Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

这项工作得到了国家牙科和颅面研究所（R01DE022988）和尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国家儿童健康和人类发展研究所（P01HD078233）的支持。作者感谢生物储存库和病理学核心访问西奈山伊坎医学院的Leica LMD 6500平台。

根据国家卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》，从小鼠身上获得组织，研究规程由西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会批准。
1. 新鲜冷冻标本的制备
<ol><li>解剖感兴趣的胚胎或组织。将样品嵌入具有最佳切削温度 （OCT） 化合物的一次性嵌入模具中。用尖或针调整试样的方向。</li>
	<li>在干冰/甲基-2-丁烷浴中快速冷冻样品。继续执行下一步或储存在 -80 °C。<b...

LCM能够从异质组织分离富集或均质细胞群。其优点包括快速、精确地捕获体内环境中的细胞，而潜在的缺点包括耗时、昂贵，且受限于用户在指定样本30中识别不同亚群的需求。该协议提供了小鼠胚胎软骨和骨骼的LCM细节，重点介绍了在快速过程中使用克西尔紫染色来可视化软骨和骨骼，从而精确收集组织，同时保持高RNA完整性，以便RNA-seq进行后续分析。该协议的一个限?...

肌肉骨骼系统是由肌肉、结缔组织、肌腱、韧带、软骨和骨骼组成的多组分系统，由神经内膜连接，血管血管1。骨骼组织随着细胞异质性和结构复杂性的增加而发展。软骨和骨骼从相同的骨质滴激素系发展，并且高度相关。胚胎软骨和骨骼与肌肉、神经、血管和未分化的肌体结合发展。软骨也可能被骨头包围，如梅克尔的软骨和软骨在软骨内。这些组织在发育过程中通过细胞外信号在解剖学上关联并相互作用。在软骨和骨骼发育中的基因表达研究中，一个障碍是由多种组织类型组成的骨骼结构的异质性。精确分离感兴趣的特定组织是成功转录分析的关键。
激光捕获微分体（LCM）是一种强大的工具，用于分离异质组织内的细胞类型或感兴趣的区域，并且可重现，对单细胞级别2敏感。它可以精确定位和捕获感兴趣的细胞，用于转录组学、基因组学和蛋白质组学3、4中广泛的下游测定。分离的RNA、DNA或蛋白质的质量可以通过生物分析仪或等效平台进行评估。例如，RNA质量由RNA完整性数（RIN）5表示。
在这里，我们提供一个方案，通过LCM从新鲜冷冻组织中快速染色和分离软骨和骨骼。我们使用小鼠胚胎来证明该协议产生高质量的RNA，用于后续转录组分析，如RNA测序（RNA-seq）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

激光捕获微分体（LCM）是一种强大的工具，用于从异构组织分离特定的细胞类型或感兴趣的区域。骨骼元素的细胞和分子复杂性随着发育的增加而增加。组织异质性，如软骨和骨质元素彼此或周围组织界面，是研究软骨和骨骼发育的一个障碍。我们的协议提供了一种快速的组织处理和软骨和骨分离方法，为基因表达分析产生高质量的RNA。小鼠胚胎的新鲜冷冻组织被分割，并用于用不同于周围组织的颜色来可视化软骨和骨骼的短暂克西尔紫染色。然后，幻灯片迅速脱水，软骨和骨骼随后被 LCM 分离。在此过程中，尽量减少接触水溶液，保持RNA的完整性。成功采集了小鼠Meckel在E16.5处的软骨和软骨骨，基因表达分析显示成骨细胞、成骨细胞、成骨细胞和软骨细胞的标记基因表达不同。高质量的RNA也从一系列组织和胚胎年龄中分离出来。该协议详细说明了LCM的样品制备，包括冷冻、切片、染色和脱水新鲜冷冻组织，以及LCM对软骨和骨骼的精确分离，从而产生用于转录组分析的高质量RNA。

E16.5 处新鲜冷冻小鼠组织的冠状部分用于演示 LCM 分离和收集梅克尔软骨 （MC）、软骨软骨和软骨。E16.5的小鼠胚胎被解剖，并嵌入与OCT化合物的低温模具。模具中的样品被迅速冷冻在干冰和甲基-2丁烷浴中，并储存在-80°C。
为了证明软骨和骨骼的紫紫色染色，在日冕平面上进行了冷冻切片，并在显微镜幻灯片上采集了样本。按照上述协议（步骤 3.2_3.4）对部分进行洗涤、染色...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

该协议描述了激光捕获微解剖，用于从小鼠胚胎的新鲜冷冻部分分离软骨和骨骼。软骨和骨骼可以通过紫罗兰染色快速可视化，并精确收集，产生高质量的RNA进行转录分析。

用于基因表达分析的小鼠胚胎软骨和骨骼的激光捕获微分

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

骨骼结构的异质性是研究软骨和骨骼发育中基因表达的一个障碍。该协议提供了一种精确隔离相邻但不同组织的方法。我们利用紫红色染色优化软骨和骨骼的激光捕获微切除，通过保持高RNA完整性进行后续分析，使这些组织可视化，进行精确采集。如果紫光对目标组织提供充分的区别，并且我们的处理方法后RNA质量仍然很高，则其他组织可以分离。这些组织包括颅面缝合线和大脑。冷冻是此协议中最苛刻的技能。确保组织被快速解剖和嵌入，以保持RNA的最高完整性。要开始这个程序，解剖感兴趣的胚胎或组织。将样品嵌入一次性嵌入模具中，使用最佳切削温度化合物，用尖端或针头调整试样的方向。在干冰和甲基-2-苯浴中快速冷冻样品。接下来，在干冰上放置一片铝箔，以制备带干冰的带盖的容器，在冷冻过程中临时存放解剖样品滑梯。将新鲜冷冻试样转移到干冰桶中。将一层最佳切削温度化合物放在低温热试样支架上，并立即将试样放在具有温和压力的最佳切削温度化合物的顶部。当最佳切削温度化合物完全冻结时，将带试样的支架固定到低温恒温切割臂中。将样品留在低温恒温器中 15 分钟，以与切割温度平衡。然后，将组织切成12微米的厚度，并在笔膜幻灯片上收集切片。对齐膜上的连续部分。幻灯片完成后，让部分干燥几分钟，然后将幻灯片转移到干冰容器中的铝箔上，直到收集所有所需的幻灯片。将幻灯片存放在零下 80 摄氏度的幻灯片盒中。首先，准备三个标有15毫升的离心管。在每个管中加入45毫升80%乙醇。把三根管子放在冰上。将含有 45 毫升 95% 乙醇的管子和含有 100% 乙醇的管子放在冰上。接下来，在室温下将45毫升二甲苯加入50毫升离心管。将 PEN 膜滑过一个带手套的手，将 PEN 膜短暂解冻，并在每个含有 80% 乙醇的管子中清洗两次 30 秒，并搅拌以去除最佳切割温度化合物。然后，将幻灯片放在铝箔片上。8毫升1%的紫光和50%乙醇的移液器在幻灯片上染色30秒。将含有 80% 乙醇的第三管中的幻灯片清洗 30 秒。通过含有95%乙醇的管子脱水30秒，含有100%乙醇的管子30秒，最后，含有二甲苯的管子30秒。在此之后，将幻灯片放在一个精致的任务雨刷器上五分钟，让二甲苯排出，让部分干燥。首先，打开激光捕获显微扫描显微镜、激光和计算机。登录到计算机并启动软件。当绿灯亮时，按红色按钮激活激光。当指示灯变红时，激光即可使用。将 5 毫升 PCR 管的盖子插入收集器中。将 50 微升的抽液缓冲器放入盖中，并将收集装置插入显微镜中。在更改收集器设备窗口中，单击移动到参考点按钮将收集器移动到参考点。调整焦点以清晰查看参考点。接下来，单击工具栏中的左侧卸载按钮以降低幻灯片架。将幻灯片放入支架中，组织部分朝下，然后将支架插入舞台。单击"更改试样"窗口中的"继续"。要设置激光参数，请选择激光菜单的控制选项或单击激光图标。根据需要调整以下参数，功率，即激光的功率，光圈，即激光的宽度，速度，这是绘制和切割模式下的切割速度。从 5 倍目标开始查找感兴趣的区域，然后切换到最好显示感兴趣区域的目标。通过单击收集器上的标记选择收集管，然后选择移动和剪切或绘制和切割。一旦切割完成，带 PEN 膜的目标组织将按重力落入收集管的盖子。重复此选择和切割过程，以根据需要拉取多个感兴趣区域。在此之后，卸载收集器并小心地关闭 PCR 管。将微脱湿组织放在干冰上。在室温下解冻微分离组织，然后短暂离心，在42摄氏度下孵育样品30分钟。在此之后，将裂解缓冲液向下旋转到 5 毫升 PCR 管中。按照制造商的说明，使用RNA隔离试剂盒进行DNase处理和RNA提取。在这项研究中，对软骨和骨骼进行了优化的激光捕获微分，突出了在快速程序中使用克西紫罗兰染色，以可视化软骨和骨骼进行精确组织采集，同时保持高RNA完整性，以便随后进行分析。观察幻灯片表明，所有检查的软骨都是染色品红色，所有矿化组织都是彩色或黑色。软骨和骨骼很容易与其他组织在多个解剖位点区分。梅克尔的软骨、圆骨软骨和毛骨区通过激光采集微切除来选择和分离。为了获得足够的RNA进行测序，将梅克尔软骨的10个区域、10个圆膜软骨区域或4个毛骨区域分别拉入3个单独收集管中。然后提取RNA，并使用生物分析器分析总RNA。这种激光捕获微切除方案用于不同发育阶段的各种组织，RNA完整性数测量表明RNA质量很高。然后进行差分基因表达分析。有4006个基因明显和不同表达之间的骨质和梅克尔的软骨。雌细胞或骨细胞特异性基因在骨质骨中表达得更强烈，而软骨细胞特异性基因在梅克尔的软骨中表达得更强烈。此外，骨质标记在骨质骨中表达得更强烈，表明目标组织成功分离。按照这个程序，可以进行基因表达分析，包括qPCR和RNA-seq。这些方法可以分析转录组在异质组织中特定组织或感兴趣区域的基因表达。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

小鼠胚胎植耳蜗的文化和基因转移通过电穿孔

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

科研

发育生物学

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

在胚胎小鼠心脏采用免疫荧光心肌发展分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

通过在胚胎梅克尔软骨Zebrabow克隆细胞分析软骨插层和定向扩散的可视化

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

从详细的空间表达图谱的动态表达数据的时间排序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

胚胎血管生成的可视化和定量分析<em&gt;热带非洲爪蟾</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

小鼠胚胎肾的解剖与培养

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

通过检测全小鼠胚胎β乳糖酶活性追踪基因表达

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

小鼠颅面组织和未切除骨骼的组织制备及免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

小鼠皮肤角质细胞的分离和染色,用于细胞周期特定分析细胞蛋白表达的量度细胞测定

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

通过转录因子的强制表达，人类纤维细胞的造血再编程

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...