Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (R01DE022988) e pelo Instituto Nacional eunice Kennedy Shriver de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (P01HD078233). Os autores agradecem ao Núcleo de Biorepositório e Patologia pelo acesso à plataforma Leica LMD 6500 na Escola de Medicina Icahn, no Monte Sinai.

Tecidos de camundongos foram obtidos de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, e protocolos de estudo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee da Icahn School of Medicine no Monte Sinai.
1. Preparação de espécime congelado fresco
<ol><li>Dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorporar a amostra em um molde de incorporação descartável com temperatura de corte ideal (OCT) composto. Ajuste a orientação ...

O LCM permite o isolamento de populações de células enriquecidas ou homogêneas de tecidos heterogêneos. Suas vantagens incluem a captura rápida e precisa de células em seu contexto in vivo, enquanto as desvantagens potenciais incluem que seja demorado, caro e limitado pela necessidade de o usuário reconhecer subpopulações distintas dentro de uma amostra especificada30. Este protocolo fornece detalhes de LCM da cartilagem embrionária do rato e do osso, destacando o uso da mancha...

O sistema musculoesquelético é um sistema multicomponente composto de músculo, tecido conjuntivo, tendão, ligamento, cartilagem e osso, interno e vascularizado pelos vasos sanguíneos1. Os tecidos esqueléticos desenvolvem-se com o aumento da heterogeneidade celular e complexidade estrutural. Cartilagem e osso se desenvolvem a partir da mesma linhagem osteochondroprogenitor e são altamente relacionados. Cartilagem embrionária e osso se desenvolvem em associação com músculos, nervos, vasos sanguíneos e mesenchyme indiferenciado. A cartilagem também pode ser cercada por ossos, como a cartilagem de Meckel e cartilagem condylar dentro do osso mandibular. Estes tecidos são anatomicamente associados e interagem uns com os outros através de sinais extracelulares durante o desenvolvimento. No estudo da expressão gênica no desenvolvimento de cartilagem e osso, um obstáculo é a heterogeneidade de estruturas esqueléticas compostas por múltiplos tipos de tecido. O isolamento preciso do tecido específico de interesse é fundamental para uma análise transcricional bem-sucedida.
A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos de células ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos, e é reproduzível e é sensível ao nível de célula única2. Ele pode precisamente alvo e capturar células de interesse para uma ampla gama de ensaios a jusante em transcriptômica, genômica e proteômica3,4. A qualidade do RNA, DNA ou proteína isolado pode ser avaliada com um bioanalisador ou plataforma equivalente. Por exemplo, a qualidade do RNA é indicada pelo número de integridade do RNA (RIN)5.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para a coloração rápida e isolamento da cartilagem e osso por LCM de tecidos congelados frescos. Usamos o embrião do camundongo para demonstrar que este protocolo produz RNA de alta qualidade para análise transcriptômica subsequente, como sequenciamento de RNA (RNA-seq).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

A microdissecção de captura a laser (LCM) é uma ferramenta poderosa para isolar tipos específicos de células ou regiões de interesse de tecidos heterogêneos. A complexidade celular e molecular de elementos esqueléticos aumenta com o desenvolvimento. A heterogeneidade tecidual, como na interface de elementos cartilaginosos e osseos uns com os outros ou com tecidos circundantes, é um obstáculo para o estudo do desenvolvimento de cartilagem e osso. Nosso protocolo fornece um método rápido de processamento de tecidos e isolamento de cartilagem e osso que produz RNA de alta qualidade para análise de expressão gênica. Os tecidos congelados frescos de embriões do rato são seccionados e a mancha violeta breve do cresyl é usada para visualizar a cartilagem e o osso com as cores distintas dos tecidos circunvizinhos. Slides são então rapidamente desidratados, e cartilagem e osso são isolados posteriormente por LCM. A minimização da exposição a soluções aquosas durante este processo mantém a integridade do RNA. A cartilagem e osso mandibular do rato Meckel na E16.5 foram coletados com sucesso e a análise da expressão gênica mostrou expressão diferencial de genes marcadores para osteoblastos, osteócitos, osteoclastos e condrocitos. O RNA de alta qualidade também foi isolado de uma variedade de tecidos e idades embrionárias. Este protocolo detalha a preparação da amostra para LCM que inclui o cryoembedding, seção, coloração e desidratação de tecidos congelados frescos, e a isolação precisa da cartilagem e do osso por LCM tendo por resultado o RNA de alta qualidade para a análise transcriptomic.

As seções coronais de tecidos frescos do rato congelado em E16.5 foram usadas para demonstrar a isolação e a coleção da cartilagem de Meckel (MC), da cartilagem condylar, e do osso mandibular por LCM. Embriões de camundongos na E16.5 foram dissecados e embutidos em moldes criogênicos com composto OCT. As amostras nos moldes foram congeladas ràpida em um gelo seco e em um banho metil-2-butano e armazenadas em -80 °C.
Para demonstrar a coloração violeta do cresyl da cartilagem e do o...

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Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Este protocolo descreve a microdissecção da captação do laser para a isolação da cartilagem e do osso das seções congeladas frescas do embrião do rato. Cartilagem e osso podem ser rapidamente visualizados por manchas violetas cresyl e coletados precisamente para produzir RNA de alta qualidade para análise transcriptômica.

Microdissecção de captura a laser da cartilagem embrionária do rato e osso para análise de expressão gênica

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

A heterogeneidade das estruturas esqueléticas é um obstáculo no estudo da expressão genética no desenvolvimento de cartilagem e osso. Este protocolo fornece um método para o isolamento preciso de tecidos adjacentes, mas diferentes. Otimizamos a microdisseção de captura a laser para cartilagem e o osso usando coloração violeta de cresílico para visualizar esses tecidos para coleta precisa, mantendo alta integridade de RNA para análise posterior.Outros tecidos podem ser isolados se a violeta de cresilho fornecer distinção suficiente do tecido alvo e a qualidade do RNA permanecer alta após nosso método de processamento. Tais tecidos incluem suturas craniofaciais e cérebro. Cryosectioning é a habilidade mais exigente neste protocolo.Certifique-se de que o tecido é dissecado e incorporado rapidamente para manter a mais alta integridade do RNA. Para iniciar este procedimento, dissecar o embrião ou tecido de interesse. Incorpore a amostra em um molde descartável de incorporação com o composto de temperatura de corte ideal, e ajuste a orientação da amostra com uma ponta ou agulha.Congele rapidamente as amostras em um gelo seco e banho de metil-2-buteno. Em seguida, prepare um recipiente com gelo seco colocando uma folha de alumínio no gelo seco para armazenamento temporário de lâminas de amostra de dissecção durante a criosectioning. Transfira o espécime congelado fresco para o balde de gelo seco.Coloque uma camada de composto de temperatura de corte ideal em um suporte de espécime criostat, e coloque imediatamente o espécime em cima do composto de temperatura de corte ideal com pressão suave. Quando o composto de temperatura de corte ideal estiver completamente congelado, aperte o suporte com o espécime no braço de corte criostat. Deixe a amostra no criostat por 15 minutos para equilibrá-la à temperatura de corte.Em seguida, se sectionie o tecido com uma espessura de 12 micrômetros e colete as fatias em lâminas de membrana PEN. Alinhe seções consecutivas na membrana. Uma vez que o slide esteja concluído, deixe as seções secarem por alguns minutos e, em seguida, transfira o slide para a folha no recipiente de gelo seco até que todas as lâminas necessárias sejam coletadas.Armazene os slides a menos 80 graus Celsius em uma caixa de slides. Para começar, prepare três tubos de centrífuga de 15 mililitros rotulados. Adicione 45 mililitros de 80% de etanol a cada tubo.Coloque três tubos no gelo. Coloque um tubo contendo 45 mililitros de 95% de etanol e um tubo contendo 100% de etanol no gelo. Em seguida, adicione 45 mililitros de xileno a um tubo de centrífuga de 50 mililitros à temperatura ambiente.Descongele uma membrana PEN deslize brevemente colocando-a contra uma mão enluvada, e lave-a duas vezes por 30 segundos em cada um dos tubos contendo 80% de etanol com agitação para remover o composto de temperatura de corte ideal. Em seguida, coloque o slide em uma folha de papel alumínio. Pipeta 8 mililitros de 1%de cresito violeta e 50% de etanol no escorregador e mancha por 30 segundos.Lave o slide no terceiro tubo contendo 80% de etanol por 30 segundos. Desidratar o slide passando-o pelo tubo contendo 95% de etanol por 30 segundos, o tubo contendo 100% de etanol por 30 segundos e, finalmente, o tubo contendo xileno por 30 segundos. Depois disso, coloque os slides em um delicado limpador de tarefas por cinco minutos para deixar o xileno drenar e permitir que as seções sequem.Primeiro, ligue o microscópio de microdisseção de captura a laser, laser e computador. Faça logon no computador e inicie o software. Quando a luz verde estiver acesa, pressione o botão vermelho para ativar o laser.Quando a luz fica vermelha, o laser está pronto para usar. Insira a tampa de um tubo PCR de 5 mililitros no coletor. Pipeta 50 microlitros de tampão de extração na tampa e insira o dispositivo de coleta no microscópio.Na janela do dispositivo de coletor de alterações, clique no botão mover para referenciar o botão ponto de referência para mover o coletor para o ponto de referência. Ajuste o foco para visualizar claramente o ponto de referência. Em seguida, clique no botão de descarga à esquerda na barra de ferramentas para baixar o suporte de slides.Coloque o slide no suporte com a seção do tecido voltada para baixo e insira o suporte de volta ao estágio. Clique para continuar na janela do espécime de alteração. Para configurar os parâmetros de laser, selecione a opção de controle do menu laser ou clique no ícone laser.Ajuste os seguintes parâmetros conforme desejado, potência, que é a potência do laser, abertura, que é a largura do laser, e velocidade, que é a velocidade de corte no modo de saque e corte. Comece com um objetivo 5X para encontrar as áreas de interesse, e mudar para o objetivo que melhor mostra a área de interesse. Escolha o tubo para coleta clicando na marca no coletor, em seguida, escolha mover e cortar ou desenhar e cortar.Uma vez que o corte é concluído, o tecido alvo com membrana PEN cairá na tampa do tubo de coleta por gravidade. Repita este processo de seleção e corte para puxar várias áreas de interesse, se necessário. Depois disso, descarregue o coletor e feche cuidadosamente o tubo PCR.Coloque os tecidos microdissectados em gelo seco. Descongele os tecidos microdissectados à temperatura ambiente, depois centrífuga brevemente, e incuba as amostras a 42 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, gire o tampão de lise para baixo no tubo PCR de 5 mililitros.Realize o tratamento DNase e extração de RNA usando um kit de isolamento de RNA, seguindo as instruções do fabricante. Neste estudo, é realizada uma microdisseção otimizada de captura a laser de cartilagem e osso, destacando o uso de manchas violetas de cresílo em um procedimento rápido para visualizar cartilagem e osso para coleta precisa de tecidos, mantendo alta integridade do RNA para análise subsequente. A observação dos slides mostra que todas as cartilagens examinadas são magenta manchadas, e todos os tecidos mineralizados estão manchados de marrom ou preto.Tanto a cartilagem quanto o osso são facilmente distinguidos de outros tecidos em múltiplos sítios anatômicos. A cartilagem de Meckel, a cartilagem condílar e as regiões ósseas mandibulares são selecionadas e isoladas por microdisseção de captura a laser. Para obter RNA suficiente para sequenciamento, puxe 10 regiões da Cartilagem de Meckel, 10 regiões de cartilagem condílar, ou quatro regiões de osso mandibular em três tubos de coleta individuais, respectivamente.O RNA é então extraído, e o RNA total é analisado usando um bioanalílise. Este protocolo de microdissecção de captura a laser é usado em vários tecidos em diferentes estágios de desenvolvimento, e as medidas do número de integridade do RNA indicam alta qualidade de RNA. A análise diferencial da expressão genética é então realizada.Existem 4.006 genes expressados de forma significativa e diferente entre o osso mandibular e a Cartilagem de Meckel. Genes específicos para osteoblastos ou osteocitos são mais expressos no osso mandibular, enquanto genes específicos do condrócito são mais expressos na Cartilagem de Meckel. Além disso, os marcadores osteoclasta são mais expressos no osso mandibular, indicando isolamento bem sucedido dos tecidos alvo.Após este procedimento, pode ser realizada a análise da expressão genética, incluindo qPCR e RNA-seq. Esses métodos podem analisar a expressão genética do transcriptome em tecidos específicos ou regiões de interesse dentro de tecidos heterogêneos.

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

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