Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institute of Dental and craniofacial Research (R01DE022988) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og Human Development (P01HD078233). Forfatterne takker Biorepositoriet og patologi kerne for adgang til Leica LMD 6500-platformen på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.

Væv fra mus blev opnået i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr, og studie protokoller blev godkendt af den institutionelle dyrepleje og brug udvalg på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. tilberedning af frisk frosset prøve
<ol><li>Dissekere embryo eller væv af interesse. Integrer prøven i en engangs indlejring skimmel med optimal skære temperatur (OCT) sammensatte. Justér objekternes retning med et tip eller en nål.</li>
...

LCM gør det muligt at isolere beriget eller homogen cellepopulationer fra heterogene væv. Dens fordele omfatter hurtig og præcis opsamling af celler i deres in vivo kontekst, mens potentielle ulemper omfatter det at være tidskrævende, dyrt, og begrænset af behovet for brugeren at genkende særskilte delpopulationer inden for en bestemt prøve30. Denne protokol indeholder oplysninger om LCM af mus embryonale brusk og knogler, fremhæver brugen af cresylacetat violet farvning i en hur...

Bevægeapparatet er et multikomponentsystem bestående af muskler, bindevæv, sener, ligament, brusk, og knogle, innerveret af nerver og vaskulariseret af blodkarrene1. Skelet vævet udvikler sig med stigende cellulær heterogenitet og strukturel kompleksitet. Brusk og knogle udvikle sig fra den samme osteochondroprogenitorafstamning og er meget beslægtede. Embryonale brusk og knogler udvikler sig i forbindelse med muskler, nerver, blodkar, og udifferentieret mesenchyme. Brusk kan også være omgivet af knogler, såsom Meckels brusk og kondylar brusk i mandibulær knogle. Disse væv er anatomisk forbundet og interagere med hinanden gennem ekstracellulære signaler under udvikling. I studiet af genekspression i udviklingen af brusk og knogler er en forhindring den heterogenitet af skeletstrukturer, der består af flere vævstyper. Præcis isolering af det specifikke væv af interesse er nøglen til en vellykket transkriptional analyse.
Laser opsamling microdissection (LCM) er et kraftfuldt værktøj til at isolere celletyper eller regioner af interesse inden for heterogene væv, og er reproducerbar og er følsom over for enkelt celleniveau2. Det kan præcist målrette og fange celler af interesse for en bred vifte af downstream-analyser i transkriptomics, Genomics, og proteomics3,4. Kvaliteten af det isolerede RNA, DNA eller protein kan vurderes med en bioanalysator eller en tilsvarende platform. For eksempel er RNA-kvalitet indikeret med RNA-integritets nummeret (RIN)5.
Her giver vi en protokol til hurtig farvning og isolering af brusk og knogler af LCM fra fersk frosset væv. Vi bruger musen embryo til at påvise, at denne protokol giver høj kvalitet RNA til efterfølgende transcriptomic analyse, såsom RNA sekventering (RNA-SEQ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Laser opsamling microdissection (LCM) er et kraftfuldt værktøj til at isolere specifikke celletyper eller regioner af interesse fra heterogene væv. Den cellulære og molekylære kompleksitet af skelet elementer stiger med udvikling. Vævs heterogenitet, såsom ved grænsefladen af brusk og osseøse elementer med hinanden eller med omgivende væv, er en hindring for studiet af at udvikle brusk og knogler. Vores protokol indeholder en hurtig metode til vævs behandling og isolering af brusk og knogler, der giver høj kvalitet RNA for genekspressions analyse. Friske frosne væv af muse embryoner er sektioneret og korte cresylacetat violet farvning bruges til at visualisere brusk og knogler med farver adskiller sig fra omgivende væv. Glider derefter hurtigt dehydreret, og brusk og knogler er isoleret efterfølgende af LCM. Minimering af eksponering for vandige opløsninger under denne proces bevarer RNA-integriteten. Mus Meckels brusk og mandibulær knogle ved E 16.5 blev indsamlet med succes, og analyse af genekspression viste differens ekspression af markørgener for osteoblaster, osteocytter, osteoklaster og chondrocytter. Høj kvalitet RNA blev også isoleret fra en række væv og embryonale aldre. Denne protokol beskriver prøveforberedelse til LCM, herunder kryoindlejring, skæring, farvning og tørring af fersk frosset væv, og præcis isolering af brusk og knogler med LCM, hvilket resulterer i høj kvalitet RNA til transkriptomic analyse.

Coronal sektioner af fersk frosset mus væv på e 16.5 blev brugt til at påvise isolation og opsamling af Meckel brusk (MC), kondulær brusk, og mandibulær knogle af LCM. Mus embryoner på E 16.5 blev dissekeret og indlejret i kryogene forme med OCT sammensatte. Prøver i forme blev hurtigt frosset i en tøris og methyl-2-butan bad og opbevares ved-80 °C.
For at påvise cresylacetat violet farvning af brusk og knogler, blev cryosectioning i det koronale plan udført og prøver blev indsamle...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Denne protokol beskriver laser opsamling microdissection til isolering af brusk og knogler fra friske frosne sektioner af muse embryonet. Brusk og knogler kan hurtigt visualiseres ved cresylacetat violet farvning og indsamles netop for at give høj kvalitet RNA for transcriptomic analyse.

Laser opsamling Microdissection af mus embryonale brusk og knogle for genekspression analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Skeletstrukturernes heterogenitet er en hindring i at studere genekspressionen ved udvikling af brusk og knogler. Denne protokol giver en metode til præcis isolering af tilstødende, men forskellige væv. Vi optimerer laserfangstmikrodissektionen til brusk og knoglen ved hjælp af cresylviolet farvning for at visualisere disse væv for præcis indsamling ved at opretholde høj RNA-integritet til efterfølgende analyse.Andre væv kan isoleres, hvis cresylviole giver tilstrækkelig skelnen mellem målvæv og RNA-kvaliteten forbliver høj efter vores behandlingsmetode. Sådanne væv omfatter kraniofacial suturer og hjerne. Kryoektionering er den mest krævende færdighed i denne protokol.Sørg for, at vævet dissekeres og indlejres hurtigt for at opretholde RNA's højeste integritet. For at begynde denne procedure, dissekere embryo eller væv af interesse. Integrer prøven i en engangsindlejringsform med optimal skæretemperaturforbindelse, og juster prøvens retning med en spids eller nål.Hurtigt fryse prøverne i en tøris og methyl-2-butene bad. Dernæst forberede en låg beholder med tøris ved at placere et ark aluminiumsfolie på tøris til midlertidig opbevaring af dissektion prøve dias under kryosektion. Overfør den friske frosne prøve ind i tørisspanden.Placer et lag af optimal skæretemperatur forbindelse på en kryostat prøveholder, og straks placere prøven på toppen af den optimale skæretemperatur sammensatte med blidt tryk. Når den optimale skæretemperaturblanding er helt frosset, fastgøres holderen med prøven ind i kryostatskærearmen. Lad prøven i kryostaten være i 15 minutter for at bringe den i ligevægt til skæretemperaturen.Derefter afsnit vævet i en tykkelse på 12 mikrometer og indsamle skiver på PEN membran dias. Juster fortløbende sektioner på membranen. Når diaset er færdigt, skal du lade sektionerne tørre i et par minutter og derefter overføre diaset på folien i tørisbeholderen, indtil alle de ønskede dias er indsamlet.Opbevar diasene på minus 80 grader Celsius i en slideboks. Til at begynde, forberede tre mærket 15 milliliter centrifuge rør. Tilsæt 45 milliliter 80% ethanol til hvert rør.Placer tre rør på is. Et rør med 45 milliliter 95 % ethanol anbringes og et rør med 100 % ethanol på is. Dernæst tilsættes 45 milliliter xylen til et 50 milliliter centrifugerør ved stuetemperatur.Tø en PEN membran dias kort ved at placere den mod en behandsket hånd, og vask det to gange i 30 sekunder i hvert af de rør, der indeholder 80% ethanol med omrøring for at fjerne den optimale skæretemperatur sammensatte. Derefter lægge dias på et ark aluminiumsfolie. Pipette 8 milliliter 1% cresyl violet og 50% ethanol på dias og plet i 30 sekunder.Vask rutsjebanen i det tredje rør med 80% ethanol i 30 sekunder. Dehydrer diaset ved at passere det gennem røret, der indeholder 95% ethanol i 30 sekunder, røret indeholder 100% ethanol i 30 sekunder, og endelig, røret indeholder xylen i 30 sekunder. Derefter skal du placere objektglassene på en delikat opgavevisker i fem minutter for at lade xylen løbe af og lade sektionerne tørre.Først skal du tænde for laserfangstmikroskopet, laseren og computeren. Log på computeren, og start softwaren. Når det grønne lys er tændt, skal du trykke på den røde knap for at aktivere laseren.Når lyset bliver rødt, er laseren klar til brug. Sæt hætten på et 5 milliliter PCR-rør ind i opsamleren. Pipette 50 mikroliter af ekstraktionsbufferen i hætten og sætte opsamlingsenheden ind i mikroskopet.I vinduet til ændringsindsamlerens enhed skal du klikke på knappen Flyt til referencepunkt for at flytte opsamleren til referencepunktet. Juster fokus for tydeligt at få vist referencepunktet. Klik derefter på venstre fjernelsesknap på værktøjslinjen for at sænke slideholderen.Sæt rutsjebanen ind i holderen med vævssektionen nedad, og sæt holderen tilbage i scenen. Klik på fortsæt i vinduet til ændringsprøven. Hvis du vil konfigurere laserparametrene, skal du vælge kontrolindstillingen i lasermenuen eller klikke på laserikonet.Juster følgende parametre som ønsket, magt, som er kraften i laseren, blænde, som er bredden af laseren, og hastighed, som er skærehastigheden i draw og cut mode. Start med en 5X mål for at finde de områder af interesse, og skifte til det mål, der bedst viser det område af interesse. Vælg røret til indsamling ved at klikke på mærket på opsamleren, og vælg derefter flytte og klippe eller tegne og skære.Når snittet er afsluttet, vil målvævet med PEN-membranen falde ned i hætten af opsamlingsrøret ved tyngdekraften. Gentag denne udvælgelse og skæreproces for at trække flere områder af interesse, hvis det er nødvendigt. Derefter skal du losse opsamleren og forsigtigt lukke PCR-røret.Placer det mikroskræstede væv på tøris. Optø det mikroafskåret væv ved stuetemperatur, derefter centrifuge kort, og inkuber prøverne ved 42 grader Celsius i 30 minutter. Derefter drejes lysisbufferen ned i pcr-røret på 5 milliliter.Udfør DNase-behandling og RNA-ekstraktion ved hjælp af et RNA-isolationssæt, der følger producentens anvisninger. I denne undersøgelse udføres en optimeret laserfangstmikrodissektion af brusk og knogler, hvilket fremhæver brugen af cresyl violet farvning i en hurtig procedure for at visualisere brusk og knogler til præcis vævssamling og samtidig opretholde høj RNA-integritet til efterfølgende analyse. Observation af lysbilleder viser, at alle undersøgte brusk er farves magenta, og alle mineraliserede væv er farvet brun eller sort.Både brusk og knogler adskiller sig let fra andre væv på flere anatomiske steder. Meckel's Brusk, condylar brusk, og mandibulære knogleregioner er udvalgt og isoleret ved laser fange mikrodissektion. For at opnå tilstrækkelig RNA til sekventering trækkes 10 regioner af Mekkels brusk, 10 regioner med condylar brusk eller fire regioner med mandibulær knogle ind i henholdsvis tre individuelle opsamlingsrør.RNA udvindes derefter, og det samlede RNA analyseres ved hjælp af en bioanalyser. Denne laseropsamlingsmikrodissektionsprotokol bruges på forskellige væv på forskellige udviklingsstadier, og RNA-integritetsmålingerne indikerer høj RNA-kvalitet. Differential genekspressionsanalyse udføres derefter.Der er 4, 006 gener betydeligt og forskelligt udtrykt mellem mandibulære knogle og Meckel's Brusk. Gener, der er specifikke for osteoblaster eller osteocytter, udtrykkes mere højt i mandibulære knogler, mens chondrocytespecifikke gener udtrykkes mere højt i Meckels brusk. Desuden er osteoklastmarkører mere udtrykt i mandibulær knogle, hvilket indikerer vellykket isolering af målrettede væv.Efter denne procedure kan der udføres en genekspressionsanalyse, herunder qPCR og RNA-seq. Disse metoder kan analysere genekspression af transskriptomer i specifikke væv eller områder af interesse inden for heterogene væv.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Kultur af Embryonale Mouse Cochlear Eksplantater og Gene Transfer fra Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering af Chondrocyt Intercalation og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonale Meckel s Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal Bestilling af Dynamic Expression data fra Detaljeret Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissektion og kultur af mus embryonisk nyre

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vævs præparation og immun farvning af mus craniofacial væv og Undecalcificeret knogle

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolering og farvning af mus hud keratinocytter for celle cyklus specifik analyse af cellulært protein ekspression ved Massecytometri

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogen omprogrammering af humane fibroblaster ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...