Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Dental and Kraniofacial Research (R01DE022988) og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child helse og Human Development (P01HD078233). Forfatterne takker Biorepository og patologi Core for tilgang til Leica LMD 6500-plattformen ved Icahn School of Medicine ved Sinai-fjellet.

Vev fra mus ble innhentet i samsvar med National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr, og studere protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. tilberedning av fersk frossen prøve
<ol><li>Analysere embryo eller vev av interesse. Embed prøven i en disponibel embedding mold med optimal skjæring temperatur (OCT) sammensatte. Juster retningen på prøven med et tips eller en nål.</li>
	<li...

LCM muliggjør isolering av beriket eller homogen celle populasjoner fra heterogene vev. Dens fordeler inkluderer rask og presis fangst av celler i sin in vivo sammenheng, mens potensielle ulemper inkluderer det er tidkrevende, dyrt, og begrenset av behovet for brukeren å gjenkjenne distinkte subpopulasjoner innenfor et spesifisert eksempel30. Denne protokollen gir detaljer om LCM av mus embryonale brusk og bein, fremhever bruken av cresyl fiolett farging i en rask prosedyre for å visua...

Muskel-og skjelettsystemet er et multikomponent system sammensatt av muskler, bindevev, sene, leddbånd, brusk, og bein, innervated av nerver og vascularized av blodkar1. Den skjelettlidelser vev utvikle med økende cellulære heterogenitet og strukturelle kompleksitet. Brusk og bein utvikler seg fra samme osteochondroprogenitor avstamning og er svært beslektet. Embryonale brusk og bein utvikle i samarbeid med muskler, nerver, blodkar, og udifferensierte mesenchyme. Brusk kan også være omgitt av bein, slik som Horst ' s brusk og kondylære brusk innenfor søvnapnéskinne benet. Disse vev er anatomisk assosiert og samhandle med hverandre gjennom ekstracellulære signaler under utvikling. I studiet av genuttrykk i utviklingen av brusk og bein, er en hindring heterogenitet av skjelett konstruksjoner sammensatt av flere typer vev. Presis isolering av den spesifikke vev av interesse er nøkkelen for vellykket transcriptional analyse.
Laser Capture microdissection (LCM) er et kraftig verktøy for å isolere celletyper eller områder av interesse innenfor heterogene vev, og er reproduserbar og er følsom for enkelt cellenivå2. Det kan presist målrette og fange celler av interesse for et bredt spekter av nedstrøms analyser i transcriptomics, Genomics, og Proteomikk3,4. Kvaliteten på den isolerte RNA, DNA, eller protein kan vurderes med en bioanalyzer eller tilsvarende plattform. RNA-kvalitet indikeres for eksempel med RNA-nummeret (-)5.
Her gir vi en protokoll for den raske farging og isolering av brusk og bein av LCM fra fersk frosset vev. Vi bruker musen embryo å demonstrere at denne protokollen gir høy kvalitet RNA for påfølgende transcriptomic analyse, slik som RNA sekvensering (RNA-SEQ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Laser Capture microdissection (LCM) er et kraftig verktøy for å isolere bestemte celletyper eller områder av interesse fra heterogene vev. Den cellulære og molekylære kompleksiteten av skjelett elementer øker med utviklingen. Tissue heterogenitet, slik som i grensesnittet av cartilaginous og fluorose elementer med hverandre eller med omkringliggende vev, er en hindring for studiet av å utvikle brusk og bein. Vår protokoll gir en rask metode for vevs behandling og isolering av brusk og bein som gir høy kvalitet RNA for analyse av genuttrykk. Fersk frosset vev av mus embryo er delt og korte cresyl fiolett farging brukes til å visualisere brusk og bein med farger skiller fra omkringliggende vev. Slides blir så raskt dehydrert, og brusk og bein er isolert senere av LCM. Minimering av eksponering for vandige oppløsninger under denne prosessen opprettholder RNA-integriteten. Mouse Horst ' s brusk og søvnapnéskinne bein på E 16.5 ble vellykket samlet og genuttrykk analyse viste differensial uttrykk for markør gener for osteoblaster, osteocytter, osteoklaster, og chondrocytes. Høy kvalitet RNA ble også isolert fra en rekke vev og embryonale aldre. Denne protokoll detaljer prøveforberedelse for LCM inkludert cryoembedding, skjæring, farging og dehydrating friskt frosset vev, og presis isolering av brusk og bein av LCM resulterer i høy kvalitet RNA for transcriptomic analyse.

Koronale deler av fersk frossen mus vev på E 16.5 ble brukt til å demonstrere isolasjon og samling av Horst ' s brusk (MC), kondylære brusk, og søvnapnéskinne bein av LCM. Mouse embryo på E 16.5 var dissekert og innebygd i kryogene muggsopp med OCT sammensatte. Prøver i muggsopp ble raskt frosset i en tørr is og methyl-2-butan bad og lagret ved-80 ° c.
Å demonstrere cresyl fiolett farging av brusk og bein, kryosnitt i koronale flyet ble utført og prøvene ble samlet på mikroskop ly...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Denne protokollen beskriver laser fangst microdissection for isolering av brusk og bein fra friske frosne deler av musen embryo. Brusk og bein kan raskt visualisere av cresyl fiolett farging og samlet nettopp for å gi høy kvalitet RNA for transcriptomic analyse.

Laser Capture Microdissection av mus embryonale brusk og bein for Gene Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Heterogeniteten til skjelettstrukturer er et hinder for å studere genuttrykket i utviklingen av brusk og bein. Denne protokollen gir en metode for presis isolering av tilstøtende, men forskjellige vev. Vi optimaliserer laserfangstmikrodisseksjonen for brusk og benet ved hjelp av cresylfiolett farging for å visualisere disse vevene for presis innsamling ved å opprettholde høy RNA-integritet for senere analyse.Andre vev kan isoleres hvis cresyl violet gir tilstrekkelig forskjell av målvev og RNA-kvaliteten forblir høy etter vår behandlingsmetode. Slike vev inkluderer kraniofaciale suturer og hjerne. Kryoseksjon er den mest krevende ferdigheten i denne protokollen.Sørg for at vevet dissekeres og bygges inn raskt for å opprettholde den høyeste integriteten til RNA. For å begynne denne prosedyren, dissekere embryoet eller vevet av interesse. Bygg inn prøven i en engangsinnbyggingsform med optimal skjæretemperaturforbindelse, og juster retningen på prøven med en spiss eller nål.Frys raskt prøvene i tørris og metyl-2-buten bad. Deretter forbereder du en lokket beholder med tørris ved å plassere et ark med aluminiumsfolie på tørrisen for midlertidig lagring av disseksjonsprøvesklier under kryoseksjon. Overfør den ferske frosne prøven inn i bøtte med tørris.Plasser et lag med optimal skjæretemperaturforbindelse på en kryostatprøveholder, og plasser umiddelbart prøven på toppen av den optimale skjæretemperaturforbindelsen med mildt trykk. Når den optimale skjæretemperaturforbindelsen er helt frosset, fest holderen med prøven inn i kryostatkuttearmen. La prøven stå i kryostaten i 15 minutter for å likevekte den til skjæretemperaturen.Deretter deler du vevet med en tykkelse på 12 mikrometer og samler skivene på PEN-membransklier. Juster etterfølgende seksjoner på membranen. Når lysbildet er fullført, la seksjonene tørke i noen minutter, og overfør deretter lysbildet til folien i tørrisbeholderen til alle nødvendige lysbilder samles inn.Lagre lysbildene på minus 80 grader Celsius i en lysbildeboks. Til å begynne med, forberede tre merkede 15 milliliter sentrifuge rør. Tilsett 45 milliliter med 80% etanol til hvert rør.Legg tre rør på is. Plasser et rør som inneholder 45 milliliter med 95% etanol og et rør som inneholder 100% etanol på is. Deretter legger du til 45 milliliter xylen til et 50 milliliter sentrifugerør ved romtemperatur.Tin en PEN membran glir kort ved å plassere den mot en hanskehånd, og vask den to ganger i 30 sekunder i hvert av rørene som inneholder 80% etanol med agitasjon for å fjerne den optimale skjæretemperaturforbindelsen. Deretter legger lysbildet på et ark med aluminiumsfolie. Pipette 8 milliliter på 1% cresyl fiolett og 50% etanol på lysbildet og flekken i 30 sekunder.Vask lysbildet i det tredje røret som inneholder 80% etanol i 30 sekunder. Dehydrere lysbildet ved å passere den gjennom røret som inneholder 95% etanol i 30 sekunder, røret som inneholder 100% etanol i 30 sekunder, og til slutt røret inneholder xylen i 30 sekunder. Etter dette plasserer du lysbildene på en delikat oppgavevisker i fem minutter for å la xylen renne og la seksjonene tørke.Slå først på laserfangstmikrosisseksjonsmikroskopet, laseren og datamaskinen. Logg på datamaskinen og start programvaren. Når det grønne lyset er på, trykker du på den røde knappen for å aktivere laseren.Når lyset blir rødt, er laseren klar til bruk. Sett hetten på et 5 milliliter PCR-rør inn i oppsamleren. Pipette 50 mikroliter ekstraksjonsbuffer i hetten og sett oppsamlingsenheten inn i mikroskopet.I vinduet for endringsinnsamlingsenhet klikker du på flytt til referansepunktknappen for å flytte samleren til referansepunktet. Juster fokuset for å vise referansepunktet tydelig. Deretter klikker du på venstre utlastingsknapp på verktøylinjen for å senke lysbildeholderen.Plasser skyv inn i holderen med vevseksjonen vendt nedover, og sett holderen tilbake i scenen. Klikk fortsett i endringsprøvevinduet. For å sette opp laserparametrene, velg kontrollalternativet til lasermenyen eller klikk på laserikonet.Juster følgende parametere etter ønske, kraft, som er kraften i laseren, blenderåpningen, som er bredden på laseren, og hastighet, som er skjærehastigheten i tegne- og kuttmodus. Start med et 5X-mål for å finne interesseområdene, og bytt til målet som best viser interesseområdet. Velg røret for innsamling ved å klikke merket på samleren, og velg deretter flytte og klippe eller tegne og klippe.Når kuttet er fullført, vil målvevet med PEN-membran falle inn i hetten på oppsamlingsrøret ved tyngdekraften. Gjenta dette valget og kutteprosessen for å trekke flere områder av interesse om nødvendig. Etter dette, losse samleren og forsiktig lukke PCR-røret.Plasser mikrodissected vev på tørris. Tin mikrodissected vev ved romtemperatur, deretter sentrifuge kort, og inkuber prøvene ved 42 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette spinner du lysisbufferen ned i det 5 milliliters PCR-røret.Utfør DNase-behandling og RNA-ekstraksjon ved hjelp av et RNA-isolasjonssett, i følge produsentens instruksjoner. I denne studien utføres en optimalisert laserfangst mikrodisseksjon av brusk og bein, og fremhever bruken av cresylfiolett farging i en rask prosedyre for å visualisere brusk og bein for presis vevssamling samtidig som høy RNA-integritet opprettholdes for senere analyse. Observasjon av lysbildene viser at alle brusk undersøkt er farget magenta, og alle mineraliserte vev er farget brun eller svart.Både brusk og bein skiller seg lett fra andre vev på flere anatomiske steder. Meckels brusk, kondylarbrusk og mandibulære beinområder er valgt og isolert av laserfangst mikrodisseksjon. For å oppnå tilstrekkelig RNA for sekvensering, trekk 10 regioner av Meckels brusk, 10 regioner kondylarbrusk eller fire regioner med mandibulært bein i henholdsvis tre individuelle oppsamlingsrør.RNA blir deretter hentet ut, og den totale RNA analyseres ved hjelp av en bioanalyzer. Denne laserfangst mikrodisseksjonsprotokollen brukes på ulike vev på ulike utviklingsstadier, og RNA integritetsnummermålinger indikerer høy RNA-kvalitet. Differensial genuttrykksanalyse utføres deretter.Det er 4006 gener betydelig og forskjellig uttrykt mellom mandibulær bein og Meckel brusk. Gener som er spesifikke for osteoblaster eller osteocytter er mer høyt uttrykt i mandibulært bein, mens kondrocytterspesifikke gener er mer uttrykt i Meckels brusk. I tillegg er osteoklalastmarkører mer høyt uttrykt i mandibulærbenet, noe som indikerer vellykket isolering av målrettet vev.Etter denne prosedyren kan genuttrykksanalyse, inkludert qPCR og RNA-seq, utføres. Disse metodene kan analysere genuttrykk av transkripsjonen i spesifikke vev eller områder av interesse innen heterogent vev.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Culture of Embryonale Mus Cochlea eksplanter og Gene Transfer ved Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av chondrocyttransplantasjon innskyting og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonic Meckels Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal Bestilling av Dynamic Expression data fra Detaljert Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Disseksjon og kultur av musens embryonale nyre

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolasjon og farging av mus Skin keratinocytter for celle syklus spesifikk analyse av Cellular protein uttrykk ved Mass flowcytometri

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...