Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(R01DE022988)とユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健・人間開発研究所(P01HD078233)によって支援されました。著者らは、シナイ山のイカーン医学部のライカLMD 6500プラットフォームへのアクセスに対するバイオリポジトリと病理学コアに感謝する。

マウスからの組織は、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドに従って取得され、研究プロトコルは、マウントシナイのイカーン医学部の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 新鮮な冷凍標本の調製
<ol><li>目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、使い捨て埋め金型にサンプルを埋め込みます。先端または針で?...

LCMは、異種組織からの濃縮または均質な細胞集団の単離を可能にする。その利点は、その生体内文脈における細胞の迅速かつ正確な捕捉を含むが、潜在的な欠点は、時間がかかり、費用がかかり、かつ、ユーザが指定されたサンプル30内の個別の部分集団を認識する必要性によって制限されることを含む。このプロトコルは、マウス胚軟骨および骨のLCMの詳細を提供?...

筋骨格系は、筋肉、結合組織、腱、靭帯、軟骨、および骨からなる多成分系であり、神経によって内在し、血管1によって血管化される。骨格組織は、細胞の不均一性と構造的複雑さの増加に伴って発症する。軟骨と骨は、同じ骨軟骨葉ゲニター系統から発症し、非常に関連しています。胚軟骨と骨は、筋肉、神経、血管、未分化間感に関連して発症する。軟骨はまた、メッケルの軟骨や下顎骨内の軟骨軟骨などの骨に囲まれていてもよい。これらの組織は解剖学的に関連しており、発達中に細胞外シグナルを介して互いに相互作用する。軟骨および骨の発達における遺伝子発現の研究において、1つの障害は、複数の組織型からなる骨格構造の不均一性である。目的の特定の組織の正確な分離は、転写分析を成功させるために重要です。
レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織内の目的の細胞の種類または領域を分離するための強力なツールであり、再現性があり、単一細胞レベル2に敏感である。これは、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、およびプロテオミクス3、4における幅広い下流アッセイに対して目的の細胞を正確に標的にし、捕捉することができる。単離されたRNA、DNA、またはタンパク質の品質は、バイオアナライザまたは同等のプラットフォームで評価することができます。例えば、RNA品質は、RNA完全性数(RIN)5で示される。
ここでは、新鮮な凍結組織からのLCMによる軟骨および骨の迅速な染色および単離のためのプロトコルを提供する。マウス胚を使用して、このプロトコルがRNAシーケンシング(RNA-seq)などの後続のトランスクリプトミクス解析のために高品質のRNAを生成することを実証します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織から目的の特定の細胞タイプまたは領域を分離するための強力なツールです。骨格要素の細胞および分子複合体は、発達とともに増加する。軟骨および骨の界面や周囲の組織との界面など、組織の不均一性は、軟骨および骨を発達させる研究の障害の1つである。当社のプロトコルは、遺伝子発現解析のための高品質RNAを生み出す軟骨および骨の組織処理および単離の迅速な方法を提供します。マウス胚の新鮮な凍結組織は切り離され、短いクレシルバイオレット染色は、周囲の組織とは異なる色で軟骨および骨を視覚化するために使用される。その後、スライドは急速に脱水され、軟骨と骨はLCMによってその後単離される。このプロセス中の水溶液への暴露の最小化は、RNAの完全性を維持します。E16.5におけるマウスメッケルの軟骨と下顎骨の採取に成功し、遺伝子発現解析により骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞のマーカー遺伝子の微分発現が示された。高品質のRNAはまた、組織および胚性年齢の範囲から単離された。このプロトコルは、低温栓、断面、染色および脱水新鮮な凍結組織を含むLCMのサンプル調製、およびLCMによる軟骨および骨の正確な分離を詳細に説明し、転写分析のための高品質RNAをもたらす。

E16.5の新鮮な凍結マウス組織のコロナセクションは、メッケル軟骨(MC)、結節軟骨、およびLCMによる下顎骨の分離および採取を実証するために使用された。E16.5のマウス胚を解剖し、OCT化合物で極低温型に埋め込んだ。金型中のサンプルをドライアイスおよびメチル-2-ブタン浴中で急速に凍結し、-80°Cで保存した。
軟骨および骨のクレシルスミレ染色を実証するために、コ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

骨格構造の不均一性は、軟骨や骨の発達における遺伝子発現の研究における1つの障害である。このプロトコルは、隣接する組織の正確な分離方法を提供します。後の分析のために高いRNA完全性を維持することにより、これらの組織を正確に収集するために、クレシルバイオレット染色を用いて軟骨および骨のレーザー捕捉マイクロディシスを最適化します。他の組織は、クレシルバイオレットが標的組織の十分な区別を提供し、RNAの品質が我々の処理方法の後に高いままであれば単離することができる。このような組織には、頭蓋顔面縫合と脳が含まれます。クライオセクションングは、このプロトコルの中で最も要求の厳しいスキルです。RNAの最高の完全性を維持するために、組織が迅速に解剖され、埋め込まれていることを確認してください。この手順を開始するには、目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度化合物を使用して使い捨て型にサンプルを埋め込み、試料の向きを先端または針で調整します。サンプルをドライアイスとメチル-2-ブテン浴で迅速に凍結します。次に、ドライアイスを含む蓋付き容器を、ドライアイスにアルミ箔を置き、凍結切断時に解剖サンプルスライドを一時的に保存します。新鮮な凍結標本をドライアイスのバケツに移します。最適な切断温度化合物の層をクライオスタットの標本ホルダーに置き、すぐに穏やかな圧力で最適な切断温度化合物の上に標本を置きます。最適な切断温度化合物が完全に凍結したら、ホルダーに試料を付けて、クライオスタットの切断アームに固定します。サンプルをクライオスタットに15分間放置し、切断温度に平衡させます。その後、12マイクロメートルの厚さで組織を切り離し、PEN膜スライド上のスライスを収集します。膜上の連続したセクションを整列します。スライドが完了したら、セクションを数分間乾燥させ、必要なすべてのスライドが収集されるまでドライアイス容器のホイルにスライドを移します。スライドボックスにマイナス80°Cでスライドを保存します。まず、ラベル付けされた3本の15ミリリットル遠心分離管を用意します。各チューブに80%エタノールの45ミリリットルを加えます。氷の上に3本のチューブを置きます。95%エタノールの45ミリリットルを含むチューブと氷の上に100%エタノールを含むチューブを置きます。次に、室温で50ミリリットルの遠心分離管に45ミリリットルのキシレンを加えます。PEN膜スライドを手袋をした手に当てはめて短時間解凍し、80%エタノールを含む各チューブに30秒間2回洗浄し、最適な切削温度化合物を除去します。次に、スライドをアルミニウム箔のシートの上に置きます。ピペット8ミリリットルの1%クレシルバイオレットと50%エタノールをスライドに、30秒間染色します。80%エタノールを含む第3のチューブでスライドを30秒間洗浄します。95%エタノールを含むチューブを30秒間通してスライドを脱水し、100%エタノールを含むチューブを30秒間、最後に、キシレンを含むチューブを30秒間行う。この後、スライドを繊細なタスクワイパーに5分間置き、キシレンを排水し、セクションを乾燥させます。まず、レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡、レーザー、およびコンピュータをオンにします。コンピュータにログオンし、ソフトウェアを起動します。緑色のライトが点灯したら、赤いボタンを押してレーザーを有効にします。ライトが赤く変わると、レーザーを使用する準備が整います。5 ミリリットル PCR チューブのキャップをコレクターに挿入します。ピペット50マイクロリットルの抽出バッファーをキャップに入れ、収集装置を顕微鏡に挿入します。[コレクター デバイスの変更]ウィンドウで、[参照点に移動]ボタンをクリックして、コレクターを参照点に移動します。フォーカスを調整して、参照点を明確に表示します。次に、ツールバーの左のアンロードボタンをクリックして、スライドホルダを下げます。下向きの組織セクションを持つホルダーにスライドを置き、ホルダーをステージに戻します。変更標本ウィンドウで[続行]をクリックします。レーザーパラメータを設定するには、レーザーメニューの制御オプションを選択するか、レーザーアイコンをクリックします。必要に応じて、次のパラメータを調整し、レーザーのパワーであるパワー、レーザーの幅である絞り、およびドローとカットモードの切断速度である速度を調整します。5Xの目的から始め、関心のある分野を見つけ、関心のある分野を最もよく示す目的に切り替えます。コレクターでマークをクリックして、収集するチューブを選択し、移動を選択し、カットまたはカットを行います。切断が完了すると、PEN膜を有する標的組織は重力によってコレクション管のキャップに落ちる。必要に応じて、この選択と切断プロセスを繰り返して、複数の対象領域をプルします。この後、コレクタをアンロードし、PCRチューブを慎重に閉じます。マイクロディセックした組織をドライアイスの上に置きます。マイクロディセックした組織を室温で解凍し、次に遠心分離機を短時間解凍し、サンプルを摂氏42度で30分間インキュベートします。この後、5ミリリットルPCRチューブに分解液を回転させます。メーカーの指示に従って、RNA分離キットを使用してDNase処理とRNA抽出を行います。本研究では、軟骨および骨の微細切除を最適化したレーザーキャプチャーが行われ、その後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、軟骨および骨を正確に組織採取するために視覚化する迅速な手順におけるクレシルバイオレット染色の使用を強調した。スライドの観察は、検査されたすべての軟骨が染色されたマゼンタであり、すべての鉱物化された組織が茶色または黒色に染色されていることを示しています。軟骨と骨の両方が複数の解剖学的部位で他の組織と容易に区別される。メッケルの軟骨、顆軟骨、下顎骨領域は、レーザー捕捉マイクロディセクショネによって選択され、単離される。シーケンシングに十分なRNAを得るために、メッケルの軟骨の10領域、顆軟骨の10領域、または下顎骨の4つの領域をそれぞれ3つの個別の採取管に引き出す。RNAを抽出し、全体のRNAをバイオアナライザを用いて分析します。このレーザーキャプチャマイクロディスセクションプロトコルは、異なる発達段階で様々な組織に使用され、RNA完全性数測定は、高いRNA品質を示しています。次いで、遺伝子発現の微分解析が行われる。下顎骨とメッケル軟骨の間には4,006個の遺伝子が有意に異なって発現している。骨芽細胞または骨細胞に特異的な遺伝子は下顎骨骨でより高く発現され、軟骨細胞特異的遺伝子はメッケルの軟骨でより高く発現する。さらに、破骨細胞マーカーは下顎骨においてより高く発現し、標的組織の分離に成功したことを示す。この手順に従って、qPCRおよびRNA-seqを含む遺伝子発現解析を行うことができる。これらの方法は、異種組織内の特定の組織または関心のある領域におけるトランスクリプトームの遺伝子発現を解析することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

マウス胎児腎臓の解剖および培養

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

全体のマウス胚における β-ガラクトシダーゼ活性の検出によって遺伝子発現をトレース

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...