقة من مركبات درجة حرارة القطع المثلى على حامل عينة التبريد، وعلى الفور ضع العينة فوق مركب درجة حرارة القطع الأمثل مع ضغط لطيف. عندما يتم تجميد مجمع درجة حرارة القطع الأمثل تماما، وربط حامل مع العينة في ذراع قطع التبريد. اترك العينة في التبريد لمدة 15 دقيقة لتكريرها إلى درجة حرارة القطع.ثم، قسم الأنسجة بسمك 12 ميكرومتر وجمع الشرائح على الشرائح غشاء القلم. محاذاة أقسام متتالية على الغشاء. بمجرد اكتمال الشريحة، والسماح المقاطع لتجف لبضع دقائق، ومن ثم نقل الشريحة على احباط في حاوية الجليد الجاف حتى يتم جمع جميع الشرائح المطلوبة.تخزين الشرائح في ناقص 80 درجة مئوية في مربع شريحة. للبدء، إعداد ثلاثة أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 ملليلتر المسمى. إضافة 45 ملليلتر من 80٪ الإيثانول إلى كل أنبوب.ضع ثلاثة أنابيب على الجليد. وضع أنبوب يحتوي على 45 ملليلتر من 95٪ الإيثانول وأنبوب يحتوي على 100٪ الإيثانول على الجليد. بعد ذلك، أضف 45 ملليلتر من الزيلين إلى أنبوب طرد مركزي 50 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة.ذوبان شريحة غشاء القلم لفترة وجيزة عن طريق وضعه ضد اليد قفاز، وغسلها مرتين لمدة 30 ثانية في كل من الأنابيب التي تحتوي على 80٪ الإيثانول مع التحريض لإزالة مركب درجة حرارة القطع الأمثل. ثم، وضع الشريحة على ورقة من رقائق الألومنيوم. Pipette 8 ملليلتر من 1٪ من البنفسجي الكريسيل و 50٪ الإيثانول على الشريحة وصمة عار لمدة 30 ثانية.غسل الشريحة في أنبوب الثالث يحتوي على 80٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. قم بتجفيف الشريحة عن طريق تمريرها عبر الأنبوب الذي يحتوي على 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية، الأنبوب الذي يحتوي على 100٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية، وأخيراً الأنبوب الذي يحتوي على الزيلين لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، ضع الشرائح على ممسحة مهمة حساسة لمدة خمس دقائق للسماح للزيلين استنزاف والسماح للشرائح لتجف.أولا ، تشغيل مجهر التقاط الليزر microdissection ، الليزر ، والكمبيوتر. قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر وبدء تشغيل البرنامج. عندما يكون الضوء الأخضر على، اضغط على الزر الأحمر لتنشيط الليزر.عندما يتحول الضوء إلى اللون الأحمر، يكون الليزر جاهزًا للاستخدام. أدخل غطاء أنبوب PCR 5 ملليلتر في الجامع. Pipette 50 ميكرولترات من التخزين المؤقت استخراج في الغطاء وإدراج جهاز جمع في المجهر.في إطار جهاز جامع التغيير، انقر على زر الانتقال إلى نقطة مرجعية لنقل جامع إلى نقطة مرجعية. اضبط التركيز لعرض النقطة المرجعية بوضوح. بعد ذلك، انقر فوق الزر إلغاء تحميل اليسار في شريط الأدوات لخفض حامل الشريحة.ضع الشريحة في الحامل مع قسم الأنسجة التي تواجه لأسفل، وأدخل حامل مرة أخرى في المرحلة. انقر فوق متابعة في نافذة عينة التغيير. لإعداد معلمات الليزر، حدد خيار التحكم في قائمة الليزر أو انقر على أيقونة الليزر.ضبط المعلمات التالية حسب الرغبة، والسلطة، والتي هي قوة الليزر، والفتحة، وهو عرض الليزر، والسرعة، والتي هي سرعة القطع في وضع التعادل وقطع. ابدأ بهدف 5X للعثور على مجالات الاهتمام ، والتحول إلى الهدف الذي يظهر أفضل مجال الاهتمام. اختيار أنبوب لجمع عن طريق النقر على علامة في جامع، ثم اختيار نقل وقطع أو رسم وقطع.بمجرد الانتهاء من القطع ، فإن الأنسجة المستهدفة مع غشاء PEN تقع في غطاء أنبوب جمع الجاذبية. كرر عملية الاختيار والقطع هذه لسحب مجالات متعددة من الاهتمام إذا لزم الأمر. بعد ذلك، قم بتفريغ جامع وإغلاق أنبوب PCR بعناية.ضع الأنسجة المُتَنَكَة على الجليد الجاف. ذوبان الأنسجة microdissected في درجة حرارة الغرفة، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة، واحتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تدور العازلة تحلل أسفل إلى أنبوب PCR 5 ملليلتر.تنفيذ العلاج DNase واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام RNA عزل عدة، اتباع تعليمات الشركة المصنعة. في هذه الدراسة، يتم تنفيذ التقاط الليزر الأمثل microdissection من الغضاريف والعظام، وتسليط الضوء على استخدام التلطيخ البنفسجي cresyl في إجراء سريع لتصور الغضروف والعظام لجمع الأنسجة الدقيقة مع الحفاظ على سلامة عالية RNA للتحليل اللاحق. تظهر ملاحظة الشرائح أن جميع الغضاريف التي تم فحصها هي أرجواني ملطخة ، وجميع الأنسجة المعدنية ملطخة باللون البني أو الأسود.يتم تمييز كل من الغضاريف والعظام بسهولة عن الأنسجة الأخرى في مواقع تشريحية متعددة. يتم اختيار الغضاريف في ميكل، والغضاريف المخروطية، ومناطق العظام المانائية وعزلها عن طريق التقاط الليزر المجهري. للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي لتسلسل, سحب 10 مناطق من الغضروف ميكيل, 10 مناطق من الغضروف المتدلل, أو أربع مناطق من عظم المنبع في ثلاثة أنابيب جمع الفردية على التوالي.ثم يتم استخراج RNA، ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام التحليل الحيوي. ويستخدم هذا القبض على الليزر microdissection بروتوكول على أنسجة مختلفة في مراحل مختلفة من النمو، وقياسات رقم نزاهة RNA تشير إلى جودة عالية RNA. ثم يتم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي.هناك 4, 006 جينات بشكل ملحوظ ومختلفة أعرب عن بين عظم المنادل والغضاريف ميكيل. الجينات المحددة لعظمات العظام أو الخلايا العظمية هي أكثر تعبيراً عن ذلك في العظام المانبة في حين أن الجينات المحددة في الزخرون هي أكثر تعبيراً في غضروف ميكل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن علامات هشاشة العظام بشكل كبير في العظام المانوية ، مما يشير إلى عزل ناجح للأنسجة المستهدفة.وبعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل التعبير الجيني، بما في ذلك qPCR و RNA-seq. ويمكن لهذه الطرق تحليل التعبير الجيني لـ transcriptome في أنسجة أو مناطق معينة ذات أهمية داخل الأنسجة غير المتجانسة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

الأرقاء أعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية عن طريق التعبير القسري من عوامل النسخ

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...