Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר קרניו Ofacial (R01DE022988) ו שרייבר יוניס קנדי Shriver המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (P01HD078233). המחברים מודים למרכז הרפואי והפתולוגיה לגישה לפלטפורמת לייקה LMD 6500 בבית הספר Icahn לרפואה בהר סיני.

רקמות מעכברים הושגו בהתאם למכונים הלאומיים למדריך בריאות לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים, ופרוטוקולי המחקר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים בבית הספר Icahn לרפואה בהר סיני.
1. הכנת הדגימה קפואים טריים
<ol><li>. מנתח את העובר או את רקמת הריבית הטמע את המדגם בתבנית ...

LCM מאפשרת בידוד של אוכלוסיות תאים מועשר או הומוגניים מרקמות הטרוגניות. היתרונות שלה כוללים לכידת מהירה ומדויקת של תאים בהקשר vivo שלהם, בעוד חסרונות פוטנציאליים כוללים אותו להיות זמן רב, יקר, ומוגבל על ידי הצורך המשתמש לזהות אוכלוסיות משנה נפרדות בתוך דוגמה מסוימת30. פרוטוק...

מערכת השלד והשרירים היא מערכת מרובת רכיבים המורכבת שריר, רקמת חיבור, גיד, רצועה, סחוס, ועצם, innervated על ידי עצבים ובאמצעות כלי דם1. רקמות השלד להתפתח עם הגדלת טרוגניות הסלולר והמורכבות המבנית. סחוס ועצם להתפתח מאותו השושלת האוסטכונדרוקדמון, הם קשורים מאוד. הסחוס ועצם עובריים להתפתח בשיתוף עם השרירים, העצבים, כלי הדם, מובחן mesenchyme. הסחוס עשוי גם להיות מוקף עצם, כגון הסחוס של מקל הסחוס condylar בתוך עצם הלסת. רקמות אלה משויכים מבחינה אנטומית ומתקשרים אחד עם השני באמצעות אותות משוונים במהלך הפיתוח. במחקר של ביטוי גנים בהתפתחות של סחוס ועצם, מכשול אחד הוא הטרוגניות של מבנים השלד מורכב מסוגים מרובים של רקמות. בידוד מדויק של רקמת העניין הספציפית הוא המפתח לניתוח מוצלח של הטרנססקריפט.
לכידת לייזר (LCM) הוא כלי רב עוצמה כדי לבודד את סוגי התאים או אזורים המעניינים בתוך רקמות הטרוגניות, והוא הינו רגיש לרמה תא בודדת2. זה יכול בדיוק למקד וללכוד את התאים של עניין עבור מגוון רחב של במורד הזרם בחני אמר ב transcript, גנומיקה, ו פרוטאומניקס3,4. האיכות של ה-RNA המבודד, ה-DNA או החלבון יכול להיות מוערך עם הפלטפורמה bioanalyzer או שווה ערך. לדוגמה, איכות ה-RNA מצוינת על-ידי מספר התקינות של RNA (RIN)5.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לצביעת ובידוד מהירה של סחוס ועצם על ידי LCM מרקמות קפואות טריות. אנו משתמשים העובר העכבר כדי להדגים כי פרוטוקול זה תשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח הטרנססקריפט הבאים, כגון רצפי RNA (RNA-seq).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

לכידת לייזר (LCM) היא כלי רב עוצמה לבידוד סוגי תאים ספציפיים או אזורים מעניינים מרקמות הטרוגניות. המורכבות התאית והמולקולרית של יסודות השלד גדלה בפיתוח. טרוגניות רקמות, כגון בממשק של הסחוס ואלמנטים osseous אחד עם השני או עם הרקמות הסובבות, הוא אחד מכשול למחקר של פיתוח סחוס ועצם. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מהירה של עיבוד רקמות ובידוד של סחוס ועצם התשואות באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. הרקמות הקפואות טרי של עוברי העכבר הם מנות ומכתים קצר cresyl סגול משמש להמחיש סחוס ועצם עם צבעים נפרדים מרקמות המקיפים. השקופיות מיובשות אז במהירות, והסחוס והעצמות מבודדים לאחר מכן על ידי LCM. מזעור החשיפה לפתרונות מימית במהלך תהליך זה שומר על שלמות RNA. הסחוס ועצם הלסת של העכבר על E 16.5 היו נאספים בהצלחה וניתוח ביטוי גנטי הראה ביטוי דיפרנציאלי של גנים סמן עבור אוסטאופתי, אוסטאופציטים, אוסטאופםנמשך, ו כונדרוציטים. באיכות גבוהה RNA היה גם מבודד מתוך מגוון של רקמות וגילאים עובריים. פרוטוקול זה הכנה לדוגמה של LCM כולל קריוהטבעה, הפחתה, כתמים והסרת לחות של רקמות קפואות טריות, ובידוד מדויק של סחוס ועצם על ידי LCM וכתוצאה מכך באיכות גבוהה RNA עבור ניתוח transcript.

קטעים coronal של רקמות העכבר הקפוא קפואים ב-E 16.5 שימשו כדי להדגים את הבידוד ואת האוסף של הסחוס של Meckel (MC), סחוס condylar, ועצם הלסת על ידי LCM. עוברי עכבר על E 16.5 היו גזור מוטבע בתבניות קריוגניים עם מתחם OCT. דגימות בתבניות היו קפואות במהירות בקרח יבש ובמרחץ מתיל-2-בוטאן ואוחסנו ב-80 ° c.
כדי ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

ההטרוגניות של מבני השלד היא מכשול אחד בחקר ביטוי הגנים בפיתוח סחוס ועצמות. פרוטוקול זה מספק שיטה לבידוד מדויק של רקמות סמוכות אך שונות. אנו מייעלים את המיקרו-דיסקטציה ללכידת לייזר לסחוס ולעצם באמצעות כתמים סגולים של cresyl כדי לדמיין רקמות אלה לאיסוף מדויק על ידי שמירה על שלמות RNA גבוהה לניתוח הבא.רקמות אחרות ניתן לבודד אם cresyl סגול מספק הבחנה מספקת של רקמת היעד ואיכות RNA נשאר גבוה לאחר שיטת העיבוד שלנו. רקמות כאלה כוללות תפרים craniofacial ומותק. קריוסקציה היא המיומנות התובענית ביותר בפרוטוקול זה.ודא כי הרקמה נותבה ומוטמעת במהירות כדי לשמור על השלמות הגבוהה ביותר של RNA. כדי להתחיל בהליך זה, לנתח את העובר או רקמה של עניין. להטמיע את המדגם בתבנית הטבעה חד פעמית עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, ולהתאים את הכיוון של הדגימה עם קצה או מחט.להקפיא במהירות את הדגימות בקרח יבש ואמבט מתיל-2-butene. לאחר מכן, להכין מיכל מרופד עם קרח יבש על ידי הנחת יריעת רדיד אלומיניום על הקרח היבש לאחסון זמני של מגלשות מדגם ניתוח במהלך cryosectioning. מעבירים את הדגימה הקפואה הטרייה לתוך דלי הקרח היבש.מניחים שכבה של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית על מחזיק דגימת קריוסטאט, ומיד מניחים את הדגימה על גבי תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית בלחץ עדין. כאשר תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית קפואה לחלוטין, הדקו את המחזיק עם הדגימה לזרוע חיתוך ההקפאה. השאירו את הדגימה בהקפאט למשך 15 דקות כדי לצייד אותה לטמפרטורת החיתוך.לאחר מכן, לחתוך את הרקמה בעובי של 12 מיקרומטר ולאסוף את הפרוסות על שקופיות קרום PEN. ישר מקטעים עוקבים על הממברנה. לאחר השלמת השקופית, אפשר לחלקים להתייבש במשך מספר דקות ולאחר מכן העבר את השקופית אל נייר הכסף במיכל הקרח היבש עד שכל השקופיות הנדרשות ייאספו.אחסן את השקופיות במינוס 80 מעלות צלזיוס בתיבת שקופיות. כדי להתחיל, להכין שלושה שכותרתו 15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. מוסיפים 45 מיליליטר של 80% אתנול לכל צינור.מניחים שלושה צינורות על קרח. מניחים צינור המכיל 45 מיליליטר של 95% אתנול וצינור המכיל 100% אתנול על קרח. לאחר מכן, להוסיף 45 מיליליטר של קסילן לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר בטמפרטורת החדר.להפשיר ממברנה PEN להחליק בקצרה על ידי הנחת אותו על יד כפפה, ולשטוף אותו פעמיים במשך 30 שניות בכל אחד הצינורות המכילים 80% אתנול עם תסיסה כדי להסיר את תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית. לאחר מכן, להניח את השקופית על גיליון של רדיד אלומיניום. פיפטה 8 מיליליטר של 1%cresyl סגול ו 50% אתנול על השקופית וכתם במשך 30 שניות.לשטוף את השקופית בצינור השלישי המכיל 80% אתנול במשך 30 שניות. לייבש את השקופית על ידי העברתו דרך הצינור המכיל 95% אתנול במשך 30 שניות, הצינור המכיל 100% אתנול במשך 30 שניות, ולבסוף, הצינור המכיל קסילן במשך 30 שניות. לאחר מכן, מניחים את השקופיות על מגב משימה עדין במשך חמש דקות כדי לאפשר לקסילן לנקז ולאפשר לחלקים להתייבש.תחילה, הפעל את מיקרוסקופ המיקרו-דיסקטוריה, הלייזר והמחשב ללכידת לייזר. היכנס למחשב והתחל את התוכנה. כאשר האור הירוק דול, לחץ על הכפתור האדום כדי להפעיל את הלייזר.כאשר האור הופך לאדום, הלייזר מוכן לשימוש. הכנס את המכסה של צינור PCR 5 מיליליטר לתוך האספן. פיפטה 50 מיקרוליטרים של מאגר מיצוי לתוך הכובע ולהכניס את התקן האיסוף לתוך המיקרוסקופ.בחלון התקן מלקט השינוי, לחץ על לחצן הזז לנקודת התייחסות כדי להזיז את האספן לנקודת ההתייחסות. התאם את המוקד כדי להציג בבירור את נקודת ההתייחסות. לאחר מכן, לחץ על לחצן ביטול הטעינה השמאלי בסרגל הכלים כדי להוריד את מחזיק השקופית.מקם את השקופית לתוך המחזיק כאשר מקטע הרקמה פונה כלפי מטה, והכנס את המחזיק בחזרה לבמה. לחץ על המשך בחלון דגימת השינוי. כדי להגדיר את פרמטרי הלייזר, בחר באפשרות הבקרה של תפריט הלייזר או לחץ על סמל הלייזר.התאם את הפרמטרים הבאים כרצונך, כוח, שהוא כוחו של הלייזר, הצמצם, שהוא רוחב הלייזר והמהירות, שהוא מהירות החיתוך במצב ציור וחיתוך. התחל עם יעד 5X כדי למצוא את תחומי העניין, ולעבור למטרה המציגה בצורה הטובה ביותר את תחום העניין. בחר את הצינור לאיסוף על ידי לחיצה על הסימן על האספן, ולאחר מכן לבחור להעביר לחתוך או לצייר לחתוך.לאחר החתך הושלם, רקמת היעד עם קרום PEN ייפול לתוך הכובע של צינור האיסוף על ידי כוח הכבידה. חזור על תהליך בחירה וחיתוך זה כדי למשוך תחומי עניין מרובים במידת הצורך. לאחר מכן, לפרוק את האספן בזהירות לסגור את צינור PCR.מניחים את הרקמות microdissected על קרח יבש. להפשיר את הרקמות microdissected בטמפרטורת החדר, אז צנטריפוגה לזמן קצר, ולהדגיר את הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, לסובב את מאגר תיזה למטה לתוך צינור PCR 5 מיליליטר.בצע טיפול DNase והפקת RNA באמצעות ערכת בידוד RNA, בהתאם להוראות היצרן. במחקר זה, מיקרודיסקציה לייזר אופטימיזציה של סחוס ועצמות מבוצעת, הדגשת השימוש בכתמים cresyl סגול בהליך מהיר כדי לדמיין סחוס ועצמות לאיסוף רקמות מדויק תוך שמירה על שלמות RNA גבוהה לניתוח הבא. התבוננות בשקופיות מראה כי כל הסחוסים שנבדקו הם מגנטה מוכתמת, וכל הרקמות המינרליות מוכתמות בחום או בשחור.הן הסחוס והן העצם נבדלים בקלות מרקמות אחרות באתרים אנטומיים מרובים. הסחוס של מקל, הסחוס התבולל ואזורי העצמות המזידים נבחרים ומבודדים על ידי מיקרו-דיסקטאז' בלכידת לייזר. כדי להשיג מספיק RNA לריבוד, משוך 10 אזורים של הסחוס של מקל, 10 אזורים של סחוס קונדילרי, או ארבעה אזורים של עצם מנדיבולרית לשלושה צינורות איסוף בודדים בהתאמה.RNA מופק לאחר מכן, ואת RNA הכולל מנותח באמצעות bioanalyzer. פרוטוקול מיקרו-דיסקטי של לכידת לייזר זה משמש ברקמות שונות בשלבים התפתחותיים שונים, ומדידות מספר תקינות ה- RNA מצביעות על איכות RNA גבוהה. לאחר מכן מבוצע ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי.ישנם 4,006 גנים באופן משמעותי ושונה לידי ביטוי בין עצם הדם התת-תאית לבין הסחוס של מקל. גנים ספציפיים osteoblasts או osteocytes באים לידי ביטוי גבוה יותר בעצם הנדרביולרית בעוד גנים ספציפיים chondrocyte באים לידי ביטוי יותר בסחוס של מקל. בנוסף, סמנים osteoclast באים לידי ביטוי יותר בעצם המאנדיברולרית, המציין בידוד מוצלח של רקמות ממוקדות.בעקבות הליך זה, ניתוח ביטוי גנים, כולל qPCR ו- RNA-seq, יכול להתבצע. שיטות אלה יכולות לנתח ביטוי גנים של התמליל ברקמות ספציפיות או באזורים מעניינים בתוך רקמות הטרוגניות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...