Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) und dem Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233) unterstützt. Die Autoren danken dem Biorepository und Pathologie-Kern für den Zugang zur Leica LMD 6500 Plattform an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai.

Gewebe von Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gewonnen, und Studienprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai genehmigt.
1. Zubereitung von Frischgefrorenen Exemplaren
<ol><li>Sezieren Sie den Embryo oder das Gewebe von Interesse. Einbetten der Probe in eine Einweg-Einbettform mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Passen Sie d...

LCM ermöglicht die Isolierung angereicherter oder homogener Zellpopulationen aus heterogenen Geweben. Zu seinen Vorteilen gehört die schnelle und präzise Erfassung von Zellen in ihrem In-vivo-Kontext, während mögliche Nachteile darin bestehen, dass sie zeitaufwändig, teuer und durch die Notwendigkeit begrenzt ist, dass der Benutzer unterschiedliche Subpopulationen innerhalb einer bestimmten Stichprobe30erkennt. Dieses Protokoll enthält Details zu LCM von embryonalem Knorpel und Kno...

Das Muskel-Skelett-System ist ein Mehrkomponentensystem, bestehend aus Muskel, Bindegewebe, Sehne, Band, Knorpel und Knochen, innerviert durch Nerven und durch Blutgefäße vaskularisiert1. Das Skelettgewebe entwickelt sich mit zunehmender zellulärer Heterogenität und struktureller Komplexität. Knorpel und Knochen entwickeln sich aus der gleichen Osteochondroprogenitor-Linie und sind stark verwandt. Embryonaler Knorpel und Knochen entwickeln sich in Verbindung mit Muskeln, Nerven, Blutgefäßen und undifferenziertem Mesenchym. Knorpel kann auch von Knochen umgeben sein, wie Meckels Knorpel und Kondylarknorpel innerhalb des Unterkieferknochens. Diese Gewebe sind anatomisch assoziiert und interagieren während der Entwicklung durch extrazelluläre Signale miteinander. Bei der Untersuchung der Genexpression bei der Entwicklung von Knorpel und Knochen ist ein Hindernis die Heterogenität von Skelettstrukturen, die aus mehreren Gewebetypen bestehen. Eine präzise Isolierung des spezifischen Gewebes von Interesse ist der Schlüssel für eine erfolgreiche Transkriptionsanalyse.
Lasercapture Microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zelltypen oder Relevante Regionen innerhalb heterogener Gewebe zu isolieren, ist reproduzierbar und empfindlich gegenüber der Einzelzellebene2. Es kann Zellen von Interesse für eine breite Palette von nachgelagerten Assays in Transkriptomik, Genomik und Proteomik präzise zielen und erfassen3,4. Die Qualität der isolierten RNA, DNA oder Protein kann mit einem Bioanalysator oder einer gleichwertigen Plattform beurteilt werden. Beispielsweise wird die RNA-Qualität durch die RNA-Integritätsnummer (RIN)5angezeigt.
Hier bieten wir ein Protokoll zur schnellen Färbung und Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM aus frisch gefrorenem Gewebe. Wir verwenden den Mausembryon, um zu zeigen, dass dieses Protokoll qualitativ hochwertige RNA für nachfolgende transkriptomische Analysen liefert, wie z. B. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Laser capture microdissection (LCM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um bestimmte Zelltypen oder Interessengebiete von heterogenen Geweben zu isolieren. Die zelluläre und molekulare Komplexität von Skelettelementen nimmt mit der Entwicklung zu. Gewebeheterogenität, wie z.B. an der Schnittstelle von knorpeligen und ossösen Elementen untereinander oder mit umgebenden Geweben, ist ein Hindernis für die Untersuchung der Entwicklung von Knorpel und Knochen. Unser Protokoll bietet eine schnelle Methode der Gewebeverarbeitung und Isolierung von Knorpel und Knochen, die eine qualitativ hochwertige RNA für die Genexpressionsanalyse liefert. Frische gefrorene Gewebe von Mausembryonen werden geschnitten und kurze kresylviolette Färbung wird verwendet, um Knorpel und Knochen mit Farben zu visualisieren, die sich von umgebenden Geweben unterscheiden. Die Rutschen werden dann schnell dehydriert, Knorpel und Knochen werden anschließend von LCM isoliert. Die Minimierung der Exposition gegenüber wässrigen Lösungen während dieses Prozesses bewahrt die RNA-Integrität. Maus Meckels Knorpel und Unterkieferknochen bei E16.5 wurden erfolgreich gesammelt und die Genexpressionsanalyse zeigte die differenzielle Expression von Markergenen für Osteoblasten, Osteozyten, Osteoklasten und Chondrozyten. Hochwertige RNA wurde auch aus einer Reihe von Geweben und embryonalen Zeitaltern isoliert. Dieses Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung für LCM, einschließlich Kryoembedding, Schnitt, Färbung und Dehydrierung von frischem gefrorenem Gewebe, und eine präzise Isolierung von Knorpel und Knochen durch LCM, was zu einer qualitativ hochwertigen RNA für die transkriptomische Analyse führt.

Koronale Abschnitte von frisch gefrorenem Mausgewebe bei E16.5 wurden verwendet, um die Isolierung und Sammlung von Meckels Knorpel (MC), Kondylarknorpel und Unterkieferknochen durch LCM zu demonstrieren. Mausembryonen bei E16.5 wurden seziert und in kryogene Formen mit OCT-Verbindung eingebettet. Proben in Formen wurden schnell in einem Trockeneis- und Methyl-2-Butanbad eingefroren und bei -80 °C gelagert.
Um die kresylviolette Färbung von Knorpel und Knochen zu demonstrieren, wurde eine Kr...

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Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Dieses Protokoll beschreibt lasercapture microdissection for the isolation of knorpel and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Knorpel und Knochen können durch Kresylviolettfärbung schnell visualisiert und präzise gesammelt werden, um hochwertige RNA für die transkriptomische Analyse zu liefern.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Die Heterogenität der Skelettstrukturen ist ein Hindernis bei der Untersuchung der Genexpression bei der Entwicklung von Knorpel und Knochen. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur präzisen Isolierung benachbarter, aber unterschiedlicher Gewebe. Wir optimieren die Laseraufnahme-Mikrodissektion für Knorpel und Knochen mit Kresylviolettfärbung, um diese Gewebe für eine präzise Sammlung zu visualisieren, indem wir eine hohe RNA-Integrität für die nachfolgende Analyse beibehalten.Andere Gewebe können isoliert werden, wenn Kresylviolett eine ausreichende Unterscheidung des Zielgewebes bietet und die RNA-Qualität nach unserer Verarbeitungsmethode hoch bleibt. Zu diesen Geweben gehören craniofacial Nähte und Gehirn. Cryosectioning ist die anspruchsvollste Fähigkeit in diesem Protokoll.Stellen Sie sicher, dass das Gewebe schnell seziert und eingebettet wird, um die höchste Integrität der RNA zu erhalten. Um dieses Verfahren zu beginnen, sezieren Sie den Embryo oder das Gewebe von Interesse. Die Probe in eine Einweg-Einbettform mit optimaler Schnitttemperaturverbindung einbetten und die Ausrichtung der Probe mit einer Spitze oder Nadel anpassen.Die Proben in einem Trockeneis- und Methyl-2-Butenbad schnell einfrieren. Als nächstes bereiten Sie einen Deckelbehälter mit Trockeneis vor, indem Sie eine Aluminiumfolie auf das Trockeneis legen, um während des Kryosektionseinebeinens vorübergehend Sezierprobenrutschen zu lagern. Das frisch gefrorene Exemplar in den Eimer trockeneis geben.Legen Sie eine Schicht mit optimaler Schnitttemperaturverbindung auf einen Kryostat-Probenhalter und legen Sie die Probe sofort mit sanftem Druck auf die optimale Schnitttemperaturverbindung. Wenn die optimale Schnitttemperaturverbindung vollständig eingefroren ist, befestigen Sie den Halter mit der Probe in den Kryostatschneidarm. Lassen Sie die Probe 15 Minuten im Kryostat, um sie auf die Schnitttemperatur auszugrenzen.Dann schneiden Sie das Gewebe mit einer Dicke von 12 Mikrometern und sammeln Sie die Scheiben auf PEN-Membran-Dias. Richten Sie aufeinander folgende Abschnitte auf der Membran aus. Nach Abschluss der Rutsche lassen Sie die Abschnitte für einige Minuten trocknen und übertragen Sie die Rutsche dann auf die Folie im Trockeneisbehälter, bis alle erforderlichen Rutschen gesammelt sind.Bewahren Sie die Dias bei minus 80 Grad Celsius in einer Schiebebox auf. Zu Beginn drei beschriftete 15-Milliliter-Zentrifugenrohre zubereiten. Fügen Sie 45 Milliliter 80% Ethanol in jede Röhre.Legen Sie drei Röhren auf Eis. Legen Sie eine Tube mit 45 Millilitern 95%Ethanol und eine Tube mit 100% Ethanol auf Eis. Als nächstes 45 Milliliter Xylol zu einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei Raumtemperatur hinzufügen.Eine PEN-Membran kurz auftauen, indem Sie sie gegen eine handgeliebte Hand legen, und waschen Sie sie zweimal für 30 Sekunden in jedem der Rohre, die 80% Ethanol mit Rührung enthalten, um die optimale Schnitttemperaturverbindung zu entfernen. Legen Sie dann die Rutsche auf ein Blatt Aluminiumfolie. Pipette 8 Milliliter 1%Cresylviolett und 50% Ethanol auf die Rutsche und Fleck für 30 Sekunden.Waschen Sie die Rutsche in der dritten Röhre mit 80% Ethanol für 30 Sekunden. Dehydrieren Sie die Rutsche, indem Sie sie 30 Sekunden lang durch das Rohr mit 95 % Ethanol, das Rohr mit 100 % Ethanol für 30 Sekunden und schließlich das Rohr, das Xylol enthält, 30 Sekunden lang passieren. Danach die Dias für fünf Minuten auf einen empfindlichen Aufgabenwischer stellen, um das Xylol abtropfen zu lassen und die Abschnitte trocknen zu lassen.Schalten Sie zunächst das Laseraufnahmemikroskop, den Laser und den Computer ein. Melden Sie sich am Computer an und starten Sie die Software. Wenn das grüne Licht leuchtet, drücken Sie die rote Taste, um den Laser zu aktivieren.Wenn das Licht rot wird, ist der Laser einsatzbereit. Legen Sie die Kappe eines 5 Milliliter PCR-Rohrs in den Kollektor ein. Pipette 50 Mikroliter Extraktionspuffer in die Kappe und legen Sie das Sammelgerät in das Mikroskop.Klicken Sie im Fenster "Wechsel-Collector-Geräte" auf die Schaltfläche Zum Referenzpunkt verschieben, um den Kollektor zum Referenzpunkt zu verschieben. Passen Sie den Fokus an, um den Referenzpunkt klar anzuzeigen. Klicken Sie als Nächstes auf die linke Entladeschaltfläche in der Symbolleiste, um den Folienhalter zu senken.Legen Sie die Folie in den Halter mit dem nach unten gerichteten Gewebeabschnitt und setzen Sie den Halter wieder in die Bühne ein. Klicken Sie im Fenster "Muster ändern" auf "Fortfahren". Um die Laserparameter einzurichten, wählen Sie die Steuerungsoption des Lasermenüs oder klicken Sie auf das Lasersymbol.Passen Sie die folgenden Parameter wie gewünscht, Leistung, die die Leistung des Lasers ist, Blende, die die Breite des Lasers ist, und Geschwindigkeit, die die Schnittgeschwindigkeit im Zug- und Schnittmodus ist. Beginnen Sie mit einem 5X-Ziel, die Interessensgebiete zu finden, und wechseln Sie zu dem Ziel, das den Interessenbereich am besten anzeigt. Wählen Sie das Rohr für die Sammlung, indem Sie auf die Markierung am Kollektor klicken, dann wählen Sie verschieben und schneiden oder zeichnen und schneiden.Sobald der Schnitt abgeschlossen ist, fällt das Zielgewebe mit PEN-Membran durch Schwerkraft in die Kappe des Sammelrohrs. Wiederholen Sie diesen Auswahl- und Schneidprozess, um bei Bedarf mehrere Interessenbereiche zu ziehen. Danach den Kollektor entladen und das PCR-Rohr vorsichtig schließen.Legen Sie das mikrosezierte Gewebe auf Trockeneis. Das mikrosezierte Gewebe bei Raumtemperatur auftauen, dann kurz zentrieren und die Proben 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius bebrüten. Danach drehen Sie den Lysepuffer in das 5 Milliliter PCR-Rohr.Führen Sie die DNase-Behandlung und die RNA-Extraktion mit einem RNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. In dieser Studie wird eine optimierte Lasererfassungsmikrodissektion von Knorpel und Knochen durchgeführt, die die Verwendung von Kresylviolettfärbung in einem schnellen Verfahren zur Visualisierung von Knorpel und Knochen für eine präzise Gewebesammlung unter Beibehaltung einer hohen RNA-Integrität für die nachfolgende Analyse hervorhebt. Die Beobachtung der Dias zeigt, dass alle untersuchten Knorpel Magenta gefärbt sind und alle mineralisierten Gewebe braun oder schwarz sind.Knorpel und Knochen lassen sich an mehreren anatomischen Stellen leicht von anderen Geweben unterscheiden. Meckels Knorpel, Kondylarknorpel und die Unterkieferknochenbereiche werden durch Laseraufnahmemikrodissektion ausgewählt und isoliert. Um genügend RNA für die Sequenzierung zu erhalten, ziehen Sie 10 Regionen von Meckels Knorpel, 10 Regionen Kondylarknorpel oder vier Regionen des Unterkieferknochens in drei einzelne Sammelröhrchen.Anschließend wird die RNA extrahiert und die gesamte RNA mit einem Bioanalyzer analysiert. Dieses Laser-Capture-Mikrodissektionsprotokoll wird an verschiedenen Geweben in verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet, und die Messungen der RNA-Integritätsnummer zeigen eine hohe RNA-Qualität an. Anschließend wird eine Differenzgenexpressionsanalyse durchgeführt.Zwischen dem Unterkieferknochen und Meckels Knorpel werden 4 006 Gene signifikant und unterschiedlich exprimiert. Gene, die für Osteoblasten oder Osteozyten spezifisch sind, werden im Unterkieferknochen stärker exprimiert, während chondrozytenspezifische Gene stärker in Meckels Knorpel exprimiert werden. Darüber hinaus sind Osteoklastmarker stärker im Unterkieferknochen exprimiert, was auf eine erfolgreiche Isolierung von Zielgeweben hindeutet.Nach diesem Verfahren kann eine Genexpressionsanalyse, einschließlich qPCR und RNA-seq, durchgeführt werden. Diese Methoden können die Genexpression des Transkriptoms in bestimmten Geweben oder Regionen von Interesse innerhalb heterogener Gewebe analysieren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisierung und quantitative Analyse der embryonalen Angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...