Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) e dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (P01HD078233). Gli autori ringraziano il Biorepository e Pathology Core per l'accesso alla piattaforma Leica LMD 6500 presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.

I tessuti dei topi sono stati ottenuti in conformità con la Guida Nazionale di Salute per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio, e i protocolli di studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai.
1. Preparazione di fresco congelato Campione
<ol><li>Dissezionare l'embrione o il tessuto di interesse. Incorporare il campione in uno stampo di incorporamento usa e getta con composto ottimale per la...

LCM consente l'isolamento di popolazioni cellulari arricchite o omogenee da tessuti eterogenei. I suoi vantaggi includono la cattura rapida e precisa delle cellule nel loro contesto in vivo, mentre i potenziali svantaggi includono che richiede tempo, costoso e limitato dalla necessità per l'utente di riconoscere sottopopolazioni distinte all'interno di un campione specificato30. Questo protocollo fornisce dettagli di LCM della cartilagine embrionale e dell'osso del topo, evidenziando l'u...

Il sistema muscolo-scheletrico è un sistema multicomponente composto da muscoli, tessuto connettivo, tendine, legamento, cartilagine e ossa, innervato dai nervi e vascolarizzato dai vasi sanguigni1. I tessuti scheletrici si sviluppano con una crescente eterogeneità cellulare e complessità strutturale. Cartilagine e ossa si sviluppano dallo stesso lignaggio dell'osteochondroprogenitor e sono altamente correlati. La cartilagine embrionale e l'osso si sviluppano in associazione con muscoli, nervi, vasi sanguigni e mesenchyme indifferenziato. La cartilagine può anche essere circondata da ossa, come la cartilagine di Meckel e la cartilagine condilar all'interno dell'osso mandibolare. Questi tessuti sono associati anatomicamente e interagiscono tra loro attraverso segnali extracellulari durante lo sviluppo. Nello studio dell'espressione genica nello sviluppo della cartilagine e dell'osso, un ostacolo è l'eterogeneità delle strutture scheletriche composte da più tipi di tessuto. L'isolamento preciso del tessuto specifico di interesse è fondamentale per un'analisi trascrizionale di successo.
La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare i tipi di cellule o le regioni di interesse all'interno di tessuti eterogenei, ed è riproducibile ed è sensibile al livello a singola cellula2. Può colpire e catturare con precisione le cellule di interesse per una vasta gamma di analisi a valle in trascrittomica, genomica e proteomica3,4. La qualità dell'RNA, del DNA o della proteina isolata può essere valutata con un bioanalisi o una piattaforma equivalente. Ad esempio, la qualità dell'RNA è indicata dal numero di integrità dell'RNA (RIN)5.
Qui, forniamo un protocollo per la rapida colorazione e isolamento della cartilagine e dell'osso da LCM da tessuti freschi congelati. Usiamo l'embrione di topo per dimostrare che questo protocollo produce RNA di alta qualità per la successiva analisi trascrittomica, come il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

La microdissezione di cattura laser (LCM) è un potente strumento per isolare specifici tipi di cellule o regioni di interesse da tessuti eterogenei. La complessità cellulare e molecolare degli elementi scheletrici aumenta con lo sviluppo. L'eterogeneità dei tessuti, come l'interfaccia di elementi cartilanei e ossei tra loro o con tessuti circostanti, è un ostacolo allo studio dello sviluppo della cartilagine e dell'osso. Il nostro protocollo fornisce un metodo rapido di elaborazione dei tessuti e l'isolamento della cartilagine e dell'osso che produce RNA di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica. I tessuti congelati freschi di embrioni di topo sono sezionato e breve colorazione viola cresyl viene utilizzato per visualizzare la cartilagine e le ossa con colori distinti dai tessuti circostanti. I vetrini vengono quindi rapidamente disidratati e la cartilagine e l'osso vengono successivamente isolati dalla LCM. La minimizzazione dell'esposizione a soluzioni acquose durante questo processo mantiene l'integrità dell'RNA. La cartilagine e l'osso mandibolare di Mouse Meckel a E16.5 sono stati raccolti con successo e l'analisi dell'espressione genica ha mostrato l'espressione differenziale dei geni marcatori per osteoblasti, osteociti, osteoclasti e condrociti. L'RNA di alta qualità è stato anche isolato da una serie di tessuti ed ere embrionali. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione del campione per LCM, tra cui crioincorporando, sezionamento, colorazione e disidratazione dei tessuti freschi congelati, e un preciso isolamento della cartilagine e dell'osso da parte di LCM, con conseguente RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Sezioni coronali di tessuti murini congelati freschi a E16.5 sono stati utilizzati per dimostrare l'isolamento e la raccolta della cartilagine di Meckel (MC), della cartilagine condilare e dell'osso mandibolare di LCM. Gli embrioni di topo all'E16.5 sono stati sezionati e incorporati in stampi criogenici con composto oct. I campioni negli stampi sono stati rapidamente congelati in un ghiaccio secco e in un bagno di metile-2-butano e conservati a -80 gradi centigradi.
Per dimostrare la colorazi...

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Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Questo protocollo descrive la microdissezione di cattura laser per l'isolamento della cartilagine e dell'osso da sezioni fresche congelate dell'embrione di topo. La cartilagine e l'osso possono essere rapidamente visualizzate mediante colorazione viola cresilio e raccolte proprio per produrre RNA di alta qualità per l'analisi trascrittomica.

Microdissezione laser di cattura della cartilagine embrionale del topo e dell'osso per l'analisi dell'espressione genica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

L'eterogeneità delle strutture scheletriche è un ostacolo nello studio dell'espressione genica nello sviluppo della cartilagine e dell'osso. Questo protocollo fornisce un metodo per l'isolamento preciso di tessuti adiacenti ma diversi. Ottimizziamo la microdisezione di cattura laser per la cartilagine e l'osso utilizzando la colorazione viola cresile per visualizzare questi tessuti per una raccolta precisa mantenendo un'elevata integrità dell'RNA per analisi successive.Altri tessuti possono essere isolati se il viola cresile fornisce una distinzione sufficiente del tessuto bersaglio e la qualità dell'RNA rimane elevata dopo il nostro metodo di lavorazione. Tali tessuti includono suture craniofacciali e cervello. La criosezione è l'abilità più esigente in questo protocollo.Assicurarsi che il tessuto sia sezionato e incorporato rapidamente per mantenere la massima integrità dell'RNA. Per iniziare questa procedura, sezionare l'embrione o il tessuto di interesse. Incorporare il campione in uno stampo di incorporamento monouso con un composto ottimale della temperatura di taglio e regolare l'orientamento del campione con una punta o un ago.Congelare rapidamente i campioni in un ghiaccio secco e in un bagno di metil-2-butene. Successivamente, preparare un contenitore lidded con ghiaccio secco posizionando un foglio di foglio di alluminio sul ghiaccio secco per la conservazione temporanea di diapositive campione di dissezione durante la criosezione. Trasferire l'esemplare fresco congelato nel secchio di ghiaccio secco.Posizionare uno strato di composto di temperatura di taglio ottimale su un supporto per campioni criostato e posizionare immediatamente il campione sopra il composto ottimale della temperatura di taglio con una pressione delicata. Quando il composto ottimale della temperatura di taglio è completamente congelato, fissare il supporto con il campione nel braccio di taglio del criostato. Lasciare il campione nel criostato per 15 minuti per equilibrarlo alla temperatura di taglio.Quindi, sezionare il tessuto con uno spessore di 12 micrometri e raccogliere le fette sui vetrini a membrana PEN. Allineare sezioni consecutive sulla membrana. Una volta completato lo scivolo, lasciare asciugare le sezioni per alcuni minuti, quindi trasferire lo scivolo sulla lamina nel contenitore di ghiaccio secco fino a quando non vengono raccolti tutti gli scivoli richiesti.Archiviare le diapositive a meno 80 gradi Celsius in una casella di diapositive. Per iniziare, preparare tre tubi di centrifuga da 15 millilitri etichettati. Aggiungere 45 millilitri di 80% di etanolo a ciascun tubo.Metti tre tubi sul ghiaccio. Posizionare un tubo contenente 45 millilitri di etanolo al 95% e un tubo contenente 100% di etanolo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 45 millilitri di xilene a un tubo di centrifuga da 50 millilitri a temperatura ambiente.Scongelare brevemente uno scivolo a membrana PEN posizionandolo contro una mano guantata e lavarlo due volte per 30 secondi in ciascuno dei tubi contenenti 80% di etanolo con agitazione per rimuovere il composto ottimale della temperatura di taglio. Quindi, posare lo scivolo su un foglio di foglio di alluminio. Pipetta 8 millilitri di 1%viola cresile e 50% di etanolo sullo scivolo e macchia per 30 secondi.Lavare lo scivolo nel terzo tubo contenente l'80%di etanolo per 30 secondi. Disidratare lo scivolo passandolo attraverso il tubo contenente il 95% di etanolo per 30 secondi, il tubo contenente 100%etanolo per 30 secondi e, infine, il tubo contenente xilene per 30 secondi. Successivamente, posizionare le diapositive su un delicato tergicristallo per cinque minuti per lasciare scolare lo xilene e lasciare asciugare le sezioni.In primo luogo, accendere il microscopio a microdisezione di cattura laser, il laser e il computer. Accedere al computer e avviare il software. Quando la luce verde è attiva, premere il pulsante rosso per attivare il laser.Quando la luce diventa rossa, il laser è pronto per l'uso. Inserire il cappuccio di un tubo PCR da 5 millilitri nel raccoglitore. Pipettare 50 microlitri di tampone di estrazione nel tappo e inserire il dispositivo di raccolta al microscopio.Nella finestra del dispositivo raccoglitore di modifiche, fate clic sul pulsante Sposta al punto di riferimento per spostare il raccoglitore nel punto di riferimento. Regolare lo stato attivo per visualizzare chiaramente il punto di riferimento. Fare quindi clic sul pulsante di scaricamento a sinistra sulla barra degli strumenti per abbassare il supporto della diapositiva.Posizionare lo scivolo nel supporto con la sezione tissutale rivolta verso il basso e inserire di nuovo il supporto nel palco. Fare clic su continua nella finestra cambia campione. Per impostare i parametri laser, selezionare l'opzione di controllo del menu laser o fare clic sull'icona del laser.Regola i seguenti parametri come desiderato, la potenza, che è la potenza del laser, l'apertura, che è la larghezza del laser, e la velocità, che è la velocità di taglio in modalità di disegno e taglio. Inizia con un obiettivo 5X per trovare le aree di interesse e passa all'obiettivo che meglio mostra l'area di interesse. Scegliete il tubo per la raccolta facendo clic sul segno nel raccoglitore, quindi scegliete spostarlo e tagliarlo o disegnarlo e tagliarlo.Una volta completato il taglio, il tessuto bersaglio con membrana PEN cadrà nel tappo del tubo di raccolta per gravità. Ripetere questo processo di selezione e taglio per estrarre più aree di interesse, se necessario. Successivamente, scaricare il collettore e chiudere con cura il tubo PCR.Posizionare i tessuti microssacsecati sul ghiaccio secco. Scongelare i tessuti microsacrati a temperatura ambiente, quindi centrifugare brevemente e incubare i campioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, ruotare il tampone dilisi nel tubo PCR da 5 millilitri.Eseguire il trattamento della DNasi e l'estrazione dell'RNA utilizzando un kit di isolamento dell'RNA, seguendo le istruzioni del produttore. In questo studio viene eseguita una microdissezione ottimizzata di cattura laser della cartilagine e dell'osso, evidenziando l'uso della colorazione viola cresile in una procedura rapida per visualizzare cartilagine e ossa per una precisa raccolta dei tessuti mantenendo un'elevata integrità dell'RNA per analisi successive. L'osservazione delle diapositive mostra che tutte le cartilagine esaminate sono magenta macchiate e tutti i tessuti mineralizzati sono macchiati di marrone o nero.Sia la cartilagine che l'osso si distinguono facilmente dagli altri tessuti in più siti anatomici. Cartilagine di Meckel, cartilagine condilare e regioni ossee mandibolari sono selezionate e isolate dalla microdisezione di cattura laser. Per ottenere RNA sufficiente per il sequenziamento, tirare 10 regioni della Cartilagine di Meckel, 10 regioni di cartilagine condilare o quattro regioni di osso mandibolare rispettivamente in tre singoli tubi di raccolta.L'RNA viene quindi estratto e l'RNA totale viene analizzato utilizzando un bioanalizzatore. Questo protocollo di microdisezione di cattura laser viene utilizzato su vari tessuti in diversi stadi di sviluppo e le misurazioni del numero di integrità dell'RNA indicano un'alta qualità dell'RNA. Viene quindi eseguita l'analisi dell'espressione genica differenziale.Ci sono 4.006 geni espressi in modo significativo e diverso tra l'osso mandibolare e la Cartilagine di Meckel. I geni specifici degli osteoblasti o degli osteociti sono più espressi nell'osso mandibolare mentre i geni specifici dei condrociti sono più espressi nella Cartilagine di Meckel. Inoltre, i marcatori osteoclasti sono più espressi nell'osso mandibolare, indicando un isolamento riuscito dei tessuti mirati.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'analisi dell'espressione genica, inclusi qPCR e RNA-seq. Questi metodi possono analizzare l'espressione genica del trascrittoma in tessuti specifici o regioni di interesse all'interno di tessuti eterogenei.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Analisi di Cardiomyocyte Sviluppo usando immunofluorescenza in cuore embrionali di topo

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporale ordinazione di espressione Dynamic Data di espressione spaziale dettagliata Mappe

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Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

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Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissezione e cultura del rene embrionale del mouse

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

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L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...