Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) en het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). De auteurs danken de Biorepository en pathologie kern voor toegang tot het Leica LMD 6500 platform aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.

Weefsels van muizen werden verkregen in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, en studie protocollen werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité aan de Icahn school of Medicine op de berg Sinaï.
1. bereiding van vers bevroren specimen
<ol><li>Het embryo of het weefsel van belang ontleden. Sluit het monster in een wegwerp-insluitings mal met optimale snijtemperatuur (OCT) compound. Pas de ori...

LCM maakt de isolatie van verrijkte of homogene celpopulaties uit heterogene weefsels mogelijk. De voordelen omvatten snelle en nauwkeurige vangst van cellen in hun in vivo context, terwijl potentiële nadelen omvatten het is tijdrovend, duur, en beperkt door de noodzaak voor de gebruiker om verschillende subpopulaties binnen een gespecificeerd voorbeeld te herkennen30. Dit protocol bevat details van LCM van muis embryonaal kraakbeen en bot, waarbij het gebruik van Cresylacetaat Violet kl...

Het bewegingsapparaat is een multicomponentsysteem bestaande uit spier, bindweefsel, pees, ligament, kraakbeen, en bot, geïncubeerd door zenuwen en gevasculariseerde door bloedvaten1. De skelet weefsels ontwikkelen met toenemende cellulaire heterogeniteit en structurele complexiteit. Kraakbeen en bot ontwikkelen van dezelfde osteochondroprogenitor lineage en zijn sterk gerelateerd. Embryonaal kraakbeen en bot ontwikkelen in associatie met spieren, zenuwen, bloedvaten, en ongedifferentieerde Mesenchyme. Kraakbeen kan ook worden omgeven door bot, zoals het kraakbeen van Meckel en condylenbaan kraakbeen binnen het mandibulaire bot. Deze weefsels zijn anatomisch geassocieerd en interactie met elkaar via extracellulaire signalen tijdens de ontwikkeling. In de studie van genexpressie bij de ontwikkeling van kraakbeen en botten is één obstakel de heterogeniteit van skelet structuren samengesteld uit meerdere weefsel typen. Nauwkeurige isolatie van het specifieke weefsel van belang is de sleutel voor succesvolle transcriptionele analyse.
Laser Capture microdissection (LCM) is een krachtig hulpmiddel om celtypen of interessegebieden binnen heterogene weefsels te isoleren, en is reproduceerbaar en is gevoelig voor het enkele celniveau2. Het kan zich precies richten en cellen van belang te vangen voor een breed scala van downstream assays in transcriptomics, Genomics, en proteomica3,4. De kwaliteit van het geïsoleerde RNA, DNA of eiwit kan worden beoordeeld met een bioanalyzer of gelijkwaardig platform. De kwaliteit van RNA wordt bijvoorbeeld aangegeven door het RNA-integriteits nummer (RIN)5.
Hier bieden we een protocol voor de snelle kleuring en isolatie van kraakbeen en botten door LCM uit verse bevroren weefsels. We gebruiken het embryo van de muis om aan te tonen dat dit protocol kwalitatief hoogwaardig RNA oplevert voor daaropvolgende transcriptomische analyse, zoals RNA-sequencing (RNA-SEQ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Laser Capture microdissection (LCM) is een krachtig hulpmiddel om specifieke celtypen of regio's van belang te isoleren van heterogene weefsels. De cellulaire en moleculaire complexiteit van skeletelementen neemt toe met de ontwikkeling. Weefsel heterogeniteit, zoals op het raakvlak van kraakbeen-en osseeuze elementen met elkaar of met omringende weefsels, is een obstakel voor de studie van het ontwikkelen van kraakbeen en botten. Ons protocol biedt een snelle methode van weefsel verwerking en isolatie van kraakbeen en botten die hoge kwaliteit RNA voor genexpressie analyse oplevert. Verse bevroren weefsels van muis embryo's worden verdeeld en korte Cresylacetaat Violet kleuring wordt gebruikt om kraakbeen en botten te visualiseren met kleuren die verschillend zijn van omringende weefsels. Dia's worden vervolgens snel gedehydrateerd en kraakbeen en botten worden vervolgens geïsoleerd door LCM. De minimalisatie van blootstelling aan waterige oplossingen tijdens dit proces handhaaft de RNA-integriteit. Het kraakbeen van de muis Meckel en het mandibulaire bot bij E 16.5 werden met succes verzameld en de analyse van genexpressie toonde differentiële expressie van marker genen voor osteoblasten, osteocyten, osteoclasten en chondrocyten. RNA van hoge kwaliteit werd ook geïsoleerd uit een aantal weefsels en embryonale leeftijden. Dit protocol Details monstervoorbereiding voor LCM met inbegrip van cryoinbed ding, snijden, kleuring en dehydrerende verse bevroren weefsels, en precieze isolatie van kraakbeen en bot door LCM resulterend in hoge kwaliteit RNA voor Transcriptomic analyse.

Coronale gedeelten van vers bevroren muizen weefsels bij e 16.5 werden gebruikt om de isolatie en verzameling van het kraakbeen (MC), condylenbaan kraakbeen en mandibulaire bot door LCM aan te tonen. Muizen embryo's bij E 16.5 werden ontleed en ingebed in cryogene mallen met een LGO-compound. Monsters in mallen werden snel bevroren in een droogijs en methyl-2-butaan bad en opgeslagen bij-80 °C.
Voor het demonstreren van Cresylacetaat Violet kleuring van kraakbeen en bot, werd cryosectioning i...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Dit protocol beschrijft de laser Capture micro dissectie voor de isolatie van kraakbeen en bot uit verse bevroren delen van de muis embryo. Kraakbeen en botten kunnen snel worden gevisualiseerd door Cresylacetaat-Violet kleuring en precies worden verzameld om RNA van hoge kwaliteit te leveren voor transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissectie van de muis embryonale kraakbeen en bot voor genexpressie analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

De heterogeniteit van skeletstructuren is een obstakel bij het bestuderen van de genexpressie bij het ontwikkelen van kraakbeen en bot. Dit protocol biedt een methode voor nauwkeurige isolatie van aangrenzende, maar verschillende weefsels. We optimaliseren de laserafvangmicrodissection voor kraakbeen en het bot met behulp van cresyl violette kleuring om deze weefsels te visualiseren voor nauwkeurige verzameling door het handhaven van een hoge RNA-integriteit voor latere analyse.Andere weefsels kunnen worden geïsoleerd als cresyl violet voldoende onderscheid van doelweefsel biedt en de RNA-kwaliteit hoog blijft na onze verwerkingsmethode. Dergelijke weefsels omvatten craniofaciale hechtingen en hersenen. Cryosectioning is de meest veeleisende vaardigheid in dit protocol.Zorg ervoor dat het weefsel snel wordt ontleed en ingebed om de hoogste integriteit van RNA te behouden. Om deze procedure te beginnen, ontleedt het embryo of weefsel van belang. Sluit het monster in een wegwerp inbeddingsvorm met optimale snijtemperatuurverbinding en pas de oriëntatie van het monster aan met een tip of naald.Bevries de monsters snel in een droogijs en methyl-2-buteenbad. Bereid vervolgens een dekselcontainer met droogijs door een vel aluminiumfolie op het droge ijs te plaatsen voor tijdelijke opslag van dissectiemonsterglijbanen tijdens cryosectioning. Breng het verse bevroren exemplaar in de emmer droogijs.Plaats een laag van optimale snijtemperatuur verbinding op een cryostat monster houder, en onmiddellijk plaats het monster op de top van de optimale snijtemperatuur verbinding met zachte druk. Wanneer de optimale snijtemperatuurverbinding volledig bevroren is, bevestigt u de houder met het monster in de cryostat snijarm. Laat het monster 15 minuten in de cryostat staan om het te equiliberen met de snijtemperatuur.Vervolgens, sectie van het weefsel op een dikte van 12 micrometer en het verzamelen van de plakjes op PEN membraan dia's. Lijn opeenvolgende secties op het membraan uit. Zodra de dia is voltooid, laat u de secties een paar minuten drogen en breng de glijbaan vervolgens over op de folie in de droge ijscontainer totdat alle vereiste glijbanen worden verzameld.Bewaar de dia's op min 80 graden Celsius in een diavak. Om te beginnen, bereiden drie gelabelde 15 milliliter centrifuge buizen. Voeg 45 milliliter ethanol van 80% toe aan elke buis.Plaats drie buizen op ijs. Plaats een buis met 45 milliliter ethanol van 95% en een buis met 100% ethanol op ijs. Voeg vervolgens 45 milliliter xyleen toe aan een 50 milliliter centrifugebuis bij kamertemperatuur.Ontdooi een PEN membraan schuif kort door het te plaatsen tegen een gehandschoende hand, en was het twee keer gedurende 30 seconden in elk van de buizen met 80% ethanol met agitatie om de optimale snijtemperatuur verbinding te verwijderen. Leg vervolgens de glijbaan op een vel aluminiumfolie. Pipette 8 milliliter van 1%cresyl violet en 50% ethanol op de glijbaan en vlek gedurende 30 seconden.Was de glijbaan in de derde buis met 80% ethanol gedurende 30 seconden. Dehydrateer de glijbaan door het passeren van de buis met 95% ethanol gedurende 30 seconden, de buis met 100% ethanol gedurende 30 seconden, en ten slotte, de buis met xyleen gedurende 30 seconden. Plaats hierna de glijbanen vijf minuten op een delicate taakwisser om de xyleenafvoer te laten uitlekken en de secties te laten drogen.Zet eerst de microdissectionmicrodicctionmicroscoop, laser en computer van de laserafvang aan. Log in op de computer en start de software. Wanneer het groene lampje is ingeschakeld, drukt u op de rode knop om de laser te activeren.Wanneer het licht rood wordt, is de laser klaar voor gebruik. Steek de dop van een 5 milliliter PCR buis in de collector. Pipette 50 microliter extractiebuffer in de dop en steek het verzamelapparaat in de microscoop.Klik in het venster wijzigingscollectorapparaat op de knop Verplaatsen naar referentiepunt om de verzamelprogramma naar het referentiepunt te verplaatsen. Pas de focus aan om het referentiepunt duidelijk weer te geven. Klik vervolgens op de linker ontlaadknop op de werkbalk om de diahouder te verlagen.Plaats de schuif in de houder met het weefsel gedeelte naar beneden gericht, en steek de houder terug in het podium. Klik op Doorgaan in het venster Wijzigingsmodel. Als u de laserparameters wilt instellen, selecteert u de besturingsoptie van het lasermenu of klikt u op het laserpictogram.Pas de volgende parameters naar wens, macht, dat is de kracht van de laser, diafragma, dat is de breedte van de laser, en snelheid, dat is de snijsnelheid in draw en cut-modus. Begin met een 5X doelstelling om de interessegebieden te vinden en schakel over naar het doel dat het beste het interessegebied laat zien. Kies de buis voor de collectie door te klikken op het merk op de collector, kies dan verplaatsen en knippen of tekenen en knippen.Zodra de snede is voltooid, zal het doelweefsel met PEN membraan vallen in de dop van de collectie buis door de zwaartekracht. Herhaal dit selectie- en snijproces om indien nodig meerdere aandachtsgebieden te trekken. Laad hierna de collector uit en sluit de PCR-buis voorzichtig.Plaats de microontsneden weefsels op droog ijs. Ontdooi de microontsneden weefsels bij kamertemperatuur, centrifuge vervolgens kort en broed de monsters gedurende 30 minuten uit op 42 graden Celsius. Draai hierna de lysebuffer naar beneden in de 5 milliliter PCR-buis.Voer DNase-behandeling en RNA-extractie uit met behulp van een RNA-isolatiekit, volgens de instructies van de fabrikant. In deze studie wordt een geoptimaliseerde laserafvangmicrodissection van kraakbeen en bot uitgevoerd, waarbij het gebruik van cresylviolet-kleuring wordt benadrukt in een snelle procedure om kraakbeen en bot te visualiseren voor nauwkeurige weefselverzameling met behoud van een hoge RNA-integriteit voor latere analyse. Observatie van de dia's toont aan dat alle onderzochte kraakbeenvlekken magenta zijn gekleurd en dat alle gemineraliseerde weefsels bruin of zwart zijn gekleurd.Zowel kraakbeen als bot zijn gemakkelijk te onderscheiden van andere weefsels op meerdere anatomische plaatsen. Meckel's Kraakbeen, condylar kraakbeen, en de mandibulaire botgebieden worden geselecteerd en geïsoleerd door laser vangen microdissection. Om voldoende RNA voor het naten te verkrijgen, trekt u 10 gebieden van Meckel's Kraakbeen, 10 regio's condylar kraakbeen of vier gebieden van mandibulair bot in respectievelijk drie afzonderlijke opvangbuizen.RNA wordt vervolgens geëxtraheerd, en het totale RNA wordt geanalyseerd met behulp van een bioanalyzer. Deze laser capture microdissection protocol wordt gebruikt op verschillende weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia, en de RNA integriteit nummer metingen geven een hoge RNA kwaliteit. Differentiële genexpressie analyse wordt vervolgens uitgevoerd.Er zijn 4.006 genen significant en verschillend uitgedrukt tussen het mandibulaire bot en Meckel's Kraakbeen. Genen die specifiek zijn voor osteoblasten of osteocyten worden meer uitgedrukt in het mandibulaire bot, terwijl chondrocyte specifieke genen zijn meer sterk uitgedrukt in Meckel's Kraakbeen. Bovendien worden osteoclastmarkers meer uitgedrukt in het mandibulaire bot, wat wijst op een succesvolle isolatie van gerichte weefsels.Na deze procedure kan genexpressieanalyse, inclusief qPCR en RNA-seq, worden uitgevoerd. Deze methoden kunnen de genexpressie van het transcriptoom in specifieke weefsels of gebieden van belang binnen heterogene weefsels analyseren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Cultuur van embryonale Mouse Cochlear Explantaten en Gene Transfer door elektroporatie

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel&#39;s Kraakbeen

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal bestellen van Dynamic Expression gegevens van Uitgebreide Ruimtelijke Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissectie en Cultuur van Muis Embryonale Nier

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...