Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным институтом стоматологических и краниофациальных исследований (R01DE022988) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD078233) и Национальным институтом здоровья детей и развития человека (P01HD07823). Авторы благодарят Biorepository и патологии Core для доступа к Leica LMD 6500 платформы в Icahn школы медицины на горе Синай.

Ткани мышей были получены в соответствии с Национальным иринститутам Здравоохранения Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, и протоколы исследования были одобрены институционального ухода за животными и использования комитета в Icahn школы медицины на горе Синай....

LCM позволяет обезолюрить обогащенные или однородные популяции клеток от неоднородных тканей. Его преимущества включают быстрый и точный захват клеток в контексте in vivo, в то время как потенциальные недостатки включают в себя его время, дорого, и ограничивается необходимостью для п?...

Опорно-крестеская система представляет собой многокомпонентную систему, состоящую из мышц, соединительной ткани, сухожилия, связок, хряща и кости, иннерватизованной нервами и васкуляризованной кровеносными сосудами1. Скелетные ткани развиваются с возрастающей клеточной неоднородностью и структурной сложностью. Хрящ и кости развиваются из той же линии остеохондропрогенитора и тесно связаны между собой. Эмбриональный хрящ и кости развиваются в сочетании с мышцами, нервами, кровеносными сосудами и недифференцированным мезенхимом. Хрящ также может быть окружен кости, такие как хрящ Мекель и кондилярный хрящ в челюстно-прилежной кости. Эти ткани анатомически связаны и взаимодействуют друг с другом через внеклеточные сигналы во время развития. При изучении экспрессии генов при развитии хряща и костей одним из препятствий является неоднородность скелетных структур, состоящих из нескольких типов тканей. Точная изоляция конкретной ткани интереса является ключом к успешному транскрипционного анализа.
Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции типов клеток или регионов, представляющих интерес в неоднородных тканях, и воспроизводимый и чувствителен к одноклеточному уровню2. Он может точно цели и захвата клеток, представляющих интерес для широкого спектра вниз по течению анализы в транскриптомике, геномике и протеомике3,4. Качество изолированной РНК, ДНК или белка можно оценить с помощью биоанализа или эквивалентной платформы. Например, качество РНК указывается номером целостности РНК (RIN)5.
Здесь мы предоставляем протокол для быстрого окрашивания и изоляции хряща и кости LCM от свежих замороженных тканей. Мы используем эмбрион мыши, чтобы продемонстрировать, что этот протокол дает высококачественную РНК для последующего транскриптомического анализа, такого как секвенирование РНК (РНК-сек).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Лазерный захват микродиссекции (LCM) является мощным инструментом для изоляции конкретных типов клеток или областей, представляющих интерес от неоднородных тканей. Клеточная и молекулярная сложность скелетных элементов возрастает с развитием. Неоднородность тканей, например, на стыке хрящевых и косых элементов друг с другом или с окружающими тканями, является одним из препятствий для изучения развития хряща и костей. Наш протокол обеспечивает быстрый метод обработки тканей и изоляции хряща и кости, что дает высокое качество РНК для анализа экспрессии генов. Свежие замороженные ткани эмбрионов мыши разделены и краткое кресиловое фиолетовое окрашивание используется для визуализации хряща и кости с цветами, отличными от окружающих тканей. Слайды затем быстро обезвоживаются, и хрящи и кости изолированы впоследствии LCM. Минимизация воздействия вавных растворов в ходе этого процесса поддерживает целостность РНК. Хрящ мыши Мекеля и мандибулярная кость на E16.5 были успешно собраны, а анализ экспрессии генов показал дифференциальное выражение генов маркеров остеобластов, остеоцитов, остеокластов и хондроцитов. Высокое качество РНК также было выделено из целого ряда тканей и эмбрионального возраста. Этот протокол детали образца подготовки для LCM в том числе криоэмбеддинг, секции, окрашивания и обезвоживания свежих замороженных тканей, а также точной изоляции хряща и кости LCM в результате чего высокое качество РНК для транскриптомического анализа.

Корональные секции свежих замороженных тканей мыши на E16.5 были использованы для демонстрации изоляции и сбора хряща Мекеля (MC), кондилярного хряща и мандибулярной кости LCM. Эмбрионы мыши на E16.5 были расчленены и встроены в криогенные формы с соединением OCT. Образцы в плесенях быстро замо?...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Этот протокол описывает микрорассечение лазерного захвата для изоляции хряща и кости от свежезамороженных секций эмбриона мыши. Хрящ и кости могут быть быстро визуализированы кресилфиолетовым окрашиванием и собраны именно для получения высококачественной РНК для транскриптомического анализа.

Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Неоднородность скелетных структур является одним из препятствий в изучении экспрессии генов при развитии хряща и кости. Этот протокол обеспечивает метод точной изоляции соседних, но различных тканей. Мы оптимизируем микродиссекцию захвата лазера для хряща и кости с помощью кресилового фиолетового окрашивания для визуализации этих тканей для точного сбора, поддерживая высокую целостность РНК для последующего анализа.Другие ткани могут быть изолированы, если cresyl фиолетовый обеспечивает достаточное различие целевой ткани и РНК качество остается высоким после нашего метода обработки. Такие ткани включают черепно-мозговые швы и мозг. Cryosectioning является наиболее требовательным навыком в этом протоколе.Убедитесь, что ткань вскрывается и быстро встраивается для поддержания высочайшей целостности РНК. Чтобы начать эту процедуру, вскрыть эмбрион или ткани, представляющие интерес. Встраивание образца в одноразовую встраиваемую форму с оптимальным температурным соединением резки и регулировка ориентации образца кончиком или иглой.Быстро заморозить образцы в сухом льду и метил-2-бутеновой ванне. Затем подготовьте крышкой контейнер с сухим льдом, разместив лист алюминиевой фольги на сухом льду для временного хранения слайдов образца вскрытия во время криозирования. Перенесите свежий замороженный образец в ведро сухого льда.Поместите слой оптимального разрезая температурного соединения на держатель образца криостата, и сразу же поместите образец поверх оптимального соединения температуры резки с нежным давлением. Когда оптимальное соединение температуры резки полностью заморожено, закрепите держатель с образцом в криостат режущей рукой. Оставьте образец в криостате на 15 минут, чтобы уравноть его до температуры резки.Затем раздел ткани толщиной 12 микрометров и собирать ломтики на ПЕН мембраны слайдов. Выравнивание последовательных секций на мембране. Как только слайд будет завершен, дайте секциям высохнуть в течение нескольких минут, а затем перенесите слайд на фольгу в контейнере с сухим льдом до тех пор, пока не будут собраны все необходимые слайды.Храните слайды при температуре минус 80 градусов по Цельсию в слайд-коробке. Для начала приготовьте три помеченные 15 миллилитровые центрифуги. Добавьте 45 миллилитров 80% этанола в каждую трубку.Поместите три трубки на лед. Поместите трубку, содержащую 45 миллилитров этанола 95% и трубку, содержащую 100% этанола на льду. Затем добавьте 45 миллилитров ксилена в 50 миллилитровую центрифугу при комнатной температуре.Оттепель ПЕН-мембраны слайд кратко, поместив его против руки в перчатках, и мыть его дважды в течение 30 секунд в каждой из труб, содержащих 80% этанола с волнением, чтобы удалить оптимальное соединение температуры резки. Затем положите слайд на лист алюминиевой фольги. Pipette 8 миллилитров 1%cresyl фиолетовый и 50% этанола на слайде и пятно в течение 30 секунд.Вымойте слайд в третьей трубке, содержащей 80% этанола в течение 30 секунд. Обезвоживаемую горку, передавая ее через трубку, содержащую 95% этанола в течение 30 секунд, трубку, содержащую 100% этанола в течение 30 секунд, и, наконец, трубку, содержащую ксилен в течение 30 секунд. После этого поместите слайды на деликатный стеклоочиститель задачи в течение пяти минут, чтобы ксилен стока и дайте разделам высохнуть.Во-первых, включите микроскоп микродиссекции захвата лазера, лазер и компьютер. Войдите на компьютер и запустите программное обеспечение. Когда зеленый свет нажат, нажмите красную кнопку, чтобы активировать лазер.Когда свет становится красным, лазер готов к использованию. Вставьте крышку 5-миллилитровой трубки ПЦР в коллектор. Pipette 50 микролитров буфера извлечения в крышку и вставить устройство сбора в микроскоп.В окне устройства коллектора изменений нажмите кнопку "Точка отсчета", чтобы переместить коллектор к точке отсчета. Отрегулируйте фокус, чтобы четко просмотреть точку отсчета. Затем нажмите кнопку левой разгрузки в панели инструментов, чтобы снизить держатель слайда.Поместите слайд в держатель с тканью раздел лицом вниз, и вставить держатель обратно в сцену. Нажмите продолжить в окне образца изменения. Чтобы настроить параметры лазера, выберите вариант управления лазерным меню или нажмите на значок лазера.Отрегулируйте следующие параметры по желанию, мощность, которая является мощность лазера, диафрагма, которая является ширина лазера, и скорость, которая является скорость резки в режиме ничьей и резки. Начните с 5X цель, чтобы найти области, представляющие интерес, и перейти к цели, которая наилучшим образом показывает области интересов. Выберите трубку для сбора, нажав знак на коллектор, а затем выбрать двигаться и вырезать или рисовать и вырезать.Как только разрез будет завершен, целевая ткань с ПЕН-мембраной упадет в крышку трубки сбора под действием силы тяжести. Повторите этот процесс отбора и резки, чтобы вытащить несколько областей, представляющих интерес, если это необходимо. После этого выгрузите коллектор и аккуратно закройте ПЦР-трубку.Поместите микродиссектные ткани на сухой лед. Оттепель микродиссектированных тканей при комнатной температуре, затем центрифуга кратко, и инкубировать образцы при 42 градусах по Цельсию в течение 30 минут. После этого, спина лиза буфера вниз в 5 миллилитров ПЦР трубки.Выполните обработку DNase и экстракции РНК с помощью комплекта изоляции РНК, следуя инструкциям производителя. В этом исследовании, оптимизированный лазер захвата микроперемида хряща и кости выполняется, подчеркивая использование крещено фиолетового окрашивания в быстрой процедуре визуализации хряща и кости для точного сбора тканей при сохранении высокой целостности РНК для последующего анализа. Наблюдение за слайдами показывает, что все исследованные хрящи окрашены пурпурным, а все минерализованные ткани окрашены в коричневый или черный цвет.Хрящ и кость легко отличить от других тканей в нескольких анатомических участках. Хрящ Мекеля, кондилярный хрящ и области мандибулярной кости отбираются и изолируются с помощью лазерного захвата микродиссекции. Чтобы получить достаточную РНК для секвенирования, потяните 10 областей хряща Мекеля, 10 областей кондиларного хряща, или четыре области мандибулярной кости в три отдельные трубки сбора соответственно.ЗАТЕМ извлекается РНК, и общая РНК анализируется с помощью биоанализа. Этот протокол микроперехвления лазерного захвата используется на различных тканях на разных стадиях развития, и измерения целостности РНК указывают на высокое качество РНК. Затем проводится дифференциальный анализ экспрессии генов.Есть 4, 006 генов значительно и по-разному выражается между мибибулярной кости и хряща Мекеля. Гены, характерные для остеобластов или остеоцитов, более высоко выражены в мандибулярной кости, в то время как специфические гены хондроцитов более высоко выражены в хряще Мекеля. Кроме того, остеокластные маркеры более высоко выражены в мидибулярной кости, что свидетельствует об успешной изоляции целевых тканей.После этой процедуры может быть проведен анализ экспрессии генов, включая qPCR и РНК-сек. Эти методы могут анализировать экспрессию генов транскриптома в конкретных тканях или областях, представляющих интерес в неоднородных тканях.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Культура эмбриональных мыши Cochlear эксплантов и Перенос генов путем электропорации

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal Упорядочение динамических данных выражений из конкретных пространственных Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Диссекция и культура мышей эмбриональной почки

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Гемогенное перепрограммирование фибробластов человека путем принудительного выражения факторов транскрипции

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...