Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Dental and Craniofacial Research (R01DE022988) och Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development (P01HD078233). Författarna tackar Biorepository och patologi kärna för tillgång till Leica LMD 6500 plattform vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai.

Vävnader från möss erhölls i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur, och studieprotokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Icahn School of Medicine vid berget Sinai.
1. beredning av färskt fryst preparat
<ol><li>Dissekera embryot eller vävnad av intresse. Bädda in provet i en disponibel inbäddning mögel med optimal skärtemperatur (OCT) förening. Justera preparens orientering med en spet...

LCM möjliggör isolering av berikade eller homogena cellpopulationer från heterogena vävnader. Dess fördelar är snabb och exakt avskiljning av celler i deras in vivo -sammanhang, medan potentiella nackdelar är att det är tidskrävande, dyrt och begränsat av behovet av att användaren känner igen distinkta subpopulationer inom ett angivet prov30. Detta protokoll ger information om LCM av mus embryonala brosk och ben, belyser användningen av cresyl violett färgning i ett snabbt f...

Rörelseapparaten är ett multikomponentsystem som består av muskler, bindväv, senor, ligament, brosk, och ben, innerveras av nerver och vaskulariserad av blodkärl1. Skelett vävnaderna utvecklas med ökande cellulära heterogenitet och strukturell komplexitet. Brosk och ben utvecklas från samma osteochondroprogenitor härstamning och är mycket relaterade. Embryonala brosk och ben utvecklas i samband med muskler, nerver, blodkärl, och odifferentierad Mesenchyme. Brosk kan också vara omgiven av ben, såsom Meckels brosk och kondylar brosk inom mandibular benet. Dessa vävnader är anatomiskt associerade och interagera med varandra genom extracellulära signaler under utvecklingen. I studiet av genuttryck i utvecklingen av brosk och ben, ett hinder är heterogenitet skelett strukturer består av flera vävnadstyper. Exakt isolering av den specifika vävnaden av intresse är nyckeln för framgångsrik transkriptionell analys.
Laser Capture microdissection (LCM) är ett kraftfullt verktyg för att isolera celltyper eller regioner av intresse inom heterogena vävnader, och är reproducerbar och är känslig för Single cell Level2. Det kan exakt rikta och fånga celler av intresse för ett brett spektrum av nedströms analyser i transcriptomics, genomik, och proteomik3,4. Kvaliteten på det isolerade RNA, DNA, eller protein kan bedömas med en bioanalyzer eller motsvarande plattform. Till exempel indikeras RNA-kvalitet av RNA-integritetnumret (RIN)5.
Här ger vi ett protokoll för snabb färgning och isolering av brosk och ben av LCM från färska frysta vävnader. Vi använder mus embryot för att visa att detta protokoll ger högkvalitativt RNA för efterföljande transkriptomisk analys, såsom RNA-sekvensering (RNA-SEQ).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Laser Capture microdissection (LCM) är ett kraftfullt verktyg för att isolera specifika celltyper eller regioner av intresse från heterogena vävnader. Skelett elementens cellulära och molekylära komplexitet ökar med utvecklingen. Vävnad heterogenitet, såsom vid gränssnittet av brosk och bendefekter element med varandra eller med omgivande vävnader, är ett hinder för studiet av att utveckla brosk och ben. Vårt protokoll ger en snabb metod för vävnads bearbetning och isolering av brosk och ben som ger hög kvalitet RNA för gen uttrycks analys. Färska frysta vävnader av mus embryon är sektioneras och kort cresyl violett färgning används för att visualisera brosk och ben med färger skiljer sig från omgivande vävnader. Diabilder är sedan snabbt uttorkad, och brosk och ben isoleras därefter av LCM. Minimering av exponering för vattenlösningar under denna process upprätthåller RNA-integritet. Mus Meckels brosk och mandibular ben vid E 16.5 har framgångsrikt samlats in och gen uttrycks analys visade differential uttryck av markörgener för osteoblaster, osteocyter, osteoklaster och kondrocyter. Hög kvalitet RNA isolerades också från en rad vävnader och embryonala åldrar. Detta protokoll specificerar provpreparering för LCM inklusive kryoinbäddning, snittning, färgning och torkning av färska frysta vävnader, och exakt isolering av brosk och ben av LCM vilket resulterar i högkvalitativt RNA för transkriptomisk analys.

Koronala avsnitt av färska frysta mus vävnader vid e 16.5 användes för att demonstrera isolering och insamling av Meckels brosk (MC), kondylärt brosk, och mandibular ben av LCM. Mus embryon vid E 16.5 dissekeras och bäddas in i kryogena formar med ULT förening. Proverna i formar var snabbt frysta i en torris och metyl-2-butan bad och förvaras vid-80 ° c.
Att demonstrera cresyl violett färgning av brosk och ben, kryosektionering i det koronala planet utfördes och prover samlades på ...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Detta protokoll beskriver laserinfångnings mikrodissektion för isolering av brosk och ben från färska frysta delar av mus embryot. Brosk och ben kan snabbt visualiseras genom cresyl violett färgning och samlas just för att ge hög kvalitet RNA för transcriptomic analys.

Laserinfångning mikrodissektion av mus embryonala brosk och ben för gen uttrycks analys

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Skelettstrukturernas heterogenitet är ett hinder för att studera genuttrycket i att utveckla brosk och ben. Detta protokoll ger en metod för exakt isolering av angränsande men olika vävnader. Vi optimerar lasern fånga mikrodissektion för brosk och benet med hjälp av cresyl violett färgning för att visualisera dessa vävnader för exakt insamling genom att upprätthålla hög RNA integritet för efterföljande analys.Andra vävnader kan isoleras om cresylviolett ger tillräcklig distinktion av målvävnad och RNA-kvaliteten förblir hög efter vår bearbetningsmetod. Sådana vävnader inkluderar kraniofacial suturer och hjärna. Cryosectioning är den mest krävande skicklighet i detta protokoll.Se till att vävnaden dissekeras och bäddas in snabbt för att upprätthålla den högsta integriteten hos RNA. För att påbörja detta förfarande, dissekera embryot eller vävnad av intresse. Bädda in provet i en engångsinbäddningsform med optimal skärtemperaturförening, och justera preparatets orientering med en spets eller nål.Frys snabbt proverna i en torris och metyl-2-buten bad. Därefter förbereder en lidded behållare med torris genom att placera ett ark av aluminiumfolie på torrisen för tillfällig lagring av dissektionsprovsglas under kryosektion. Överför det färska frysta exemplaret i hinken med torris.Placera ett lager av optimal skärtemperaturförening på en kryostatförkroppshållare, och placera omedelbart preparatet ovanpå den optimala skärtemperaturföreningen med varsamt tryck. När den optimala skärtemperaturföreningen är helt frusen, fäst hållaren med preparatet i kryostatskärarmen. Låt provet vara kvar i kryostaten i 15 minuter för att ekvilit det till skärtemperaturen.Sedan delar du upp vävnaden i en tjocklek på 12 mikrometer och samlar skivorna på PEN-membranglidningar. Rikta varandra på på membranet. När bilden är klar, låt sektionerna torka i några minuter, och sedan överföra bilden på folien i torrisbehållaren tills alla nödvändiga diabilder samlas in.Förvara bilderna i minus 80 grader Celsius i en ruta. Till att börja, förbereda tre märkta 15 milliliter centrifugrör. Tillsätt 45 milliliter 80%etanol till varje rör.Placera tre rör på is. Placera ett rör som innehåller 45 milliliter 95%etanol och ett rör som innehåller 100%etanol på is. Därefter lägger du till 45 milliliter xylen till ett 50 milliliter centrifugrör vid rumstemperatur.Tina ett PEN-membran glida en kort stund genom att placera den mot en handske hand, och tvätta den två gånger i 30 sekunder i vart och ett av de rör som innehåller 80%etanol med agitation för att avlägsna den optimala skärtemperaturföreningen. Sedan lägger du bilden på ett ark aluminiumfolie. Pipett 8 milliliter 1%kresylviolett och 50%etanol på objektglaset och fläcken i 30 sekunder.Tvätta objektglaset i det tredje röret som innehåller 80%etanol i 30 sekunder. Torka av glidglaset genom att passera den genom röret som innehåller 95%etanol i 30 sekunder, röret som innehåller 100%etanol i 30 sekunder, och slutligen, det rör som innehåller xylen i 30 sekunder. Efter detta, placera bilderna på en känslig uppgift torkare i fem minuter för att låta xylen avlopp och låta sektionerna torka.Först slår på lasern fånga mikrodissektion mikroskop, laser, och dator. Logga in på datorn och starta programvaran. När den gröna lampan är tänd trycker du på den röda knappen för att aktivera lasern.När ljuset blir rött är lasern klar att använda. Sätt in locket på ett 5 milliliter PCR-rör i kollektorn. Pipett 50 mikroliter av utsugsbuffert i locket och för in uppsamlingsanordningen i mikroskopet.I fönstret förändring samlare enhet, klicka på flytta till referenspunkt knappen för att flytta insamlaren till referenspunkten. Justera fokus för att tydligt visa referenspunkten. Därefter klickar du på knappen för vänster avlastning i verktygsfältet för att sänka bildhållaren.Placera glidglaset i hållaren med vävnadsdelen vänd nedåt, och sätt tillbaka hållaren i scenen. Klicka på Fortsätt i fönstret ändra exemplar. För att ställa in laserparametrarna, välj kontrollalternativet för lasermenyn eller klicka på laserikonen.Justera följande parametrar som önskas, makt, som är kraften i lasern, bländare, som är bredden på lasern, och hastighet, som är skärhastigheten i rita och klippa läge. Börja med ett 5X-mål att hitta de intresseområden, och övergå till det mål som bäst visar intresseområdet. Välj röret för insamling genom att klicka på märket vid uppsamlaren, välj sedan flytta och klippa eller rita och klippa.När snittet är klart kommer målvävnaden med PEN-membran att falla i uppsamlingsrörets lock genom gravitation. Upprepa detta val och skär process för att dra flera områden av intresse om det behövs. Efter detta, lossa kollektorn och stäng försiktigt PCR-röret.Placera de mikroupptäckta vävnaderna på torris. Tina de mikroupptäckta vävnaderna i rumstemperatur, sedan centrifug kort, och inkubera proverna vid 42 grader Celsius i 30 minuter. Efter detta snurrar du ner lysbufferten i 5 milliliter PCR-röret.Utför DNase-behandling och RNA-extraktion med hjälp av en RNA-isoleringssats, enligt tillverkarens instruktioner. I denna studie, en optimerad laser fånga mikrodissektion av brosk och ben utförs, belyser användningen av cresyl violett färgning i ett snabbt förfarande för att visualisera brosk och ben för exakt vävnad insamling samtidigt som hög RNA integritet för efterföljande analys. Observation av bilderna visar att alla brosk undersökta är färgas magenta, och alla mineraliserade vävnader färgas brun eller svart.Både brosk och ben är lätt skiljas från andra vävnader på flera anatomiska platser. Meckel's Brosk, kondylar brosk, och mandibular ben regionerna väljs och isoleras av laser fånga mikrodission. För att erhålla tillräckligt med RNA för sekvensering, dra 10 regioner i Meckel's Cartilage, 10 regioner av condylar brosk, eller fyra regioner av mandibular ben i tre enskilda samlingsrör respektive.RNA extraheras sedan, och det totala RNA analyseras med hjälp av en bioanalyzer. Denna laser capture microdissection protokoll används på olika vävnader i olika utvecklingsstadier, och RNA integritetsnummer mätningarna indikerar hög RNA-kvalitet. Differentialgenuttrycksanalys utförs sedan.Det finns 4, 006 gener betydligt och annorlunda uttryckt mellan mandibular ben och Meckel's Brosk. Gener som är specifika för osteoblaster eller osteocyter är mer uttrycks i mandibular ben medan kondrocyte specifika gener är mer uttrycks i Meckel's Cartilage. Dessutom är osteoklastmarkörer mer högt uttryckta i mandibular ben, vilket indikerar framgångsrik isolering av riktade vävnader.Efter denna procedur kan genuttrycksanalys, inklusive qPCR och RNA-seq, utföras. Dessa metoder kan analysera genuttryck av transkriptomet i specifika vävnader eller regioner av intresse inom heterogena vävnader.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Kultur av embryonala Mouse Cochlear Explantat och Gene Transfer med elektroporering

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av kondrocyttransplantation interkalering och riktnings spridning via Zebrabow Kloncellanalys i embryonala Meckels Brosk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Temporal Beställning av dynamiskt uttryck data från Detaljerad Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Dissektion och kultur av mus embryonisk njure

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vävnads beredning och immunofärgning av mus kraniofaciala vävnader och Undecalcified Bone

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolering och färgning av mus hud keratinocyter för cell Cycle specifik analys av cellulära protein uttryck av Masscytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogena omprogrammering av humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...