Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
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이 작품은 치과 및 두개안면 연구의 국립 연구소 (R01DE022988)와 유니스 케네디 슈리버 국립 아동 건강 및 인간 개발 연구소 (P01HD078233)에 의해 지원되었다. 저자는 마운트 시나이의 아이칸 의과 대학에서 라이카 LMD 6500 플랫폼에 액세스 할 생물 rerepository 및 병리학 코어 감사합니다.

마우스에서 조직은 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 건강 가이드의 국가 학회에 따라 장악되고, 연구 프로토콜은 마운트 시나이에 있는 Icahn 의과 대학에 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 신선한 냉동 표본의 준비
<ol><li>관심 있는 배아 또는 조직을 해부합니다. 최적의 절삭 온도(OCT) 화합물로 일회용 임베딩 금형에 시료를 내장합니다. 팁이?...

LCM은 이질적인 조직에서 농축되거나 균질한 세포 집단의 분리를 가능하게 한다. 그 장점은 생체 내 컨텍스트에서 세포의 신속하고 정확한 캡처를 포함, 잠재적 인 단점은 시간이 소요되는 것을 포함, 비싼, 지정된 샘플 내에서 뚜렷한 하위 집단을 인식하는 사용자에 대한 필요성에 의해 제한30. 이 프로토콜은 마우스 배아 연골과 뼈의 LCM의 세부 사항을 제공, RNA-seq에 의해 ...

근골격계는 근육, 결합 조직, 힘줄, 인대, 연골 및 뼈로 구성된 다성분 시스템으로, 신경에 의해 심이도가 있고혈관에의해 혈관이 혈관에 의해 1. 골격 조직은 증가 세포 이질성 및 구조적 복잡성으로 개발. 연골과 뼈는 동일한 골연방울 감소기 계보에서 개발하고 매우 관련이 있습니다. 배아 연골과 뼈는 근육, 신경, 혈관 및 미분화 중간엽과 관련하여 발생합니다. 연골은 또한 뼈에 의해 포위 될 수있다, 이러한 Meckel의 연골과 하악골 내의 condylar 연골 등. 이 조직은 해부학적으로 연관되고 발달 도중 세포외 신호를 통해 서로 상호 작용합니다. 연골과 뼈의 발달에 있는 유전자 발현의 연구 결과에서, 1개의 장애물은 다중 조직 모형으로 구성된 골격 구조물의 이질성입니다. 관심 있는 특정 조직의 정밀한 분리는 성공적인 전사 분석을 위한 열쇠입니다.
레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이기종 조직 내의 세포 유형 또는 관심 영역을 분리하는 강력한 도구이며 재현 가능하며 단일 세포 수준2에민감합니다. 전사학, 유전체학 및 프로테오믹스3,4에서광범위한 하류 검소에 대한 관심 있는 세포를 정밀하게 표적화하고 포획할 수 있다. 단리된 RNA, DNA, 또는 단백질의 질은 바이오분석기 또는 동등한 플랫폼으로 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA 품질은 RNA 무결성 번호(RIN)5로표시됩니다.
여기에서, 우리는 신선한 냉동 조직에서 LCM에 의한 연골과 뼈의 신속한 염색 및 격리를위한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 마우스 배아를 사용하여 이 프로토콜이 RNA 시퀀싱(RNA-seq)과 같은 후속 전사분석을 위해 고품질 RNA를 산출한다는 것을 입증합니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

레이저 포획 미세 해부 (LCM)는 이질적인 조직에서 특정 세포 모형 또는 관심 있는 지구를 격리하는 강력한 공구입니다. 골격 원소의 세포 및 분자 복잡성은 발달과 함께 증가합니다. 조직 이질성, 같은 서로 또는 주변 조직과 연골 및 골변 요소의 계면에서, 연골과 뼈를 개발하는 연구에 하나의 장애물이다. 당사의 프로토콜은 유전자 발현 분석을 위해 고품질 RNA를 산출하는 연골과 뼈의 조직 처리 및 격리의 신속한 방법을 제공합니다. 마우스 배아의 신선한 냉동 조직은 단면화되고 짧은 크레실 바이올렛 염색은 주변 조직과 구별되는 색상으로 연골과 뼈를 시각화하는 데 사용됩니다. 슬라이드는 다음 빠르게 탈수, 연골과 뼈는 LCM에 의해 이후에 격리. 이 프로세스 동안 수성 솔루션에 대한 노출을 최소화하면 RNA 무결성이 유지됩니다. 마우스 메켈의 연골과 E16.5에서 하악골이 성공적으로 수집되었고 유전자 발현 분석은 조골세포, 골세포, 골세포 및 연골세포에 대한 마커 유전자의 차등 발현을 보여주었다. 고품질 RNA는 또한 다양한 조직 및 배아 시대로부터 분리되었다. 이 프로토콜은 냉동, 절제, 염색 및 탈수를 포함한 LCM에 대한 샘플 준비를 자세히 설명하며, LCM에 의한 연골과 뼈의 정밀한 분리는 전사분석을 위한 고품질 RNA를 생성합니다.

E16.5에서 신선한 냉동 마우스 조직의 코로나 섹션은 Meckel의 연골 (MC), condylar 연골 및 LCM에 의한 하악골의 격리 및 수집을 입증하는 데 사용되었습니다. E16.5에서 마우스 배아는 OCT 화합물을 가진 극저온 형에 해부되고 매립되었다. 금형의 시료를 드라이 아이스 및 메틸-2-부탄 배스에서 급속히 동결시키고 -80°C에서 보관하였다.
연골과 뼈의 크레실 바이올렛 염색을 입증하기 위...

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Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

이 프로토콜은 마우스 배아의 신선한 냉동 섹션에서 연골과 뼈의 분리를 위한 레이저 포획 미세 분부를 설명합니다. 연골과 뼈는 크레실 바이올렛 염색에 의해 빠르게 시각화되고 전사분석을 위한 고품질 RNA를 산출하기 위하여 정확하게 집합될 수 있습니다.

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

골격 구조의 이질성은 연골과 뼈를 개발하는 유전자 발현을 연구하는 데 하나의 장애물입니다. 이 프로토콜은 인접하지만 다른 조직의 정밀한 격리방법을 제공합니다. 당사는 크레실 바이올렛 스테인링을 사용하여 연골및 뼈에 대한 레이저 포획 마이크로디스섹션을 최적화하여 후속 분석을 위해 높은 RNA 무결성을 유지하여 정확한 수집을 위해 이러한 조직을 시각화합니다.크레실 바이올렛이 표적 조직의 충분한 구별을 제공하고 RNA 품질이 우리의 처리 방법 후에 높게 남아 있는 경우에 그밖 조직은 격리될 수 있습니다. 이러한 조직은 두개안 면봉과 뇌를 포함한다. 극저온 절제는 이 프로토콜에서 가장 까다로운 기술입니다.RNA의 최고 무결성을 유지하기 위해 조직이 해부되고 빠르게 내장되어 있는지 확인하십시오. 이 절차를 시작하려면 관심있는 태아 또는 조직을 해부하십시오. 최적의 절삭 온도 화합물과 일회용 포함 금형에 샘플을 포함하고, 팁 이나 바늘로 시편의 방향을 조정.드라이 아이스와 메틸-2-부틴 목욕에서 샘플을 신속하게 동결합니다. 다음으로, 냉동 절제 시 해부 샘플 슬라이드를 임시보관하기 위해 건조 얼음에 알루미늄 호일 시트를 배치하여 드라이 아이스가 있는 뚜껑이 달린 용기를 준비합니다. 신선한 냉동 표본을 드라이 아이스 버킷으로 옮기습니다.최적의 절삭 온도 화합물층을 극저온 시편 홀더에 놓고, 시편을 부드러운 압력으로 최적의 절삭 온도 화합물 위에 즉시 놓습니다. 최적의 절삭 온도 화합물이 완전히 동결되면 표본으로 홀더를 냉동 암절단 암에 고정시하십시오. 샘플을 15분 동안 냉동에 두어 절단 온도에 상형화합니다.그런 다음 조직을 12 마이크로미터 두께로 섹션화하고 PEN 멤브레인 슬라이드에서 슬라이스를 수집합니다. 멤브레인에 연속 섹션을 정렬합니다. 슬라이드가 완료되면 섹션이 몇 분 동안 건조한 다음 필요한 모든 슬라이드가 수집될 때까지 슬라이드를 드라이 아이스 용기의 호일로 옮기도록 합니다.슬라이드 상자에 영하 80도의 슬라이드를 저장합니다. 시작하려면 15밀리리터 원심분리관으로 표시된 3개의 원심분리관을 준비하십시오. 각 튜브에 80%에탄올의 45밀리리터를 추가합니다.얼음에 튜브 3개를 놓습니다. 95%에탄올의 45밀리리터가 들어 있는 튜브와 얼음 위에 100%에탄올이 들어 있는 튜브를 놓습니다. 다음으로 실온에서 50밀리리터 원심분리기 튜브에 45밀리리터의 자일렌을 추가합니다.펜 멤브레인 슬라이드를 장갑에 대고 짧게 해동하고, 최적의 절삭 온도 화합물을 제거하기 위해 교반으로 80 %에탄올을 포함하는 각 튜브에서 30 초 동안 두 번 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 알루미늄 호일 시트에 놓습니다. 파이펫 8 밀리리터 1% 크레실 바이올렛과 50% 에탄올을 슬라이드와 스테인에 30초 동안 장착합니다.80%에탄올을 함유한 세 번째 튜브에서 슬라이드를 30초 동안 세척합니다. 30초 동안 95%에탄올을 함유한 튜브를 통과하여 슬라이드를 탈수하고, 30초 동안 100% 에탄올을 함유한 튜브를 30초 동안, 마지막으로 자일렌을 함유하는 튜브를 30초 동안 탈수한다. 그 후, 미끄러를 섬세한 작업 와이퍼에 5분간 배치하여 자일렌이 배수하고 단면을 건조시키도록 합니다.먼저 레이저 포획 미세 절 현미경, 레이저 및 컴퓨터를 켭니다. 컴퓨터에 로그온하고 소프트웨어를 시작합니다. 녹색 표시등이 켜지면 빨간색 버튼을 눌러 레이저를 활성화합니다.표시등이 빨간색으로 바뀌면 레이저를 사용할 준비가 되었습니다. 5 밀리리터 PCR 튜브의 캡을 수집가에 삽입합니다. 피펫 50 마이크로리터추출 버퍼는 캡에 넣고 수집 장치를 현미경에 삽입합니다.변경 수집기 장치 창에서 참조 점 버튼으로 이동을 클릭하여 수집기를 참조점으로 이동합니다. 기준점을 명확하게 보려면 초점을 조정합니다. 다음으로 도구 모음의 왼쪽 언로드 버튼을 클릭하여 슬라이드 홀더를 낮춥춥니까.슬라이드를 아래쪽을 향하여 홀더에 넣고 홀더를 다시 스테이지에 삽입합니다. 변경 표본 창에서 계속하려면 클릭합니다. 레이저 매개 변수를 설정하려면 레이저 메뉴의 제어 옵션을 선택하거나 레이저 아이콘을 클릭합니다.레이저의 힘인 필요에 따라 다음 매개 변수를 조정, 레이저의 힘인 파워, 레이저의 폭인 조리개, 그리고 속도, 이는 그리기 및 절단 모드에서 절삭 속도입니다. 5X 목표로 시작하여 관심 영역을 찾고 관심 영역을 가장 잘 보여주는 목표로 전환합니다. 수집가의 마크를 클릭하여 수집튜브를 선택한 다음 이동 및 잘라내기 및 잘라냅니다.절단이 완료되면 PEN 멤브레인을 사용하는 대상 조직이 중력에 의해 수집 튜브의 캡에 빠지게 됩니다. 이 선택 및 절단 프로세스를 반복하여 필요한 경우 여러 관심 영역을 가져옵니다. 이 후 수집기의 하중을 내리고 PCR 튜브를 조심스럽게 닫습니다.미세 한 분은 마른 얼음에 배치합니다. 실온에서 미세 한 분부를 해동한 다음 원심 분리기를 간략하게 해동하고 샘플을 섭씨 42도에서 30 분 동안 배양하십시오. 그 후, 5 밀리리터 PCR 튜브로 lysis 버퍼를 회전.제조업체의 지시에 따라 RNA 격리 키트를 사용하여 DNase 치료 및 RNA 추출을 수행합니다. 이 연구에서는 연골과 뼈의 최적화된 레이저 포획 미세 절제가 수행되며, 후속 분석을 위해 높은 RNA 무결성을 유지하면서 정확한 조직 수집을 위해 연골과 뼈를 시각화하는 빠른 절차에서 크레실 바이올렛 염색의 사용을 강조합니다. 슬라이드의 관찰은 검사된 모든 연골이 얼룩진 마젠타이며, 모든 미네랄화된 조직은 갈색 또는 검은색으로 얼룩진 것을 보여줍니다.연골과 뼈 는 여러 해부학 적 부위의 다른 조직과 쉽게 구별됩니다. 메켈의 연골, 연골 및 하악 골 영역은 레이저 포획 미세 절에 의해 선택되고 격리됩니다. 시퀀싱을 위한 충분한 RNA를 얻으려면, 메켈의 연골 10개 영역, 10개의 연골 영역 또는 하악골 의 4개 부위를 각각 3개의 개별 수집 튜브로 끌어들입니다.RNA는 그 때 추출되고, 총 RNA는 생물 분석기를 사용하여 분석됩니다. 이 레이저 포획 마이크로디스섹션 프로토콜은 다양한 발달 단계에서 다양한 조직에서 사용되며 RNA 무결성 수 측정은 높은 RNA 품질을 나타냅니다. 차동 유전자 발현 분석은 그 때 수행된다.하악뼈와 메켈의 연골 사이에는 4, 006개의 유전자가 현저히 다르게 표현되어 있습니다. 골세포 또는 골세포에 특이적인 유전자는 하악뼈에서 더 높게 표현되는 반면 연골 세포 특이적 유전자는 Meckel의 연골에서 더 높게 표현된다. 또한, 골세포 마커는 하악 뼈에서 더 높게 표현되어 표적 조직의 성공적인 격리를 나타냅니다.이러한 절차에 따라 qPCR 및 RNA-seq를 포함한 유전자 발현 분석을 수행할 수 있다. 이러한 방법은 이질적인 조직 내의 특정 조직 또는 관심 영역에서 전사의 유전자 발현을 분석할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

마우스 배아 신장의 해부 및 배양

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...