Name: isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro
Uploaded: 2019-12-20T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dall'Agenzia Grant della Repubblica Ceca (18-02699S); l'Agenzia Grant del Ministero della Sanità della Repubblica Ceca (17-31538A); il Progetto di Ricerca Istituzionale dell'Accademia Ceca delle Scienze (RVO 68378050) e i progetti MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI C.1.05/2.1.00/19.0395 e OP RDE C.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Charles University (stipend a K.K.) e un progetto di programma operativo Praga-Competitività (C.2.16/3.1.00/21547). Riconosciamo il Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Repubblica Ceca (supportati progetti MEYS CR LM2015062 e LO1419) per il supporto con l'imaging a microscopia presentato.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità alla direttiva europea 2010/63/UE e sono stati approvati dalla Commissione centrale ceca per il benessere degli animali.
1. Materiali
<ol><li>Animali da casa in condizioni specifiche prive di agenti patogeni secondo le linee guida della Federazione per le associazioni di scienze animali di laboratorio con libero accesso a tempo in chiosco regolare e acqua potabile. Animali da casa in un ciclo di 12 h/12 h di buio. Per l'isolamento e la cultura degli epatociti, usa animali di età 8-12 settimane.</li>
	<li>Soluzioni stock A e B<ol>
<li>Preparare in anticipo la soluzione stock A e la soluzione stock B in base alla tabella 1 e alla tabella 2. Sciogliere tutti i componenti in 1 L di distillato H2O (dH2O).</li>
		<li>Regolare il pH delle soluzioni a 7,2 e filtrare le soluzioni con un filtro di 0,2 m. Entrambe le soluzioni possono essere conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzione Stock C<ol>
<li>Preparare la soluzione C il giorno dell'isolamento primario degli epatociti.</li>
		<li>Aggiungere tutti i componenti in base alla tabella 3, riempire fino a un volume totale di 50 mL con dH2O e dissolvere. Regolare il pH a 7.3.</li>
		<li>Aliquota 50 mL della soluzione in tubi da 50 mL. Utilizzare un tubo per animale. Mettere tutte le aliquote richieste in un bagno d'acqua preriscaldato (37 gradi centigradi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzione stock D<ol>
<li>Preparare la soluzione D il giorno dell'isolamento primario degli epatociti.</li>
		<li>Aggiungere tutti i componenti in base alla tabella 4, riempire fino a un volume totale di 30 mL con dH2O e dissolvere. Regolare il pH a 7.3.</li>
		<li>Aliquota 30 mL della soluzione in tubi da 50 mL. Aggiungere collagenase I (5 mg/30 mL) nella soluzione D. Utilizzare uno per animale. Collocare tutte le aliquote in un bagno d'acqua preriscaldato (37 gradi centigradi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzione stock E<ol>
<li>Preparare la soluzione E il giorno dell'isolamento primario degli epatociti.</li>
		<li>Aggiungere tutti i componenti in base alla tabella 5, riempire fino a un volume totale di 50 mL con dH2O e dissolvere. Regolare il pH a 7.3.</li>
		<li>Aliquota 50 mL della soluzione in tubi da 50 mL. Aggiungere albumin V (0,65 g/50 mL) nella soluzione E. Usane uno per animale. Collocare tutte le aliquote in un bagno d'acqua preriscaldato (37 gradi centigradi).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione di panini al collagene
<ol><li>Un giorno prima dell'isolamento primario di epatociti, prepara il primo strato del sandwich al collagene I. NOTA: Lavorare sul ghiaccio e utilizzare soluzioni pre-raffreddate, punte, piastre e tubi per ridurre al minimo la gelazione indesiderata del collagene I.</li>
	<li>Neutralizzare la quantità richiesta di collagene I (dalla coda del ratto) secondo il protocollo del produttore. È richiesto un volume di 100 l di collagene neutralizzato (1,5 mg/mL) per campione sperimentale (piatto da 3,5 cm). Per preparare 1 mL di collagene neutro (1,5 mg/mL), aggiungere 100 L di 10x DMEM, 1,5 l di 1M NaOH e 48,5 L di dH2O in 500 o di collagene (concentrazione di scorte: 3 mg/mL). Controllare il pH del collagene neutralizzato con cartina di tornasole (il pH dovrebbe essere di 7,5).</li>
	<li>Disperdere in modo uniforme 100 l di collagene neutro utilizzando una punta pre-raffreddata da 200 -L sulla superficie di un piatto di 3,5 cm impostato sul ghiaccio.</li>
	<li>Incubare durante la notte in condizioni di coltura standard (incubatore con 5% DI CO2 a 37 gradi centigradi). Il giorno dell'isolamento primario degli epatociti, aggiungere 1 mL di PBS preriscaldato (37 gradi centigradi) al primo strato di collagene. Lasciare che il collagene si reidrati per 2-3 ore a 37 gradi centigradi.</li>
</ol>3. Attrezzature
<ol><li>Preparare tutte le attrezzature elencate nella tabella dei materiali e impostate come illustrato nella Figura 1.</li>
</ol>4. Procedura chirurgica
<ol><li>Anestetizzare il topo per iniezione intramuscolare di tiletamina (60 mg/kg di peso corporeo), zolazepam (60 mg/kg) e xylazina (4,5 mg/kg). Dopo alcuni minuti, confermare l'anestesizzazione corretta per il pizzico del dito del dito. Se l'animale non risponde al pizzico, procedere a 4.2.</li>
	<li>Posizionare il mouse anetizzato su un tappetino di dissezione e nastro le estremità inferiore e superiore per fissare il mouse in una posizione supina. Sfregi l'addome con il 70% di etanolo e apri l'addome con un'incisione a forma di V dalla zona pubica alle zampe anteriori. Piegare la pelle sul petto per scoprire la cavità addominale. Posizionare il tappetino di dissezione sotto un microscopio sezionato.</li>
	<li>Piegare un ago di siringa di insulina (30 G) ad un angolo di 45 gradi. Esporre la vena cava inferiore (IVC) muovendo l'intestino e il colon in direzione caudale.</li>
	<li>Riempire 2,5 mL di soluzione C preriscaldata (37 gradi centigradi) in una siringa da 2 mL con una cannula. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella cannula o nella siringa.</li>
	<li>Prima della concanolazione dell'IVC, riposizionare i lobi epatici premendoli fino al diaframma con un tampone di cotone bagnato (PBS). Posizionare una sutura di seta intorno all'IVC appena sotto il fegato (Figura 2A,B).</li>
	<li>Iniettare 10 l di eparina (5000 U/mL) nella vena del portale utilizzando una siringa di insulina con un ago di 30 G piegato ad un angolo di 45 gradi (Figura 2C).</li>
	<li>Per cannulare il fegato, fare una piccola incisione con forbici microchirurgiche all'IVC direttamente accanto al fegato (sotto la sutura; Figura 2D) che è abbastanza grande per inserire la cannula. Fissare la cannula in posizione utilizzando suture e due nodi chirurgici (Figura 2E).</li>
	<li>Tagliare la vena del portale (Figura 2F) per consentire ai buffer di perfusione di fuoriuscire dal fegato per impedire l'espansione del fegato.</li>
	<li>Perfondere manualmente il fegato con 1,5 mL di soluzione preriscaldata C premendo lentamente la siringa collegata alla cannula (questo dovrebbe richiedere 15 s). La rimozione del sangue dal fegato da scolorimento del fegato può ora essere osservata.</li>
	<li>Pre-riempire una pompa peritale con soluzione preriscaldata (37 gradi Centigradi) C. Controllare l'apparato perfusione e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel sistema.</li>
	<li>Scollegare con cautela la cannula dalla siringa e collegarla al tubo della pompa peristaltica in esecuzione alla portata di 2,5 mL/min. Lavorare rapidamente ma con attenzione e assicurarsi che la cannula rimanga in posizione e che nessuna bolla entri nel tubo o nella cannula.</li>
	<li>Perfondere il fegato con soluzione C per 2 min (5 mL della soluzione C). Passare alla soluzione D e continuare la perfusione per ulteriori 10 min (25 mL di soluzione D).</li>
	<li>Una volta che il fegato è stato perfuso, rimuoverlo dalla cavità addominale. Il fegato sarà ora molto fragile e di colore pallido (Figura 3).</li>
</ol>5. Isolamento degli epatociti primari
<ol><li>Rimuovere il fegato dal mouse. La cannula sarà ancora legata al fegato, quindi usa le pinze per sollevare la cannula con il fegato e tagliare con attenzione tutte le connessioni fascia. Trasferire il fegato in un tubo da 50 mL contenente 20 mL di soluzione preriscaldata E.</li>
	<li>Tenere la cannula con il fegato utilizzando pinze e dissociare il tessuto strofinando il fegato intorno alla parete del tubo per trasferire gli epatociti isolati in tampone. Tenere le cellule isolate sul ghiaccio. NOTA: Gli epatociti primari isolati sono vitali per diverse ore mentre sono rimasti sul ghiaccio. Gli utenti possono ripetere i passaggi da 4.1 a 5.2 isolando gli epatociti primari da un altro topo donatore, se necessario, o procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Posizionare un colino a celle di nylon di 70 m sopra un tubo da 50 mL e filtrare le celle isolate.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 50 x g e 4 gradi centigradi per 5 min. Aspirate il supernatante. Per rimuovere le cellule morte e aumentare la percentuale di cellule vitali, risospensione del pellet in 20 mL del 40% percol in DMEM.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 50 x g e 4 gradi centigradi per 5 min. Aspirate il supernatante contenente cellule morte e risospendere il pellet in 20 mL di soluzione E.</li>
	<li>Centrifuga i tubi a 50 x g e 4 gradi centigradi per 5 min. Aspirate il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di soluzione E.</li>
	<li>Controllare la resa e la vitalità primaria dell'epatocito utilizzando la colorazione blu trypan. Contare il numero di cellulare utilizzando una camera di conteggio cellulare Neubauer e regolare la concentrazione cellulare a 3,75 x 105 cellule vitali / mL. Tieni le cellule sul ghiaccio.</li>
</ol>6. Coltivazione di epatociti primari in panini di collagene 3D
<ol><li>Preparare il mezzo di coltura dell'epatocito (HCM). Aggiungere 15 l di glucagon (1 mg/mL), 15 l di idrocortisone (50 mg/mL) e 40 -L di insulina (10 mg/mL) a 50 mL di mezzo completo (DMEM, glucosio alto, 10% FBS, 1% penicillina-streptomia).</li>
	<li>Disperdere uniformemente 2 mL (5 x 105 celle/mL) di epatociti primari vitali in un piatto pre-rivestito di 3,5 cm. Incubare le cellule con 5% di CO2 a 37 gradi centigradi per 3 h. Importante: Distribuire uniformemente le cellule inclinando il piatto in tutte le direzioni appena prima di mettere il piatto in incubatrice.</li>
	<li>Preparare il collagene neutro I (100 gradini l/3,5 cm; cioè un volume sufficiente per tutti i piatti come descritto sopra [passaggio 2.1]). Tenere sul ghiaccio fino all'uso.</li>
	<li>Dopo 3 h, rimuovere con cura le cellule medie e non attaccate e aggiungere 100 l di collagene neutro I a ogni piatto di 3,5 cm per formare lo strato superiore di sandwich di collagene sulle cellule. Incubare il sandwich di collagene in condizioni di coltura cellulare standard (5% CO2 a 37 gradi centigradi) per 1 ora. Dopo un incubazione di 1 h, aggiungere con attenzione 2 mL di HCM.</li>
	<li>Dopo 24 h di cultura, cambiare il mezzo HCM per uno nuovo.</li>
	<li>Cultura per 3-8 giorni, a seconda della formazione di biliculi biliari. Controllare la coltura ogni giorno al microscopio (Figura 4). Cambiare HCM ogni secondo giorno.</li>
</ol>7. Immunolabeling degli epatociti primari nei panini 3D di collagene
<ol><li>Rimuovere il supporto dai panini epatociti, quindi lavare con cura con PBS preriscaldato. Fissare le colture sandwich con 1 mL del 4% di paraformaldeide in PBS per 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Dopo la fissazione, lavare i panini 3 x per 10 min in 2 mL di PBS - 0,1% Tween 20 (PBS-T).</li>
	<li>Permeabilize cellule con 1 mL di 0,1 M glicina, 0.2% Triton X-100 in PBS a RT per 1 h. Lavare 3x per 10 min in PBS-T.</li>
	<li>Disturbare delicatamente lo strato superiore di collagene utilizzando una punta di carico di 10 -L collegata a un'aspirazione di vuoto per garantire una sufficiente penetrazione degli anticorpi.</li>
	<li>Blocco con 1 mL del 5% di BSA in PBS-T (cioè soluzione di blocco) per 2 h. Incubazione con anticorpi primari diluiti in soluzione di blocco durante la notte a 37 gradi centigradi. Lavare 3x per 15 min in PBS-T.</li>
	<li>Dopo il lavaggio, incubare con anticorpo secondario a 37 s per 5 h. Lavare 3x per 15 min in PBS-T seguito da 1x lavaggio con distillato H2O.</li>
	<li>Montaggio con supporti di montaggio anti-dissolvenza (vedere Tabella dei materiali)per la microscopia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gissen, P., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+hepatocyte+polarity+and+liver+disease.">Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease.</a> Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).</li><li>LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+maintenance+of+bile+canalicular+networks+in+collagen-sandwiched+hepatocytes.">Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes.</a> Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).</li><li>Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'uso di colture di epatociti primari epatociti primari e patociti topi è importante per gli studi in vitro per comprendere meglio i processi di segnalazione coinvolti nella creazione della polarizzazione degli epatociti, della corretta formazione della struttura canalica e della secrezione della bile. Le sfide nell'isolamento e nella coltura a lungo termine degli epatociti primari del topo nella cultura 2D hanno guidato l'invenzione di diversi approcci tecnici con una maggiore efficacia di isolamento e longevità delle cellule isolate, ognuno con diversi vantaggi e Svantaggi. È ormai ampiamente accettato che le colture 2D degli epatociti primari imitano solo un numero limitato di attributi della biologia epatica per un breve periodo di tempo. Pertanto, la coltivazione 3D in una disposizione sandwich di collagene sta ampiamente sostituendo le condizioni 2D, in particolare quando si concentra sulla funzione del citoscheletro nella biologia epatica (ad esempio, effetti di droga tossici o organizzazione spaziale del trasporto biliare).
A partire dagli anni '80, sono stati descritti diversi protocolli per l'isolamento degli epatociti del topo con varie modifiche. L'approccio a due fasi della perfusione di collagenasi è diventato ampiamente utilizzato in molti laboratori. L'aggiunta della centrifugazione del gradiente nel protocollo di isolamento consente la rimozione delle cellule morte19,20 e aumenta significativamente il numero di cellule vitali (qui, regolarmente al 93%). Anche se questo passo estende il tempo di gestione delle cellule e si traduce in numeri di cellule ridotte21, questo passaggio è visto come necessario nella coltura panino di collagene 3D per una corretta formazione della rete biliare. Inoltre, è più importante procedere rapidamente e con precisione durante le fasi di perfusione, il che riduce il tempo di gestione delle cellule.
Altri fattori importanti che aumentano la vitalità delle cellule e la loro capacità di formare reti cocanacolari in 3D è l'uso di soluzioni appena preparate ed evitare bolle durante la perfusione. Pertanto, le soluzioni devono essere preparate il giorno dell'isolamento degli epatociti del topo, e la pompa peristaltica e il tubo devono essere controllati quando si cambiano le soluzioni. Se il protocollo è seguito da vicino, l'isolamento degli equaliciti primari dovrebbe avere successo con un alto rendimento di cellule vitali.
Un altro fattore critico nella cultura degli epatociti 3D a lungo termine è la fonte iniziale di epatociti primari che vengono utilizzati. È importante utilizzare animali di età che hanno 8-12 settimane, che servono come donatori ottimali di epatociti. L'uso di epatociti da animali più anziani non ebbe lo stesso successo nella cultura a lungo termine, poiché questi epatociti cambiarono la loro morfologia più spesso, si depolarizzarono e cessarono di formare reti collerie. Inoltre, la placcatura degli epatociti su gel di collagene correttamente neutralizzati formata da una soluzione relativamente altamente concentrata è un passo vitale. Nella maggior parte dei protocolli, vengono utilizzate concentrazioni di circa 1 mg/mL. Dopo molte ottimizzazioni, una concentrazione di 1,5 mg/mL è ottimale per la coltivazione di epatociti a lungo termine e fornisce epatociti altamente organizzati con canalicolo biliari formati.
Questo protocollo facile da seguire permette la coltivazione a lungo termine di epatociti primari del topo. I risultati rappresentativi dimostrano un ampio spettro di utilizzo per gli epotociti del topo primario coltivato in 3D quando studiano il ruolo delle componenti citoscheletriche nella formazione di canalicelli bilicolari.

Gli epatociti, le strutture cellulari centrali del fegato che sono responsabili delle sue funzioni metaboliche, sono cellule epiteliali polarizzate in modo univoco. La loro polarizzazione, che appare nei mammiferi poco dopo la nascita, si traduce nella formazione della rete canalicolare biliare ed è essenziale per una corretta secrezione. Le membrane apicaliche degli epatociti formano collettivamente bilicanali, mentre le membrane basali rimangono in contatto con l'endotelio dei sinusoidi. La perdita di polarizzazione degli epatociti porta alla ridistribuzione dei trasportatori di bile e si traduce in processi patologici connessi con la ritenzione biliare nel fegato (cioè la colestasi).
L'istituzione e il mantenimento della polarizzazione degli epatociti e lo sviluppo di canalicolai biliari comportano meccanismi complessi. I processi sottostanti dipendono dall'interazione collettiva tra il citoscheletro epatocito, i contatti cellulare e le interazioni con la matrice extracellulare1. Il citoscheletro epatocite è costituito da tutte e tre le reti di filamento, il citoscheletro actina, i microtubuli e i filamenti intermedi, che forniscono supporto strutturale per la formazione canalica. Il ruolo differenziale dei componenti citoscheletrici nella rigenerazione e nella manutenzione delle reti biliacolari è stato precedentemente illustrato in vitro nelle colture epatite 3D collagene-sandwich2.
Microfilamenti di Actin e microtubuli sono importanti durante le fasi iniziali della polarizzazione della membrana epatocitica nei siti del canaliculus generazione2. Il citoscheletro actin stabilisce la struttura e la funzione dei bilecanaliculi, formando microfilamenti associati alla membrana e l'anello circonferenziale, sostenendo così l'architettura canalicolare e inserendo il citoscheletro actino nelle giunzioni strette e aderenti3. L'anello di filamenti intermedi di cheratina al di fuori del citoscheletro actina stabilizza ulteriormente la struttura canalicolare3.
L'importanza delle proteine nei complessi giunzionali epatociti nell'organizzazione dell'architettura biliare canaliculi è stata ben documentata in diversi modelli murini knock-out, che mostrano canaliculi distorti nei topi privi di proteine junctionali sia strette che/o aderenti4,5,6. È stato dimostrato che la delezione della proteina di giunzione aderisce a ondosi di catena di lavoro per portare alla disorganizzazione del citoscheletro dell'epatocito actin, alla dilatazione dei lumen biliari, alle giunzioni strette che perdono, e in effetti a un fenotipo colestatico4. Inoltre, gli studi in vitro hanno dimostrato l'importanza di aderire componenti giunzione E-cadherin e z-catenina nel rimodellamento del lumame apicale epatocellulare e del traffico di proteine7.
Sorprendentemente, l'ablazione del citoscheletro che attraversa la pletcina proteica, che è il principale organizzatore della cheratina, ha rivelato fenotipi paragonabili a quelli collegati al citoscheletro actina8. Questo suggerisce un ruolo critico dei filamenti intermedi di cheratina nel sostenere la struttura canalicolare. Gli studi in vitro che utilizzano sandwich di collagene epatociti 3D hanno anche dimostrato l'importanza della chinasi proteica attivata da AMP e del suo attivatore a monte LKB1 nella formazione della rete biliare della rete canalicolare9. Questi risultati sono stati poi ulteriormente confermati da successivi studi in vivo10,11. Così, è diventato chiaro che gli studi in vitro sono necessari per approfondire la comprensione dei processi di segnalazione coinvolti nella creazione della polarizzazione degli epatociti, nella corretta formazione della rete canalica e nella secrezione della bile.
Una sfida importante nello studio dei processi legati alla formazione canaliculare della bile e della sua risposta alle situazioni patologiche in vitro è l'uso di condizioni di coltura cellulare che assomigliano molto alla situazione in vivo12. Gli epatociti primari appena isolati non sono polarizzati; così, perdono la loro funzione, morfologia, e bile canaliculi funzionale in condizioni di coltura 2D (ad esempio, cambiamenti nella regolazione genica, polarizzazione, e de-differenziazione13,14,15). Nonostante questo fatto, gli epatociti appena isolati riflettono più da vicino la natura del fegato in vivo, a differenza delle linee cellulari derivate dal fegato16. Anche se sono state utilizzate in passato, le linee cellulari immortalate non esercitano la morfologia caratteristica epiteliale degli epatociti, e i canalghi canalicani canaliculari formati da queste cellule assomigliano al fegato scarsamente7. Recentemente, le colture 3D di etutociti primari, sia da topi che da ratti, sono diventate uno strumento utile per studiare i processi coinvolti nella formazione di reti biliari in vitro9. Gli epatociti primari coltivati tra due strati di collagene (indicati come una cultura di sandwich di collagene 3D) possono ripolarsi in diversi giorni. A causa delle elevate esigenze tecniche richieste durante la coltura degli epatociti del topo in sandwich di collagene 3D, qui presentiamo un protocollo complesso per isolare, coltivare e immunoetichettare gli epatociti del topo incorporati nei panini di collagene 3D al fine di caratterizzare il coinvolgimento di componenti biliareli durante la formazione del canale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arteriotomy Cannula (1mm)</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I. from Rat tail (3mg/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (from Clostridium Hystolyticum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose monohydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Pufferan</td>
			<td>G 05104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (5000 U/mL)</td>
			<td>Zentiva</td>
			<td>8594739026131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T888.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump Minipuls Evolution</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F110701, F110705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-2124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided black</td>
			<td>Chirmax</td>
			<td>EP 0.5 &#8211; USP 7/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 2 ml</td>
			<td>Chirana</td>
			<td>CH002L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Nuve</td>
			<td>NB 9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 &#956;m, diam. 47 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA7402004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>2629-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Vibrac</td>
			<td>VET00083</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro

Gli epatociti sono le cellule centrali del fegato responsabili della sua funzione metabolica. Come tali, formano un epitelio polarizzato in modo univoco, in cui due o più epatociti contribuiscono alle membrane apicali per formare una rete biliare attraverso la quale la bile viene secreta. La polarizzazione dell'epatocite è essenziale per la corretta formazione canalicolare e dipende dalle interazioni tra il citoscheletro epatocite, i contatti delle cellule cellulari e la matrice extracellulare. Gli studi in vitro sul coinvolgimento dei citoscheletri epatociti nella formazione dei canalicoli e la sua risposta alle situazioni patologiche sono ostacolati dalla mancanza di coltura cellulare, che assomiglierebbe molto alla struttura della rete canaliculi in vivo. Descritto qui è un protocollo per l'isolamento degli epatociti del topo dal fegato di topo adulto utilizzando una tecnica di perfusione collagenase modificata. Viene inoltre descritta la produzione di coltura in un sandwich di collagene 3D, che viene utilizzato per l'immunoetichettatura dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta ai trattamenti in vitro. È dimostrato che le colture di sandwich di collagene 3D epatocite rispondono ai trattamenti con tossine (etanolo) o actinoscheletro alterare i farmaci (ad esempio, blebbistatin) e servono come strumento prezioso per gli studi in vitro della formazione e della funzione dei canalicelli.

Gli epatociti primari del topo sono stati isolati e seminati in panini di collagene 3D. La bile canaliculi tra due celle adiacenti ha iniziato a formarsi entro diverse ore dopo la semina. Le cellule formavano ammassi e si auto-organizzate in una rete approssimativamente regolare di canaliculi biliari entro 1 giorno (Figura 4). Entro 3-6 giorni, gruppi di 5-10 cellule sono stati di solito osservati, con epatociti completamente polarizzati che formano una rete canalicolare (Figura 4).
Trattamento degli epatociti primari in sandwich di collagene 3D con tossina (etanolo) o citoscheletro-alterazione (ad esempio, la blebbistatina, l'acido okadaico) ha portato a cambiamenti nel citoscheletro dell'epatocite, nella larghezza, nella forma e nel numero di canali biliculi illustrati dall'immunoetichettatura con un anticorpo alla cheratina 8 (la cheratina più abbondante negli epatociti), la phalloidina (che visuale F-actin), e l'anticorpo alla proteina zonula occludens-1 (1- Figura 5).
Il trattamento con etanolo ha avuto solo un lieve effetto sull'organizzazione della cheratina 8; tuttavia, ha aumentato la tortuosità (come si è visto dalla colorazione F-actin) e la distribuzione delle larghezze biliacolari (Figura 5). L'intensità del segnale di colorazione di O-1 è stata diminuita nei canaliculi biliari trattati con etanolo rispetto ai controlli non trattati, suggerendo una perdita di giunzioni strette dopo il trattamento dell'etanolo. L'inibizione della contrattilità dell'actomiosina con la blebbistatina ha influenzato significativamente la forma e il numero di canaliculi biliari. La rete canalicolare regolare fu riorganizzata, rispetto agli epatociti non trattati, in canaliculi di forma disordinata con una maggiore incidenza di canaliculi arrotondati spessi invece di sottili e lunghi (come si vede nell'istogramma delle larghezze canaliculari).
Inoltre, il trattamento con acido okadaico (OA) inibitore fosfosi fortemente influenzato le proprietà fisiche della cheratina, come precedentemente mostrato8,17. OA cambia la solubilità dei filamenti di cheratina; così, il trattamento ha portato a una profonda riorganizzazione della mesh di cheratina, che è crollata in grandi aggregati perinucleari. Sia la proteina F-actin che la proteina giunzione stretta, ovvero l'O-1, non furono localizzate in particolari strutture, suggerendo una scomparsa quasi completa dei canalici organizzati e una completa perdita di polarità epatocite. I canaliculi della bile rimanenti erano significativamente ridotti rispetto ai controlli non trattati, come si vede nell'istogramma della larghezza canalicolare (Figura 5).
Per correlare osservazioni microscopiche dei cambiamenti nel citoscheletro epatocito con la risposta biochimica epatocellulare al trattamento, il protocollo ha anche misurato i livelli di aminotransferasi alanina (ALT) e transaminasi aspartate (AST) (due enzimi epatici che sono comunemente utilizzati come marcatori di lesioni eatutocellulari) insupernatant dai sandwich di collagene 3D(Figura 6)18. Il trattamento con etanolo ha notevolmente elevato i livelli di ALT e AST, suggerendo gravi lesioni epatocellulari. Il trattamento con blebbistatina non ha portato a cambiamenti considerevoli nei livelli ALT e AST rispetto al trattamento con acido okadaico, che ha innescato lievi cambiamenti biochimici con un aumento dei livelli di ALT, ma nessun cambiamento nei livelli di AST. Pertanto, i marcatori biochimici di lesione epatocellulare misurati in vitro da supernatante epatocitico sono correlati ai cambiamenti citoscheletrici osservati dall'immunostaining.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2.jpg"> Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Il topo fissato in una posizione supina, viene posto al microscopio dissezioso prima dell'intervento. Tutti gli strumenti chirurgici richiesti sono posizionati su un vassoio. (B) La suite di perfusione durante la perfusione del fegato di topo che mostra tubi in silicone che collegano il serbatoio con il tampone caldo e il topo perfuso. (C) Rappresentazione schematica di B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig2v2.jpg"> Figura 2: Apertura della cavità addominale e canonulazione dell'IVC. L'addome viene aperto con un'incisione a forma a V dalla zona pubica alle zampe anteriori. La pelle è piegata sul petto per esporre e ingrandire la cavità addominale. Per esporre l'IVC, l'intestino e il colon vengono accuratamente spostati caudalmente. (A, B) Prima della conduttura dell'IVC, i lobi epatici devono essere riposizionati premendoli verso l'alto verso l'alto verso il diaframma con un tampone di cotone bagnato da PBS. L'IVC viene quindi accuratamente separato dai tessuti circostanti, e una sutura di seta viene posizionata intorno all'IVC nelle immediate vicinanze del fegato. Il pannello B rappresenta gli schemi della cavità addominale mostrati nel pannello A. Sono indicati i lobi epatici, l'intestino, la vena cava inferiore (IVC, il rosso) e le suture. (C) L'eparina viene iniettata nella vena del portale (PV, freccia) con una siringa di insulina (30 G ago piegato ad angolo di 45 gradi). (D) Per cannulare il fegato, l'IVC viene inciso direttamente accanto al fegato (sotto la sutura). (E) La cannula viene inserita e fissata con suture legando due nodi chirurgici. (F) La vena del portale è completamente tagliata per consentire il deflusso del buffer libero, impedendo l'espansione del fegato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig2alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig3v2.jpg"> Figura 3: Immagini epatiche rappresentative prima e dopo la perfusione. (A, B) Il fegato cannulato è stato resbito e perfuso per 12 min ad una portata di 2,5 ml/min. Notare il fegato significativamente scolorito dopo la perfusione (B) rispetto al fegato appena resected (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig3alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig4v2.jpg"> Figura 4: cultura panino di collagene 3D di epatociti topi primari. Rappresentante immagini a campo luminoso di epaticiti primari di topo coltivati per 1, 2 e 3 giorni in condizioni 3D. Va notato che i gruppi più grandi di cellule altamente organizzate si formano dopo 3 giorni di coltura. Le aree in scatola mostrano immagini ingrandite da 3 volte. Le punte di freccia indicano il bile canaliculi. Barra di scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig4alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig5v2.jpg"> Figura 5: Valutazione della risposta morfologica allo stress tossico mediante microscopia immunofluorescente. Gli epatociti primari coltivati in sandwich di collagene 3D sono stati trattati con tossine (etanolo, blebbistatina o acido okadaico) il terzo giorno della cultura. Le cellule fisse sono state macchiate per visualizzare i componenti citoscheletrici: cheratina 8 (verde), F-actin (rosso) e zonula occludens-1 (o-1, magenta) per immunofluorescenza. Il trattamento tossico portò alla disorganizzazione dei componenti citoscheletrici visualizzati, e ridusse il numero e aumentò la tortuosità dei bilicanali. Le larghezze dei canali sono state misurate sia in epatociti non trattati che in etutociti trattati e sono raffigurate come istogrammi della distribuzione delle larghezze. Le punte di freccia indicano il bile canaliculi. Barra di scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig5alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig6v2.jpg"> Figura 6: Analisi biochimica della risposta dei sandwich di collagene epatocite 3D alle lesioni tossiche in vitro. ALT e AST, marcatori ben consolidati di lesioni epatocellulari, sono stati misurati in supernatant da sandwich di collagene epatocite 3D trattati con tossine (etanolo, blebbistatin e acido okadaico). ALT e AST sono stati elevati in celle trattate rispetto a quelle non trattate. I dati sono riportati come mezzi aritmetici : SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig6alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Soluzione Stock A (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale (g/litro)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>80</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4X7O2O</td>
			<td>1.97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4o2H2O</td>
			<td>0.598</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Soluzione stock Una ricetta.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Soluzione Stock B (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione finale (g/litro)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>1.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4X7O2O</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2.772</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Stock soluzione B ricetta.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Soluzione C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione Stock A (10x)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0,1094 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
			<td>0,0095 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>a 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3: Stock soluzione C ricetta.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Soluzione D</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione stock A (10x)</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0,065 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,0125 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>a 30 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4: Soluzione stock D ricetta.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Soluzione E</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione stock B (10x)</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0,1 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>0,045 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>a 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5: Soluzione stock E ricetta.

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Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Presentato qui è un protocollo per l'isolamento degli epatociti del topo dai fegati di topo adulti utilizzando una tecnica di perfusione di collagenasi modificata. È stata inoltre descritta la cultura a lungo termine degli epatociti in un sandwich di collagene 3D, nonché l'immunolabeling dei componenti citoscheletrici per studiare la formazione biliare e la sua risposta al trattamento.

Isolamento e 3D Collagen Sandwich Cultura del topo primario Epatociti per studiare il ruolo del citoscheletro nella formazione canalicolare bile in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Questo protocollo facilita l'isolamento e la coltura riproducibile a lungo termine degli epatociti di topo in un ambiente sandwich di collagene 3D per studiare la formazione di strutture canoniche e la sua risposta al trattamento in vitro. Una volta che la tecnica è stata padroneggiata, è un metodo rapido per ottenere grandi volumi di popolazione di epatociti di topo altamente vitale e pura per studi in vitro. A dimostrare la procedura sarà Lenka Sarnova, un tecnico del nostro laboratorio.Il giorno prima dell'isolamento primario degli epatociti, aggiungere 100 microlitri di DMEM 10X, 485 microlitri di acqua distillata e 15 microlitri di un idrossido di sodio molare in 500 microlitri a quello di collagene a coda di ratto. Controllare il pH del collagene neutralizzato. Dovrebbe essere circa 7,5.Utilizzando una punta di pipetta pre-refrigerata da 200 microlitri, stendere 100 microlitri della soluzione di collagene neutralizzata su ciascuno dei piatti di coltura in plastica di 3,5 centimetri di diametro sul ghiaccio e posizionare i piatti in condizioni di coltura standard durante la notte. La mattina dopo, reidratare gli strati di collagene con un millilitro di 37 gradi Celsius PBS per piatto per almeno tre ore a 37 gradi Celsius. Per isolare il fegato, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, posizionare il mouse anestetizzato su un tappetino di dissezione in posizione supina e rastremare gli arti inferiori e superiori al tappetino.Tamponare l'addome con il 70% di etanolo e fare un'incisione a forma di V dall'area pubica ad ogni erlitro. Piegare la pelle sul petto per scoprire la cavità addominale e posizionare il tappetino sotto un microscopio sezionante. Spostare l'intestino tenue e il colon in direzione caudale per esporre l'IVC e caricare una siringa da due millilitri con 2,5 millilitri di soluzione Celsius di 37 gradi C.Collegare la siringa alla cannula e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di PBS per premere il fegato fino al diaframma.Posizionare una sutura imbevuta intorno all'IVC appena sotto il fegato. Quindi, utilizzando una siringa per insulina dotata di un ago calibro 30 piegato ad un angolo di 45 gradi, iniettare 10 microlitri di 5.000 unità per millilitro di eparina nella vena del portale. Per cannucolare il fegato, utilizzare forbici microchirurgiche per fare una piccola incisione nell'IVC direttamente accanto al fegato e inserire la cannula nell'incisione.Fissare la cannula in posizione con suture e due nodi chirurgici e tagliare la vena porta per consentire ai tamponi perfusionali di fluire dal fegato. Quindi deprimere lentamente lo stantuffo della siringa per perfondere il fegato con due millilitri della soluzione per un periodo di circa 15 secondi. Una volta che tutta la soluzione è stata consegnata, pre-riempire una pompa peristaltica con soluzione fresca di 37 gradi Celsius C e controllare l'apparato perfusione per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel sistema.Scollegare con cura la cannula dalla siringa e collegare rapidamente ma con attenzione il tubo della pompa peristaltica in esecuzione alla cannula. Avviare immediatamente la perfusione a una portata di 2,5 millilitri al minuto. Dopo due minuti, passare alla soluzione D e continuare la perfusione per altri 10 minuti.Alla fine della perfusione, raccogliere con cura il fegato in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di soluzione di 37 gradi Celsius E.To isolare gli epatociti primari, tenendo il fegato per la cannula, strofinare il tessuto intorno alla parete del tubo per bussare gli epatociti nel tampone. Quando tutto il tessuto è stato schiacciato, trasferire il liquame tissutale in un colino in nylon poro da 70 micrometri per filtrare le cellule isolate in un nuovo tubo da 50 millilitri. Sedimentare le cellule epatiche mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 20 millilitri del 40%Percoll in DMEM.Separare le cellule vive e morte per centrifugazione e rimospendare il pellet in 20 millilitri di soluzione E.Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, rimospendare il pellet in 10 millilitri di soluzione fresca E per il conteggio. Dopo il conteggio, regolare il conteggio primario degli epatociti a 3,75 per 10 alle cinque cellule vitali per millilitro del mezzo di coltura degli epatociti. Per coltura gli epatociti primari isolati nei panini di collagene 3D, utilizzare una pipetta da un millilitro per distribuire uniformemente due millilitri di cellule su ogni piatto di 3,5 centimetri di diametro rivestito di collagene.Posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre ore. Durante l'incubazione, preparare 100 microlitri di collagene neutralizzato a coda di ratto una soluzione per piatto come dimostrato. Alla fine dell'incubazione, sostituire con cura le cellule medie e non attaccate con 100 microlitri di collagene neutralizzato per piatto e riportare le piastre nell'incubatrice di coltura cellulare per un'ora.Quando il collagene si è solidificato, aggiungere con cura due millilitri di mezzo di coltura di epatociti freschi ad ogni piatto e riportare le colture nell'incubatrice per tre o otto giorni controllando le colture ogni giorno al microscopio. Per l'immunoetichettatura degli epatociti primari all'interno dei panini di collagene 3D, lavare accuratamente ogni panino con PBS a 37 gradi Celsius e fissare le colture con un millilitro di paraformaldeide al 4% in PBS per piatto per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine della fissazione, lavare i piatti tre volte per 10 minuti in due millilitri di PBS integrati con 0,1% Tween 20 per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, permeabilizzare le cellule con un millilitro di glicina molare 0,1 e 0,2%Tritone X-100 in PBS per un'ora a temperatura ambiente seguito da tre lavaggi in PBS più Tween 20 come appena dimostrato. Successivamente, utilizzare una punta di carico da 10 microlitri collegata a un vuoto per disturbare delicatamente lo strato superiore di collagene e bloccare qualsiasi legame non specifico con un millilitro di albumina di siero bovino al 5% in PBS Tween per due ore. Alla fine dell'incubazione, aggiungere gli anticorpi primari di interesse diluiti nella soluzione di blocco ad ogni piatto e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius.La mattina seguente, lavare i piatti con tre lavaggi di 15 minuti in PBS Tween, seguiti dall'etichettatura con gli anticorpi secondari appropriati a 37 gradi Celsius per cinque ore. Al termine dell'incubazione, lavare le colture due volte con PBS Tween e una volta con acqua distillata come dimostrato prima di montare il piatto con mezzo di montaggio anti-dissolvenza per microscopia. Entro un giorno dalla semina in panini di collagene 3D, gli epatociti primari del topo formavano cluster e si auto-organizzavano in una rete approssimativamente regolare di canaliculi biliari.Entro tre o sei giorni, gruppi da cinque a 10 cellule sono solitamente osservati con epatociti completamente polarizzati che formano una rete canalicolare. Il trattamento con farmaci che alterano la tossina o il citoscheletro provoca cambiamenti nel citoscheletro epatocito e nella larghezza, nella forma e nel numero dei canalicoli biliari. Sebbene il trattamento con etanolo mostri solo un lieve effetto sull'organizzazione della cheratina 8, aumenta la tortuosità e la distribuzione delle larghezze canalicolari biliari.L'intensità del segnale della colorazione ZO-1 è diminuita nei canaliculi biliari trattati con etanolo rispetto ai controlli non trattati che suggeriscono una perdita di giunzioni di tipo dopo il trattamento con etanolo. L'inibizione della contrattilità dell'actomiosina con Blebbistatin induce la formazione di canaliculi biliari disordinati, spessi e arrotondati. Inoltre, il trattamento con acido okadaico inibisce le fosfatasi che influenzano fortemente le proprietà fisiche delle cheratine e con conseguente canaliculi biliari che sono significativamente ristretti rispetto ai controlli non trattati.Inoltre, il trattamento con etanolo eleva significativamente i livelli di alanina e amminoammina aspartato che suggeriscono gravi lesioni epatocellulari mentre il trattamento con Blebbistatin non porta ad alcuna considerazione cambiamenti nei livelli di transaminasi e il trattamento con acido okadaico innesca lievi cambiamenti biochimici nell'alanina amminotransferasi ma nessun cambiamento nell'espressione dell'amminotransferasi aspartato. È importante continuare a lavorare relativamente rapidamente durante la cannulazione e all'inizio della perfusione ed evitare che le bolle entrino nel sistema di perfusione. I llysati cellulari possono essere raccolti in pozzi duplicati per proteine di interesse per determinare se durante il trattamento si verificano cambiamenti nell'espressione proteica e/o nelle fasi di attivazione.

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