Name: isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro
Uploaded: 2019-12-20T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
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这项工作得到了捷克共和国赠款机构（18-02699S）的支持;捷克共和国卫生部赠款机构（17-31538A）;捷克科学院机构研究项目（RVO 68378050）和MEYS CR项目（LQ1604 NPU II， LTC17063、LM2015040、OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 和 OP RDE CZ.02.01/0.0/0.0/0.0/16_013/0001775;查尔斯大学（个人津贴给K.K.）和布拉格-竞争力运营计划项目（CZ.2.16/3.1.00/21547）。我们感谢光显微镜核心设施，IMG CAS，布拉格，捷克共和国（支持的MEYS CR项目LM2015062和LO1419）支持提供显微成像。

所有动物实验均按照欧洲指令2010/63/EU进行，并经捷克中央动物福利委员会批准。
1. 材料
<ol><li>根据实验室动物科学协会联合会的指导方针，在特定的无病原体条件下饲养动物，并免费获得常规的食肉和饮用水。在12小时/12小时的黑暗/光循环下饲养动物。对于肝细胞隔离和培养，使用8-12周大的动物。</li>
	<li>库存解决方案 A 和 B<ol>
<li>分别根据表1和表2准备库存溶液A和股票溶液B。将所有组件溶解在 1 L 的蒸馏 H2O （dH2O） 中。</li>
		<li>将溶液的pH值调整到7.2，并通过0.2 μm过滤器过滤溶液。两种溶液可在4°C下储存长达6个月。</li>
	</ol>
</li>
	<li>库存解决方案 C<ol>
<li>在原发性肝细胞分离当天准备溶液C。</li>
		<li>根据表 3添加所有组件，用 dH2O 填充到 50 mL 的总体积，然后溶解。将 pH 调整到 7.3。</li>
		<li>在 50 mL 管中对 50 mL 溶液的等量。每只动物用一根管子。将所有必需的等分放入预热的水浴（37 °C）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>库存解决方案 D<ol>
<li>在原发性肝细胞分离当天准备溶液D。</li>
		<li>根据表 4将所有组件添加，用 dH2O 填充到 30 mL 的总体积，然后溶解。将 pH 调整到 7.3。</li>
		<li>在 50 mL 管中对溶液的 30 mL 的等量。将胶原酶I（5mg/30 mL）加入溶液D.每只动物使用一个等分。将所有等分置于预热的水浴（37 °C）中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>库存解决方案 E<ol>
<li>在原发性肝细胞分离当天准备溶液E。</li>
		<li>根据表 5添加所有组件，用 dH2O 填充到 50 mL 的总体积，然后溶解。将 pH 调整到 7.3。</li>
		<li>在 50 mL 管中对 50 mL 溶液的等量。在溶液 E 中加入白蛋白 V （0.65 g/50 mL）. 每只动物使用一个等分。将所有等分置于预热的水浴（37 °C）中。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 胶原蛋白三明治的制备
<ol><li>在原发性肝细胞分离的前一天，准备第一层胶原蛋白I三明治。 注：在冰上工作，并使用预冷却溶液、吸头、板和管，以尽量减少胶原蛋白I不必要的凝胶化。</li>
	<li>根据制造商的协议，中和所需量的胶原蛋白I（从大鼠尾部）。每个实验样品（3.5厘米盘）需要100μL的中和胶原蛋白（1.5mg/mL）。要制备1 mL的中和胶原蛋白（1.5毫克/升），加入100 μL的10x DMEM，1.5 μL的1M NaOH，48.5 μL的dH2O到500μL的胶原蛋白（库存浓度 = 3毫克/mL）。用石墨纸检查中和胶原蛋白的pH值（pH值应为+7.5）。</li>
	<li>使用预冷冻的 200 μL 尖端均匀地分散 100 μL 的中和胶原蛋白溶液，在冰上设置的 3.5 厘米盘的表面。</li>
	<li>在标准培养条件下孵育过夜（在37°C下孵化器，CO2为5%）。在原发性肝细胞分离当天，向第一个胶原蛋白层加入1 mL的预加热（37°C）PBS。在37°C下让胶原蛋白补水2-3小时。</li>
</ol>3. 设备设置
<ol><li>准备材料表中列出的所有设备，并设置如图1所示。</li>
</ol>4. 外科手术
<ol><li>通过肌肉注射瓷砖胺（60毫克/千克体重）、左拉西平（60毫克/千克）和木拉津（4.5毫克/千克）来麻醉小鼠。几分钟后，通过脚趾捏确认适当的麻醉。如果动物对挤压没有反应，则继续到4.2。</li>
	<li>将麻醉鼠标放在解剖垫上，用胶带将下肢和上肢固定在固定位置。用 70% 乙醇擦拭腹部，用 V 形切口从到前腿打开腹部。将皮肤折叠到胸部以揭开腹腔。将解剖垫放在解剖显微镜下。</li>
	<li>将胰岛素注射器针（30 G）弯曲至 45° 角。通过向牛腹方向移动肠道和结肠，露出劣质的vena卡瓦 （IVC）。</li>
	<li>将 2.5 mL 的预加热 （37°C） 溶液 C 填充到带管状的 2 mL 注射器中。确保管状或注射器中没有气泡。</li>
	<li>在IVC的开气之前，用湿 （PBS） 棉签将其压到隔膜上，重新定位肝叶。在肝脏正下方的IVC周围放置丝质缝合线（图2A，B）。</li>
	<li>使用胰岛素注射器将10μL的肝素（5000 U/mL）注射到门户静脉中，30G针在45°角弯曲（图2C）。</li>
	<li>要使肝脏分好，用显微手术剪刀对肝脏正旁边的IVC进行小切口（缝合线下方;图 2D）足够大，可插入导管。使用缝合线和两个手术结将管状固定在位置（图 2E）。</li>
	<li>切开入口静脉 （图 2F） 使灌注缓冲液从肝脏流出，以防止肝脏扩张。</li>
	<li>通过缓慢按下连接到管状的注射器（这应该需要±15 s），手动向肝脏注入1.5 mL的预加热溶液C。现在可以观察到肝脏通过变色从肝脏中去除血液。</li>
	<li>用预加热 （37 °C） 溶液 C 预填充蠕动泵。 检查灌注装置，确保系统中没有气泡。</li>
	<li>小心地将管从注射器上断开，并将其连接到以 2.5 mL/min 的流速运行的蠕动泵的管管上。 快速而小心地工作，确保管路保持到位，并且没有气泡进入管或管。</li>
	<li>用溶液C给肝脏注入2分钟（溶液C的5 mL）。更改为溶液 D 并继续灌注 10 分钟（溶液 D 的 25 mL）。</li>
	<li>一旦肝脏被注入，将其从腹腔中取出。肝脏现在非常脆弱，颜色苍白（图3）。</li>
</ol>5. 原发性肝细胞的隔离
<ol><li>从鼠标中取出肝脏。管状仍然将绑在肝脏上，因此使用钳子将切口与肝脏解除，并小心地切断所有筋膜连接。将肝脏转移到含有20 mL预加热溶液E的50 mL管中。</li>
	<li>用钳子与肝脏保持管状，通过摩擦管壁周围的肝脏来分离组织，将分离的肝细胞转移到缓冲液中。把孤立的细胞放在冰上。 注：孤立的原发性肝细胞在冰上保存几个小时时是可行的。如有必要，用户可以重复步骤 4.1 到 5.2，从另一个供体小鼠中隔离初级肝细胞，或继续执行下一步。</li>
	<li>将70μm尼龙细胞滤网放在50 mL管的顶部，并过滤分离的细胞。</li>
	<li>将管在50 x g和4°C下离心5分钟。吸气上清液。要去除死细胞并增加活细胞的百分比，在 DMEM 中重新悬浮在 20 mL 的 40% 渗透中颗粒。</li>
	<li>在50 x g和4°C下离心管5分钟。将含有死细胞的上清液吸气，并在20 mL溶液E中重新悬浮颗粒。</li>
	<li>在50 x g和4°C下用离心管5分钟。吸气上清液，将颗粒重新悬浮在溶液E的10 mL中。</li>
	<li>使用锥形蓝色染色检查主要肝细胞产量和生存能力。使用 Neubauer 细胞计数室计算细胞数，并将细胞浓度调整为 3.75 x 105个活细胞/mL。把细胞放在冰上</li>
</ol>6. 3D胶原蛋白三明治中原发性肝细胞的培养
<ol><li>准备肝细胞培养基（HCM）。将15 μL的胰高血糖素（1毫克/升），15 μL的氢皮质酮（50毫克/升）和40μL的胰岛素（10毫克/mL）添加到50 mL的完整介质（DMEM，高葡萄糖，10%FBS，1%青霉素-链霉素）。</li>
	<li>在预涂的3.5厘米盘中均匀分散2 mL（5 x 105细胞/mL）的可行原发性肝细胞。在37°C下用5%的CO2孵育细胞3小时。 重要：在将培养皿放入培养箱之前，通过向各个方向倾斜，均匀地分配细胞。</li>
	<li>准备中和胶原蛋白I（100μL/3.5厘米菜;即，按照上述[步骤2.1]）为所有菜肴提供足够的体积。保持冰上，直到使用。</li>
	<li>3小时后，小心地取出中度和未连接的细胞，将100μL的中和胶原蛋白I加入每个3.5厘米的盘中，形成细胞上胶原蛋白三明治的顶层。在标准细胞培养条件下（37°C下5%CO2）孵育胶原蛋白三明治1小时。孵育1小时后，小心地加入2 mL的HCM。</li>
	<li>培养 24 小时后，将 HCM 介质更改为新的介质。</li>
	<li>培养3~8天，取决于胆汁的形成。每天在显微镜下检查文化（图4）。每隔一天更改一次 HCM。</li>
</ol>7. 3D胶原蛋白三明治中原发性肝细胞的免疫标记
<ol><li>从肝细胞三明治中取出介质，然后用预热的PBS仔细清洗。在室温 （RT） 下，用 1 mL 的 4% 甲醛在 PBS 中固定三明治培养物 30 分钟。</li>
	<li>固定后，在 PBS 的 2 mL + 0.1% 补间 20 （PBS-T） 中清洗三明治 3 次 10 分钟。</li>
	<li>在PBS中，用1mL的0.1M甘氨酸，0.2%的Triton X-100在PBS中渗透细胞，在PBS-T中洗涤3次10分钟。</li>
	<li>使用连接到真空吸气的 10 μL 加载尖端轻轻干扰胶原蛋白的顶层，以确保足够的抗体渗透。</li>
	<li>在PBS-T中含有1mL 5%BSA的块（即阻断溶液）2小时。在37°C下用稀释的原抗体在阻断溶液中孵育一夜。在 PBS-T 中洗涤 3 次 15 分钟。</li>
	<li>洗涤后，在37°C下孵育二级抗体5小时，在PBS-T中洗涤3次15分钟，然后用蒸馏H2O洗1次。</li>
	<li>使用防褪色安装介质安装（参见材料表），用于显微镜。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

使用小鼠原发性肝细胞培养物对于体外研究非常重要，以便更好地了解肝细胞极化、适当的胆汁结构形成和胆汁分泌所涉及的信号过程。2D培养中小鼠原发性肝细胞的隔离和长期培养的挑战推动了几种技术方法的发明，分离效果和分离细胞的寿命都提高了，每种方法都有若干优点，缺点。现在人们普遍认为，原发性肝细胞的2D培养只在短期内模仿肝脏生物学的有限数量的属性。因此，胶原蛋白三明治排列中的3D培养被广泛取代2D条件，特别是当专注于细胞骨架在肝脏生物学中的作用（例如，毒性药物效应或胆汁运输的空间组织）。
自20世纪80年代以来，已经描述了几种具有各种修改的小鼠肝细胞分离方案。两步胶原酶灌注方法已广泛应用于许多实验室。在隔离协议中加入梯度离心允许去除死细胞19，20，并显著增加活细胞的数量（这里，通常为+93%）。尽管此步骤延长了细胞的处理时间，导致细胞数减少 21，但此步骤在 3D 胶原蛋白三明治培养中被视为必要的，以便正确形成胆汁可点膜网络。此外，在灌注步骤中快速准确地进行更为重要，从而缩短细胞的处理时间。
提高细胞的生存能力及其在3D中形成眼膜网络能力的其他重要因素是使用新鲜制备的解决方案和避免灌注过程中的气泡。因此，应在小鼠肝细胞隔离当天准备解决方案，在更换溶液时应检查蠕动泵和管道。如果严格遵循该协议，原发性肝细胞的分离应能成功，并产生高产的活细胞。
长期3D肝细胞培养的另一个关键因素是所使用的原发性肝细胞的初始来源。使用8-12周大的动物是重要的，它们作为肝细胞的最佳捐赠者。在长期文化中，使用老年动物的肝细胞并不太成功，因为这些肝细胞更经常地改变其形态，去极化，并停止形成关节网络。此外，在由相对高度浓缩的溶液形成的适当中和胶原胶凝胶上电镀肝细胞是一个至关重要的步骤。在大多数协议中，使用约1mg/mL的浓度。经过多次优化，浓度为1.5mg/mL是长期肝细胞培养的最佳选择，并提供具有形成胆汁的高组织肝细胞。
这种易于遵循的协议允许长期培养原原小鼠肝细胞。代表性结果表明，在研究细胞骨骼成分在胆汁形成中的作用时，3D培养原小鼠肝细胞有着广泛的用途。

肝细胞，肝脏的中央细胞结构，负责其代谢功能，是独特的极化上皮细胞。它们的极化，在出生后不久出现在哺乳动物中，导致胆汁网络的形成，对胆汁分泌至关重要。肝细胞的膜膜共同形成胆汁，而基底膜仍然与正弦的内皮接触。肝细胞极化的丧失导致胆汁输送机的再分配，并导致与肝脏胆汁保留相关的病理过程（即胆汁淤积）。
肝细胞极化的建立和维护以及胆汁发育需要复杂的机制。基础过程取决于肝细胞细胞骨架、细胞-细胞接触和与细胞外基质1的相互作用之间的集体相互作用。肝细胞细胞骨架由所有三个丝网组成，即活动蛋白细胞骨架、微管和中间丝，为眼丝的形成提供结构支持。细胞骨骼成分在胆管膜网络再生和维护中的微分作用，在3D胶原蛋白-三明治肝细胞培养2体外已经说明。
在肝细胞膜极化的初始阶段，Actin微丝和微管在第2代卡纳利库斯的部位是重要的。活性细胞骨架建立胆汁的结构和功能，形成膜相关的微丝和圆环，从而支持角膜结构，并将活性素细胞骨架插入紧和粘附结3。角蛋白中间丝的环外，细胞骨架进一步稳定了角蛋白结构3。
肝细胞结结复合物中蛋白质在胆汁结结复合物组织中的重要性已在几个敲除小鼠模型中得到了很好的记录，这些模型显示缺乏紧固和/或粘附结蛋白4、5、6的小鼠体内的canaliculi失真。分离粘结蛋白β-卡腾宁已被证明会导致肝细胞细胞骨架的分裂，胆汁的扩张，渗漏的紧结，并有效地到胆静表型4。此外，体外研究表明，粘结成分E-cadherin和β-卡泰宁在重塑肝细胞表皮和蛋白质贩运7中的重要性。
引人注目的是，细胞骨架交联蛋白plectin的消融，这是主要的角蛋白组织者，揭示了与行为蛋白细胞骨架8相关的表型。这表明角蛋白中间丝在支撑角膜结构方面起着关键作用。利用3D肝细胞胶原蛋白三明治的体外研究也表明AMP活性蛋白激酶及其上游活化剂LKB1在胆汁结膜网络形成9中的重要性。这些发现随后的体内研究10、11进一步证实。因此，很明显，体外研究是必要的，以进一步了解信号过程涉及建立肝细胞极化，适当的角膜网络形成和胆汁分泌。
研究与胆汁形成过程及其在体外对病理情况的反应时，一个主要挑战是使用与体内情况非常相似的细胞培养条件。新鲜分离的原发性肝细胞不偏振;因此，在2D培养条件下（例如，基因调节、极化和去分化13、14、15）的变化，它们失去了功能、形态和功能性胆汁。尽管如此，新分离的肝细胞最密切地反映了肝脏在体内的性质，不像肝衍生细胞系16。即使它们在过去被使用，不朽的细胞系不发挥肝细胞的上皮状特征形态，这些细胞形成的胆汁状流明类似于肝卡纳利卡利差7。最近，来自小鼠和大鼠的原发性肝细胞的3D培养物已成为研究胆囊膜网在体外形成过程的有用工具。在两层胶原蛋白（称为3D胶原蛋白三明治培养物）之间培养的初级肝细胞可在几天内重新极化。由于在3D胶原蛋白三明治中培养小鼠肝细胞时需要很高的技术要求，在这里我们提出了一个复杂的方案来分离、培养和免疫标签小鼠肝细胞，这些细胞嵌入在3D胶原蛋白三明治中，以表征胆管形成过程中细胞骨骼成分的介入。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arteriotomy Cannula (1mm)</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I. from Rat tail (3mg/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (from Clostridium Hystolyticum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose monohydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Pufferan</td>
			<td>G 05104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (5000 U/mL)</td>
			<td>Zentiva</td>
			<td>8594739026131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T888.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump Minipuls Evolution</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F110701, F110705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-2124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided black</td>
			<td>Chirmax</td>
			<td>EP 0.5 &#8211; USP 7/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 2 ml</td>
			<td>Chirana</td>
			<td>CH002L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Nuve</td>
			<td>NB 9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 &#956;m, diam. 47 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA7402004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>2629-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Vibrac</td>
			<td>VET00083</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro

肝细胞是肝脏负责其代谢功能的中心细胞。因此，它们形成了一个独特的极化上皮，其中两个或两个以上肝细胞贡献锥形膜，形成胆汁的膜网络，通过它分泌胆汁。肝细胞极化对于正确的眼形形成至关重要，取决于肝细胞细胞骨骼、细胞-细胞接触和细胞外基质之间的相互作用。肝细胞细胞骨架参与卡纳利卡利形成及其对病理情况的反应的体外研究因缺乏细胞培养而受到阻碍，这与体内的卡纳利卡利网络结构非常相似。这里描述的是使用改良胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏分离小鼠肝细胞的协议。还描述了在3D胶原蛋白夹心设置中的培养物，用于细胞骨骼成分的免疫标签，以研究胆汁形成及其对体外治疗的反应。结果表明，肝细胞3D胶原蛋白三明治培养对毒素（乙醇）或活性球体细胞骨架改变药物（如白细胞生成）的治疗有反应，并作为体外研究胆汁形成和功能的宝贵工具。

小鼠原发性肝细胞被分离，并播种在3D胶原蛋白三明治。两个相邻细胞之间的Bile canaliculi在播种后几小时内开始形成。细胞在1天内形成簇状，并在大约常规的胆汁管网中自组织（图4）。在3~6天内，通常观察到5~10个细胞的簇，完全极化的肝细胞形成眼膜网络（图4）。
用毒素（乙醇）或细胞骨架改变药物（例如， 比比斯塔丁，奥卡代酸）导致肝细胞细胞骨架的变化，卡纳利卡利宽度，形状，和胆汁的数目，通过免疫标记与抗体角蛋白8（肝细胞中最丰富的角蛋白），方体素（可视化F-actin），和抗体紧结蛋白Zonula-1（ZO-1）;图 5.
乙醇处理对角蛋白8的组织影响不大;然而，它增加了胆汁的扭曲度（从F-actin染色中看）和胆汁眼宽度的分布（图5）。与未经处理的对照组相比，在乙醇处理的胆汁罐中，ZO-1染色的信号强度降低，表明乙醇处理后紧密结的丧失。对胆碱的收缩性抑制对胆汁的成形和数量有显著影响。与未经治疗的肝细胞相比，常规的单管网络被重新组织，形成形状混乱的胆汁，增加厚圆胆碱的发生率，而不是细长的（如在角状宽度的直方图中）。
此外，使用奥卡代酸（OA）抑制磷酸的治疗严重影响角蛋白的物理特性，如前所示8，17。OA改变角蛋白细丝的溶解度;因此，治疗结果导致角蛋白网状结构的深刻重组，这种网状结构坍塌成大型围核聚集体。F-actin 和紧密结蛋白 ZO-1 未局部化为任何特定结构，这表明组织胆汁几乎完全消失，肝细胞极性完全丧失。与未经处理的对照组相比，剩余的胆汁角明显缩小，如可点心宽度直方图（图5所示）。
为了将肝细胞细胞骨变化的微观观察与肝细胞生化对治疗的反应联系起来，该方案还测量了3D胶原蛋白三明治（图6）中上清液中丙肝细胞损伤标记的丙肝酶（ALT）和阿斯巴酯转氨酶（AST）的水平。乙醇治疗显著提高了ALT和AST的水平，表明严重的肝细胞损伤。与奥卡代酸治疗相比，Blebbisatin治疗没有导致ALT和AST水平的任何显著变化，后者触发了轻微的生化变化，ALT水平增加，但AST水平没有变化。因此，从肝细胞上清液体外测量的肝细胞损伤的生化标记与免疫染色观察到的细胞骨骼变化相关。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2.jpg"> 图1：实验设置。（A） 鼠标固定在苏西纳位置，在手术前被放置在解剖显微镜下。所有需要的手术器械都放在托盘上。（B） 小鼠肝脏灌注期间的灌注套件显示硅胶管连接储液罐与温暖的缓冲液和注入的小鼠。（C） B 的原理表表示形式<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig2v2.jpg"> 图2：腹腔开口和IVC的开罐。腹部用 V 形切口从到前腿。皮肤折叠在胸部，以暴露和扩大腹腔。为了暴露IVC，肠道和结肠被小心地移动。（A， B）在IVC的开气之前，应用PBS湿棉签将其向上压到隔膜上，以重新定位。然后，IVC 与周围组织小心分离，在肝脏附近将丝质缝合在 IVC 周围。面板 B 表示面板 A 中显示的腹腔示意图。表示肝叶、肠道、劣质文纳卡瓦（IVC、红色）和缝合。（C） 肝素用胰岛素注射器（30 G 针在 45° 角弯曲）注射到门户静脉（PV，箭头）。（D） 为了使肝脏精化，IVC 直接在肝脏旁边（缝合线下方）被切开。（E） 通过绑两个手术结插入并固定缝合管。（F） 门静脉完全切开，允许自由缓冲流出，防止肝脏扩张。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig2alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig3v2.jpg"> 图3：灌注前后的代表性肝脏图像。（A， B）可裂化肝脏以2.5 mL/min的流速被切除并注入12分钟。 注意灌注后明显变色的肝脏（B）与刚切除的肝脏（A）。注意。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig3alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig4v2.jpg"> 图4：原小鼠肝细胞的3D胶原蛋白三明治培养。在 3D 条件下培养 1、2 和 3 天的小鼠原肝细胞的代表性亮场图像。应该注意的是，在培养3天后形成更大的高组织细胞团。盒装区域显示 +3 倍放大的图像。箭头表示胆汁。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig4alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig5v2.jpg"> 图5：免疫荧光显微镜对毒性应激的形态反应评价。在3D胶原蛋白三明治中培养的原产小鼠肝细胞在培养的第3天用毒素（乙醇、二巴他沙丁或奥卡代酸）进行处理。固定细胞被染色以可视化细胞骨骼成分：角蛋白8（绿色），F-actin（红色）和色原闭塞-1（ZO-1，品红色）通过免疫荧光。毒性处理导致可视化细胞骨骼成分的分解，减少了胆汁的数量减少，增加了胆汁的侵权行为。在未经治疗和经过治疗的肝细胞中测量了角状宽度，并描述为宽度分布的直方图。箭头表示胆汁。比例尺 = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig5alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig6v2.jpg"> 图6：3D肝细胞胶原蛋白三明治对体外毒性损伤反应的生化分析。ALT和AST是肝细胞损伤的成熟标志物，用3D肝细胞胶原蛋白三明治（乙醇、二巴他沙丁和奥卡代酸）的上清液进行测量。与未经治疗的细胞相比，ALT和AST在治疗细胞中升高。数据报告为算术手段 = SEM.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig6alarge.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">库存解决方案 A （10 倍）</td>
		</tr>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>最终浓度（克/升）</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>80</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4+7H2O</td>
			<td>1.97</td>
		</tr>
<tr>
<td>纳2HPO4+2H2O</td>
			<td>0.598</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1：库存解决方案配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">库存解决方案 B （10x）</td>
		</tr>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td>最终浓度（克/升）</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>氯化钾</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>1.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4+7H2O</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2.772</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2：库存溶液 B 配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">解决方案 C</td>
		</tr>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>库存解决方案 A （10 倍）</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0.1094克</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
			<td>0.0095克</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>到 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3：库存溶液 C 配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">解决方案 D</td>
		</tr>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>库存解决方案 A （10 倍）</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0.065克</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.0125克</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>到 30 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4：库存溶液 D 配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">解决方案 E</td>
		</tr>
<tr>
<td>试剂</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>库存溶液 B （10x）</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0.1 克</td>
		</tr>
<tr>
<td>葡萄糖</td>
			<td>0.045克</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>到 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表 5：库存溶液 E 配方。

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Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

这里介绍的是一个协议，使用改良的胶原酶灌注技术从成年小鼠肝脏分离小鼠肝细胞。还描述了肝细胞在3D胶原蛋白夹层设置中的长期培养，以及细胞骨骼成分的免疫标签，以研究胆汁癌形成及其对治疗的反应。

原原小鼠肝细胞的分离和3D胶原蛋白三明治培养，研究细胞骨架在胆汁形成中的作用

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

该协议有助于小鼠肝细胞在3D胶原蛋白夹层环境中的分离和可重复的长期培养，以研究规范结构的形成及其对体外治疗的反应。一旦掌握了这项技术，它是获取大量高可行和纯小鼠肝细胞种群用于体外研究的快速方法。演示该程序将是伦卡萨诺娃，一个技术人员从我们的实验室。原发性肝细胞分离前一天，在500微升中加入100微升10X DMEM、485微升蒸馏水，以及15微升1微升1微升的1微升氢氧化钠，加入鼠尾胶原蛋白1。检查中和胶原蛋白的 pH 值。应该是 7.5 。使用预冷的 200 微升移液器尖端，将 100 微升中和胶原蛋白溶液铺在冰上每个直径为 3.5 厘米的塑料培养盘上，并在标准培养条件下放置餐具过夜。第二天早上，每盘37摄氏度PBS的一毫升补充水合，在37摄氏度下至少3小时。为了分离肝脏，在确认对手趾捏没有反应后，将麻醉小鼠放在解剖垫上，放在上部位置，然后将下肢和上肢胶带固定到垫子上。用 70% 乙醇擦拭腹部，从区域到每个前肢进行 V 形切口。将皮肤折叠在胸前以发现腹腔，将垫子置于解剖显微镜下。将小肠和结肠在结膜方向上移动，以暴露 IVC，并加载一个两毫升注射器，其中 2.5 毫升的 37 摄氏度溶液 C. 将注射器连接到管，并使用 PBS 浸泡棉签将肝脏压到隔膜上。在肝脏下方的 IVC 周围放置一个浸泡的缝合线。然后使用装有30量针弯曲到45度角的胰岛素注射器，将每毫升肝素5000单位的10微升注射到门户静脉中。为了使肝脏凝固，使用显微手术剪刀在肝脏旁边的 IVC 中做一个小切口，并将管插入切口。用缝合线和两个手术结固定管，并切断入口静脉，让灌注缓冲液从肝脏流出。然后缓慢压抑注射器柱塞，用两毫升溶液在约15秒内将肝脏用两毫升溶液进行足量。交付所有溶液后，预先为内维泵加注新鲜 37 摄氏度溶液 C，并检查灌注装置，确保系统中没有气泡。小心地将管子与注射器断开，并快速但小心地将正在运行的近位泵的管子连接到管。立即以每分钟 2.5 毫升的流速开始灌注。两分钟后，切换到解决方案 D 并继续灌注 10 分钟。灌注结束时，小心地将肝脏收获成一个50毫升的圆锥管，含有20毫升37摄氏度溶液E.To分离原发性肝细胞，用导管握住肝脏，将管壁周围的组织揉入缓冲液中。当所有组织都捣碎后，将组织浆料转移到70微米孔尼龙过滤器中，将分离的细胞过滤成新的50毫升管。通过离心沉淀肝细胞，并在DMEM中将颗粒重新悬浮在20毫升40%Percoll中。通过离心分离活细胞和死细胞，并在溶液E的20毫升中重新给颗粒。在再次离心细胞后，将颗粒重新在10毫升新鲜溶液E中重新下水进行计数。计数后，将原肝细胞计数调整为3.75倍10，以每毫升肝细胞培养基的5个可行细胞。要培养3D胶原蛋白三明治中分离的原发性肝细胞，请使用一毫升移液器将两毫升细胞均匀地分配到每个胶原蛋白涂层的3.5厘米直径的培养皿上。将细胞放在细胞培养箱中三小时。在孵育过程中，准备100微升中和鼠尾胶原蛋白，每盘一个溶液，如证明。在孵育结束时，小心地用每盘100微升中和胶原蛋白替换中和未连接的细胞，将板回细胞培养箱一小时。当胶原蛋白凝固后，在每道菜中仔细添加两毫升新鲜肝细胞培养基，并将培养物返回孵化器，每天在显微镜下检查培养物。对于3D胶原蛋白三明治中原生肝细胞的免疫标记，用37摄氏度的PBS仔细清洗每个三明治，并在室温下用每盘PBS中4%的半基甲醛固定培养物30分钟。在固定结束时，用两毫升 PBS 洗三次 10 分钟，每次洗涤 0.1% Tween 20。上次洗涤后，在PBS中用1毫升0.1摩尔甘氨酸和0.2%Triton X-100渗透细胞，在室温下渗透一小时，随后在PBS和Tween 20中进行三次洗涤，正如刚刚证明的。接下来，使用连接到真空的 10 微升负载尖端轻轻干扰胶原蛋白的顶层，并阻止任何非特异性结合与 PBS Tween 中一毫升 5%牛血清白蛋白结合两个小时。在孵育结束时，将主要抗体稀释在每道菜的阻断溶液中，并在37摄氏度下孵育过夜。第二天早上，用PBS Tween洗三个15分钟的盘子，然后用适当的二次抗体在37摄氏度下标记5个小时。在孵化结束时，用PBS Tween洗涤两次，用蒸馏水洗涤一次，在用抗褪色安装介质进行显微镜安装之前，演示。在3D胶原蛋白三明治播种的一天内，小鼠原发性肝细胞形成集群，并在大约常规的胆汁管中形成集群和自组织。在三到六天内，通常观察到5至10个细胞的簇，完全偏振的肝细胞形成一个运河网络。使用毒素或细胞骨架改变药物的治疗会导致肝细胞骨架和胆汁的宽度、形状和数量发生变化。虽然乙醇处理对角蛋白8的组织只表现出轻微的影响，但它增加了胆汁管宽度的折磨和分布。与未经处理的对控相比，ZO-1染色的信号强度在乙醇处理胆汁中降低，表明乙醇处理后类型结会丧失。与布莱比斯塔汀的可延美性抑制诱导形成无序形状、厚、圆的胆汁。此外，使用冈田酸治疗可抑制磷酸盐，严重影响角蛋白的物理特性，导致胆碱与未经治疗的对法相比明显缩小。此外，乙醇治疗显著提高丙氨酸和阿斯巴酸氨基转移酶的水平，表明严重的肝细胞损伤，而布莱比斯塔汀治疗不导致任何考虑变化的转氨酶水平和冈田酸治疗触发轻微的生化变化的丙氨酸氨基转移酶，但无一糖核酸氨基转移酶表达的变化。在灌注过程中和灌注开始时保持相对快速的工作，避免气泡进入灌注系统，这一点很重要。细胞酸盐可以在重复的井中收集感兴趣的蛋白质，以确定在治疗过程中是否发生蛋白质表达和/或活化阶段的变化。

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

小鼠表皮角质细胞的分离及其体外克隆培养物

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

多参数灌注对照分离原代大鼠肝细胞

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...