Name: laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (R01DE022988) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsanGelişimi Enstitüsü (P01HD078233) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Mount Sinai De Icahn Tıp Okulu'nda Leica LMD 6500 platformuna erişim için Biorepository ve Patoloji Çekirdek teşekkür ederiz.

Farelerden elde edilen dokular, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak elde edildi ve çalışma protokolleri Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Taze Dondurulmuş Numunenin Hazırlanması
<ol><li>Embriyoyu veya ilgi çekici dokuyu inceleyin. Numuneyi en iyi kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğiyle tek kullanımlık gömme kalıbına gömün. Numunenin ...

LCM, zenginleştirilmiş veya homojen hücre popülasyonlarının heterojen dokulardan izole edilmesini sağlar. Avantajları arasında hücrelerin in vivo bağlamında hızlı ve hassas bir şekilde yakalanması yer alırken, potansiyel dezavantajları arasında zaman alıcı, pahalı ve kullanıcının belirli bir örnek30içinde farklı alt popülasyonları tanıma ihtiyacı yla sınırlı olması yer almaktadır. Bu protokol fare embriyonik kıkırdak ve kemik LCM ayrıntılarını sa...

Kas-iskelet sistemi kas, bağ dokusu, tendon, bağ, kıkırdak ve kemik, sinirler tarafından innerve ve kan damarları tarafından vaskülarize oluşan çok bileşenli bir sistemdir1. İskelet dokuları artan hücresel heterojenlik ve yapısal karmaşıklık ile gelişir. Kıkırdak ve kemik aynı osteokondroprojenitor soydan gelişir ve son derece ilişkilidir. Embriyonik kıkırdak ve kemik kaslar, sinirler, kan damarları ve farklılaşmamış mezenkim ile birlikte gelişir. Kıkırdak da kemik ile çevrili olabilir, Meckel kıkırdak ve mandibuler kemik içinde kondize kıkırdak gibi. Bu dokular anatomik olarak ilişkilidir ve gelişim sırasında hücre dışı sinyaller aracılığıyla birbirleriyle etkileşime geçerler. Kıkırdak ve kemik gelişiminde gen ekspresyonunun incelenmesinde, birden fazla doku tipinden oluşan iskelet yapılarının heterojenliği bir engeldir. İlgi dokusunun hassas izolasyonu başarılı transkripsiyonel analiz için anahtardır.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokular içinde hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır, ve tekrarlanabilir ve tek hücre seviyesine duyarlı2. Bu kesin hedef ve transkriptomik, genomik ve proteomik3,4downstream tahliller geniş bir yelpazede için ilgi hücreleri yakalamak . İzole RNA, DNA veya proteinin kalitesi biyoanalizör veya eşdeğer bir platform ile değerlendirilebilir. Örneğin, RNA kalitesi RNA bütünlük numarası (RIN)5ile gösterilir.
Burada, taze dondurulmuş dokulardan LCM tarafından kıkırdak ve kemik hızlı boyama ve izolasyon için bir protokol sağlar. Fare embriyosu kullanarak bu protokolün rna dizilemesi (RNA-seq) gibi sonraki transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verdiğini gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O3551-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td>Conical sterile polypropylene centrifuge tubes, 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wiper</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable embedding mold</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>DNase/RNase-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, absolute (200 proof)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass PEN membrane slide</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11505158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCM system</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>Leica LMD6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-545FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>102094-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube with flat cap, 0.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td>LCM collection tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>KIT0204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination agent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td>RNase decontamination agent for cleaning surfaces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser capture microdissection of mouse embryonic cartilage and bone for gene expression analysis

Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) heterojen dokulardan belirli hücre tipleri veya ilgi bölgeleri izole etmek için güçlü bir araçtır. İskelet elemanlarının hücresel ve moleküler karmaşıklığı gelişme ile birlikte artar. Doku heterojenliği, birbirleriyle veya çevre dokularla kıkırdak ve kemik gelişen çalışma için bir engel dir. Protokolümüz, gen ekspresyonu analizi için yüksek kaliteli RNA sağlayan kıkırdak ve kemiğin doku işleme ve izolasyonhızlı bir yöntem sağlar. Fare embriyolarının taze dondurulmuş dokuları kesitli ve kısa tere mor boyama çevreleyen dokulardan farklı renklerle kıkırdak ve kemik görselleştirmek için kullanılır. Slaytlar daha sonra hızla susuz, ve kıkırdak ve kemik lcm tarafından daha sonra izole edilir. Bu işlem sırasında sulu çözeltilere maruz kalmanın en aza inmesi RNA bütünlüğünü korur. Mouse Meckel'in E16.5'teki kıkırdağı ve mandibuler kemiği başarılı bir şekilde toplanmış ve gen ekspresyonu analiziosteoblastlar, osteositler, osteoklastlar ve kondrositler için marker genlerin diferansiyel ekspresyonu göstermiştir. Yüksek kaliteli RNA da dokular ve embriyonik çağlar bir dizi izole edildi. Bu protokol, kriyoksasyon, kesitleme, boyama ve taze dondurulmuş dokuların susuz kalması ve kıkırdak ve kemiğin LCM ile hassas izolasyonu gibi LCM için numune hazırlamasını ayrıntılarıyla belirterek transkripskopik analiz için yüksek kaliteli RNA sağlar.

E16.5'teki taze dondurulmuş fare dokularının koronal bölümleri, Meckel'in kıkırdağının (MC), aküler kıkırdağının ve mandibular kemiğinLCM ile izolasyon ve toplanmasını göstermek için kullanıldı. E16.5'teki fare embriyoları parçalandı ve OCT bileşiği ile kriyojenik kalıplara gömülmüştü. Kalıptaki numuneler kuru buz ve metil-2-bütan banyosunda hızla dondurularak -80 °C'de saklandı.
Kıkırdak ve kemik terosmor mor boyama göstermek için koronal düzlemde k...

Watch this Scientific Journal Video about Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

İskelet yapılarının heterojenliği, kıkırdak ve kemik geliştirmede gen ekspresyonunun incelenmesinde bir engeldir. Bu protokol, bitişik ancak farklı dokuların hassas yalıtımı için bir yöntem sağlar. Daha sonraki analizler için yüksek RNA bütünlüğünü koruyarak bu dokuları hassas toplama için görselleştirmek için krem menekşe boyama kullanarak kıkırdak ve kemik için lazer yakalama mikrodizeksiyonoptimize.Eğer cresyl menekşe hedef doku yeterli ayrım sağlar ve RNA kalitesi bizim işleme yöntemi sonra yüksek kalır diğer dokular izole edilebilir. Bu tür dokular kraniyofasiyal dikişler ve beyin içerir. Kriyosectioning bu protokolde en zorlu beceridir.RNA'nın en yüksek bütünlüğünü korumak için dokunun hızla parçalanıp gömülü olduğundan emin olun. Bu işlem başlamak için, embriyo veya ilgi doku incelemek. Numuneyi en iyi kesme sıcaklığı bileşiğiyle tek kullanımlık gömme kalıbına gömün ve numunenin yönünü bir uç veya iğneyle ayarlayın.Hızlı bir kuru buz ve metil-2-butene banyo örnekleri dondurmak. Daha sonra, kriyoseksiyon sırasında diseksiyon örnek slaytlar geçici depolama için kuru buz alüminyum folyo bir levha yerleştirerek kuru buz ile kapaklı bir konteyner hazırlayın. Taze dondurulmuş numuneyi kuru buz kovasına aktarın.Bir kriyostat numune tutucuüzerine optimum kesme sıcaklığı bileşik bir tabaka yerleştirin ve hemen nazik basınç ile optimum kesme sıcaklığı bileşik üstüne numune yerleştirin. Optimum kesme sıcaklığı bileşiği tamamen dondurulduğunda, tutucuyu numuneyle birlikte kriyostat kesme koluna sabitlayın. Kesme sıcaklığına göre dengelemek için numuneyi 15 dakika kriyostatta bırakın.Daha sonra, 12 mikrometre kalınlığında doku bölüm ve PEN membran slaytlar üzerinde dilimleri toplamak. Membran üzerinde ardışık bölümleri hizalayın. Slayt tamamlandıktan sonra, bölümlerin birkaç dakika kurumasını bekleyin ve gerekli tüm slaytlar toplanana kadar kaydırağı kuru buz kabındaki folyoya aktarın.Slaytları eksi 80 santigrat derecede bir slayt kutusunda saklayın. Başlamak için, üç etiketli 15 mililitre santrifüj tüpler ilerler. Her tüpe 45 mililitre %80 etanol ekleyin.Buz üzerine üç tüp yerleştirin. Buz üzerinde % 95 etanol 45 mililitre ve% 100 etanol içeren bir tüp içeren bir tüp yerleştirin. Sonra, oda sıcaklığında 50 mililitrelik bir santrifüj tüp ksilen 45 mililitre ekleyin.Bir PEN membranı eldivenli bir ele dayayarak kısa bir süre kızamasını ve optimum kesme sıcaklığı bileşiğinin çıkarılması için %80 etanol içeren tüplerin her birinde 30 saniye boyunca iki kez yıkayın. Sonra, alüminyum folyo bir levha üzerine slayt yatıyordu. Pipet 8 mililitre 1% cresyl menekşe ve% 50 etanol slayt üzerine 30 saniye boyunca leke.Slaytı %80 etanol içeren üçüncü tüpte 30 saniye boyunca yıkayın. 30 saniye boyunca%95 etanol içeren tüpten geçirerek kaydırağı, 30 saniye boyunca %100 etanol içeren tüpü ve son olarak da 30 saniye boyunca ksilen içeren tüpü susuz kalın. Bundan sonra, ksilenin boşalmasını ve bölümlerin kurumasını sağlamak için slaytları beş dakika boyunca hassas bir görev sileceğiüzerine yerleştirin.İlk olarak, lazer yakalama mikrodisese mikroskobu, lazer ve bilgisayar açın. Bilgisayarda oturum açın ve yazılımı başlatın. Yeşil ışık yandığında, lazeri etkinleştirmek için kırmızı düğmeye basın.Işık kırmızıya döndüğünde, lazer kullanıma hazırdır. 5 mililitrelik PCR tüpün kapağını kolektöre takın. Pipet 50 mikrolitre ekstraksiyon tamponu kapağına yerleştirin ve toplama cihazını mikroskoba yerleştirin.Toplayıcı aygıtını değiştir penceresinde, toplayıcıyı başvuru noktasına taşımak için başvuru noktası düğmesine taşı'nı tıklatın. Başvuru noktasını net bir şekilde görüntülemek için odağı ayarlayın. Ardından, slayt tutucusunu düşürmek için araç çubuğundaki sol boşalt düğmesini tıklatın.Aşağı bakacak şekilde doku bölümü ile tutucu içine slayt yerleştirin ve sahne içine geri tutucu yerleştirin. Örnek değiştir penceresinde devam'ı tıklatın. Lazer parametrelerini ayarlamak için, lazer menüsünün kontrol seçeneğini seçin veya lazer simgesine tıklayın.Aşağıdaki parametreleri istenilen şekilde ayarlayın, güç, lazerin gücü olan diyafram, lazerin genişliği ve çekme ve kesme modunda kesme hızı olan hız. İlgi alanlarını bulmak için 5X hedefiyle başlayın ve ilgi alanını en iyi şekilde gösteren hedefe geçin. Toplayıcıdaki işareti tıklatarak toplama için tüpü seçin, sonra taşıyın ve kesin veya çizin ve kesin.Kesim tamamlandıktan sonra PEN membranlı hedef doku yerçekimi ile toplama tüpünün kapağına düşecektir. Gerekirse birden fazla ilgi alanını çekmek için bu seçimi ve kesme işlemini tekrarlayın. Bundan sonra, kolektörü boşaltın ve PCR tüpünü dikkatlice kapatın.Mikrodiskoplu dokuları kuru buz üzerine yerleştirin. Mikrodiskoplu dokuları oda sıcaklığında eritin, sonra kısa bir süre santrifüj edin ve numuneleri 42 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, 5 mililitreLIK PCR tüp içine lysis tampon aşağı spin.Üreticinin talimatlarına uyarak, RNA izolasyon kiti kullanarak DNa işlemi ve RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Bu çalışmada, kıkırdak ve kemik optimize edilmiş bir lazer yakalama mikrodizesi yapılır, daha sonraki analizler için yüksek RNA bütünlüğünü korurken hassas doku toplama için kıkırdak ve kemik görselleştirmek için hızlı bir prosedür cresyl menekşe boyama kullanımı vurgulayarak. Slaytların gözlemi incelenen tüm kıkırdakların lekeli macenta, mineralize dokuların tümünün ise kahverengi veya siyah olduğunu göstermektedir.Hem kıkırdak hem de kemik birden fazla anatomik noktada diğer dokulardan kolayca ayırt edilebilir. Meckel Kıkırdağı, kondizyler kıkırdak ve mandibuler kemik bölgeleri seçilir ve lazer yakalama mikrodiszeile izole edilir. Sıralama için yeterli RNA elde etmek için, Meckel Kıkırdağının 10 bölgesini, 10 koniler kıkırdağı bölgesini veya mandibular kemiğin dört bölgesini sırasıyla üç ayrı toplama tüpüne çekin.RNA daha sonra ayıklanır ve toplam RNA bir biyoanalizör kullanılarak analiz edilir. Bu lazer yakalama mikrodiseksiyon protokolü farklı gelişim aşamalarında çeşitli dokularda kullanılır ve RNA bütünlük numarası ölçümleri yüksek RNA kalitesini gösterir. Daha sonra diferansiyel gen ekspresyonu analizi yapılır.Mandibular kemik ile Meckel Kıkırdağı arasında anlamlı ve farklı olarak ifade edilen 4.006 gen vardır. Osteoblastlara veya osteositlere özgü genler mandibuler kemikte daha yüksek oranda ifade edilirken, kondrosit spesifik genler Meckel Kıkırdağı'nda daha yüksek oranda ifade edilir. Buna ek olarak, osteoklast belirteçleri daha yüksek mandibuler kemik ifade edilir, hedeflenen dokuların başarılı izolasyon gösteren.Bu işlemden sonra qPCR ve RNA-seq gibi gen ekspresyonu analizi yapılabilir. Bu yöntemler, transkripsiyonun belirli dokularda veya heterojen dokularda ilgi çekici bölgelerdegen ekspresyonunu analiz edebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...