Name: isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro
Uploaded: 2019-12-20T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Agência de Subvenções da República Checa (18-02699S); Agência de Subvenção do Ministério da Saúde da República Checa (17-31538A); o Projeto de Pesquisa Institucional da Academia Checa de Ciências (RVO 68378050) e os projetos MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, e OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Universidade Charles (bolsa pessoal para K.K.), e um programa operacional Praga-Competitividade projeto (CZ.2.16/3.1.00/21547). Reconhecemos o Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (projetos MEYS CR apoiados LM2015062 e LO1419) para apoio com a imagem de microscopia apresentada.

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE e foram aprovadas pela Comissão Central Checa para o Bem-Estar Animal.
1. Materiais
<ol><li>Animais domésticos em condições específicas livres de patógenos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciência Animal de Laboratório com livre acesso a ração regular e água potável. Animais da casa um ciclo escuro/claro de 12 h/12 h. Para o isolamento e a cultura hepatocitos, use animais de 8 a 12 semanas de idade.</li>
	<li>Soluções de ações A e B<ol>
<li>Prepare a solução de estoque A e a solução de estoque B de acordo com a Tabela 1 e a Tabela 2,respectivamente, com antecedência. Dissolva todos os componentes em 1 L de H2O destilado (dH2O).</li>
		<li>Ajuste o pH das soluções para 7,2 e filtre as soluções através de um filtro de 0,2 μm. Ambas as soluções podem ser armazenadas a 4 °C por até 6 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações C<ol>
<li>Prepare a solução C no dia do isolamento primário de hepatócitos.</li>
		<li>Adicione todos os componentes de acordo com a Tabela 3, preencha um volume total de 50 mL com dH2O e dissolva-se. Ajuste o pH para 7,3.</li>
		<li>Aliquot 50 mL da solução em tubos de 50 mL. Use um tubo por animal. Coloque todos os alíquos necessários em um banho de água pré-aquecido (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações D<ol>
<li>Prepare a solução D no dia do isolamento primário de hepatócitos.</li>
		<li>Adicione todos os componentes de acordo com a Tabela 4,preencha para um volume total de 30 mL com dH2O, e dissolva. Ajuste o pH para 7,3.</li>
		<li>Aliquot 30 mL da solução em tubos de 50 mL. Adicione a colagem I (5 mg/30 mL) na solução D. Use um alíquo por animal. Coloque todos os alíquos em um banho de água pré-aquecido (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações E<ol>
<li>Prepare a solução E no dia do isolamento primário de hepatócitos.</li>
		<li>Adicione todos os componentes de acordo com a Tabela 5, preencha um volume total de 50 mL com dH2O e dissolva-se. Ajuste o pH para 7,3.</li>
		<li>Aliquot 50 mL da solução em tubos de 50 mL. Adicione albumina V (0,65 g/50 mL) na solução E. Use um alíquo por animal. Coloque todos os alíquos em um banho de água pré-aquecido (37 °C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de sanduíches de colágeno
<ol><li>Um dia antes do isolamento primário de hepatócitos, prepare a primeira camada do sanduíche de colágeno I. NOTA: Trabalhe no gelo e use soluções pré-refrigeradas, pontas, placas e tubos para minimizar a gelação indesejada de colágeno I.</li>
	<li>Neutralizar a quantidade necessária de colágeno I (de rabo de rato) de acordo com o protocolo do fabricante. É necessário um volume de 100 μL de colágeno neutralizado (1,5 mg/mL) por amostra experimental (prato de 3,5 cm). Para preparar 1 mL de colágeno neutralizado (1,5 mg/mL), adicione 100 μL de 10x DMEM, 1,5 μL de 1M NaOH e 48,5 μL de dH2O em 500 μL de colágeno (concentração de estoque = 3 mg/mL). Verifique o pH de colágeno neutralizado com papel decisivo (o pH deve ser ~ 7,5).</li>
	<li>Disperse 100 μL de solução de colágeno neutralizada uniformemente usando uma ponta pré-refrigerada de 200 μL sobre a superfície de um prato de 3,5 cm montado no gelo.</li>
	<li>Incubar durante a noite condições de cultura padrão (incubadora com 5% CO2 a 37 °C). No dia do isolamento primário de hepatócitos, adicione 1 mL de PBS pré-aquecido (37 °C) à primeira camada de colágeno. Deixe o colágeno para reidratar por 2-3 h a 37 °C.</li>
</ol>3. Equipamento criado
<ol><li>Prepare todos os equipamentos listados na Tabela de Materiais e configurado como mostrado na Figura 1.</li>
</ol>4. Procedimento cirúrgico
<ol><li>Anestesie o camundongo por injeção intramuscular de tiletamina (60 mg/kg de peso corporal), zolazepam (60 mg/kg) e xilazine (4,5 mg/kg). Após diversos minutos, confirme a anestesia apropriada pela pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo. Se o animal não responder à pitada, prossiga para 4.2.</li>
	<li>Coloque o mouse anestesiado em um tapete de dissecação e fita as extremidades inferiores e superiores para corrigir o mouse em uma posição supina. Cotonete o abdômen com 70% de etanol e abra o abdômen com uma incisão em forma de V da área púbica para as pernas dianteiras. Dobre a pele sobre o peito para descobrir a cavidade abdominal. Coloque o esteira dissecando um microscópio dissecando.</li>
	<li>Dobre uma agulha de seringa de insulina (30 G) a um ângulo de 45°. Expor a veia cava inferior (IVC), movendo os intestinos e cólon na direção caudal.</li>
	<li>Preencha 2,5 mL de solução pré-aquecida (37 °C) C em uma seringa de 2 mL com uma cânula. Certifique-se de que não há bolhas de ar na cânula ou seringa.</li>
	<li>Antes da cannulação do IVC, reposicione os lobos do fígado pressionando-os até o diafragma com um cotonete de algodão molhado (PBS). Coloque uma sutura de seda em torno do IVC logo abaixo do fígado (Figura 2A,B).</li>
	<li>Injete 10 μL de heparina (5000 U/mL) na veia portal usando uma seringa de insulina com uma agulha de 30 G dobrada em um ângulo de 45° (Figura 2C).</li>
	<li>Para cannular o fígado, faça uma pequena incisão com uma tesoura microcirúrgica no IVC diretamente ao lado do fígado (abaixo da sutura; Figura 2D)que é grande o suficiente para inserir a cânula. Fixar a cânula na posição usando suturas e dois nós cirúrgicos (Figura 2E).</li>
	<li>Corte a veia portal(Figura 2F)para permitir que os buffers de perfusão fluam para fora do fígado para evitar a expansão do fígado.</li>
	<li>Perfundir manualmente o fígado com 1,5 mL de solução pré-aquecida C, pressionando lentamente a seringa conectada à cânula (isso deve levar ~ 15 s). A remoção do sangue do fígado por descoloração do fígado agora pode ser observada.</li>
	<li>Pré-preencher uma bomba peristaltic com pré-aquecido (37 °C) solução C. Verifique o aparelho de perfusão e garantir que não há bolhas de ar no sistema.</li>
	<li>Desligue cautelosamente a cânula da seringa e conecte-a à tubulação da bomba peristáltica que funciona na taxa de fluxo de 2.5 mL/min. Trabalhe rapidamente mas com cuidado e assegure-se de que a cânula permaneça na posição e que nenhuma bolha entre na tubulação ou na cânula.</li>
	<li>Perfuse o fígado com a solução C para 2 min (5 mL da solução C). Alteração para solução D e continuar a perfusão por um adicional de 10 min (25 mL de solução D).</li>
	<li>Uma vez que o fígado foi perfundido, removê-lo da cavidade abdominal. O fígado agora será muito frágil e de cor pálida (Figura 3).</li>
</ol>5. Isolamento dos hepatócitos primários
<ol><li>Retire o fígado do rato. A cânula ainda estará ligada ao fígado, então use os fórceps para levantar a cânula com o fígado, e cuidadosamente cortar todas as conexões fáscia. Transfira o fígado para um tubo de 50 mL contendo 20 mL de solução pré-aquecida E.</li>
	<li>Segure a cânula com o fígado usando fórceps e dissociar o tecido, esfregando o fígado ao redor da parede do tubo para transferir os hepatócitos isolados em buffer. Mantenha as células isoladas no gelo. NOTA: Hepatócitos primários isolados são viáveis por várias horas enquanto mantidos no gelo. Os usuários podem repetir etapas 4.1 a 5.2 isolando hepatocytes preliminares de um outro rato doador, se necessário, ou prosiguem à etapa seguinte.</li>
	<li>Coloque um filtro de célula de nylon de 70 μm em cima de um tubo de 50 mL e filtre as células isoladas.</li>
	<li>Centrífuga do tubo a 50 x g e 4 °C por 5 min. Aspirar o supernatant. Para remover as células mortas e aumentar a porcentagem de células viáveis, resuspender a pelota em 20 mL de 40% percol em DMEM.</li>
	<li>Centrífuga do tubo a 50 x g e 4 °C por 5 min. Aspirar o supernatant contendo células mortas e resuspender a pelota em 20 mL de solução E.</li>
	<li>Tubos de centrífuga a 50 x g e 4 °C por 5 min. Aspiram o supernatant e resuspendem a pelota em 10 mL da solução E.</li>
	<li>Verifique o rendimento primário de hepatócitoe e viabilidade usando coloração azul trypan. Conte o número celular usando uma câmara de contagem de células Neubauer e ajuste a concentração celular para 3,75 x 105 células viáveis/mL. Mantenha as células no gelo.</li>
</ol>6. Cultivo de hepatócitos primários em sanduíches de colágeno 3D
<ol><li>Prepare o meio da cultura hepatocito (CmH). Adicione 15 μL de glucagon (1 mg/mL), 15 μL de hidrocortisona (50 mg/mL) e 40 μL de insulina (10 mg/mL) a 50 mL de média completa (DMEM, alta glicose, 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina).</li>
	<li>Disperse uniformemente 2 mL (5 x 105 células/mL) de hepatócitos primários viáveis em um prato pré-revestido de 3,5 cm. Incubar as células com 5% CO2 a 37 °C para 3 h. Importante: Distribuir uniformemente as células, inclinando o prato em todas as direções pouco antes de colocar o prato em incubadora.</li>
	<li>Prepare o colágeno neutralizado I (100 μL/3.5 cm de prato; ou seja, um volume suficiente para todos os pratos, conforme descrito acima [passo 2.1]). Mantenha o gelo até usar.</li>
	<li>Após 3 h, retire cuidadosamente as células médias e não anexadas e adicione 100 μL de colágeno neutralizado I a cada prato de 3,5 cm para formar a camada superior de sanduíche de colágeno nas células. Incubar o sanduíche de colágeno condições padrão de cultura celular (5% CO2 a 37 °C) por 1 h. Após uma incubação de 1 h, adicione cuidadosamente 2 mL de CMH.</li>
	<li>Após 24 h de cultura, mude o meio de CmCm para um fresco.</li>
	<li>Cultura por 3-8 dias, dependendo da formação de canaliculi biliares. Verifique a cultura todos os dias um microscópio (Figura 4). Mude o CmH a cada dois dias.</li>
</ol>7. Imunorotulagem de hepatócitos primários em sanduíches de colágeno 3D
<ol><li>Retire a mídia dos sanduíches de hepatócito, em seguida, lave cuidadosamente com PBS pré-aquecido. Conserte as culturas sanduíche com 1 mL de 4% de paraformaldeído na PBS por 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Após a fixação, lave os sanduíches 3x por 10 min em 2 mL de PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T).</li>
	<li>Permeabilize as células com 1 mL de 0,1 M glicina, 0,2% Triton X-100 em PBS em RT para 1 h. Wash 3x por 10 min em PBS-T.</li>
	<li>Perturbe delicadamente a camada superior de colágeno usando uma ponta de carregamento de 10 μL conectada a uma aspiração de vácuo para garantir a penetração de anticorpos suficientes.</li>
	<li>Bloco com 1 mL de 5% BSA em PBS-T (ou seja, solução de bloqueio) para 2 h. Incubar com anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio durante a noite em 37 °C. Lave 3x por 15 min em PBS-T.</li>
	<li>Após a lavagem, incubar com anticorpo secundário em 37 °C para 5 h. Lave 3x para 15 min em PBS-T seguido pela lavagem de 1x com H2O destilado.</li>
	<li>Monte com meios de montagem anti-fade (veja tabela dos materiais)para a microscopia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gissen, P., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+hepatocyte+polarity+and+liver+disease.">Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease.</a> Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).</li><li>LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+maintenance+of+bile+canalicular+networks+in+collagen-sandwiched+hepatocytes.">Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes.</a> Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).</li><li>Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. 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Os autores não têm nada a divulgar.

O uso de culturas hepatocitos primárias de camundongos é importante para que estudos in vitro compreendam melhor os processos de sinalização envolvidos no estabelecimento da polarização hepatocito, formação adequada da estrutura canalicular e secreção biliar. Os desafios em isolamento e cultura de longo prazo de hepatócitos primários de camundongos na cultura 2D impulsionaram a invenção de várias abordagens técnicas com maior efetuez a vida do isolamento e longevidade de células isoladas, cada uma com várias vantagens e Desvantagens. Agora é amplamente aceito que as culturas 2D de hepatócitos primários imitam apenas um número limitado de atributos da biologia hepática por um curto período de tempo. Assim, o cultivo 3D em um arranjo sanduíche de colágeno está substituindo amplamente as condições 2D, particularmente quando focada na função do citoesqueleto na biologia hepática (por exemplo, efeitos tóxicos de drogas ou organização espacial do transporte biliar).
Desde a década de 1980, vários protocolos para o isolamento de hepatócitos de camundongos com várias modificações foram descritos. A abordagem de perfusão de colagem em duas etapas tornou-se amplamente utilizada em muitos laboratórios. A adição de centrifugação gradiente no protocolo de isolamento permite a remoção de células mortas19,20 e aumenta significativamente o número de células viáveis (aqui, rotineiramente para ~93%). Mesmo que esta etapa estenda o tempo de manuseio das células e resulte em números celulares reduzidos21,esta etapa é vista como necessária na cultura sanduíche de colágeno 3D para a formação adequada da rede bile canalicular. Além disso, é mais importante proceder de forma rápida e precisa durante as etapas de perfusão, o que encurta o tempo em que as células são manuseadas.
Outros fatores importantes que aumentam a viabilidade das células e sua capacidade de formar redes canaliculares em 3D é o uso de soluções preparadas na hora e evitar bolhas durante a perfusão. Portanto, as soluções devem ser preparadas no dia do isolamento de hepatócitos de camundongos, e a bomba peristáltica e tubulação devem ser verificadas ao mudar de soluções. Se o protocolo for seguido de perto, o isolamento dos hepatócitos primários deve ser bem sucedido com um alto rendimento de células viáveis.
Outro fator crítico na cultura hepatocito 3D de longo prazo é a fonte inicial de hepatócitos primários que são usados. É importante usar animais de 8 a 12 semanas de idade, que servem como doadores ideais de hepatócitos. O uso de hepatócitos de animais mais velhos não foi tão bem sucedido na cultura de longo prazo, já que esses hepatócitos mudaram sua morfologia com mais freqüência, despolarizaram e deixaram de formar redes canaliculares. Além disso, chapeamento hepatócitos em gel de colágeno devidamente neutralizado formado a partir de solução relativamente altamente concentrada é um passo vital. Na maioria dos protocolos, concentrações de cerca de 1 mg/mL são usadas. Depois de muitas otimizações, uma concentração de 1,5 mg/mL é ideal para o cultivo de hepatócitos de longo prazo e fornece hepatócitos altamente organizados com canalículos biliares formados.
Este protocolo fácil de seguir permite o cultivo a longo prazo de hepatócitos de camundongos primários. Os resultados representativos demonstram um amplo espectro de uso para hepatócitos de camundongos primários cultivados em 3D ao estudar o papel dos componentes citoesqueléticos na formação de canaliculi biliares.

Hepatócitos, as estruturas celulares centrais do fígado que são responsáveis por suas funções metabólicas, são células epiteliais exclusivamente polarizadas. Sua polarização, aparecendo em mamíferos logo após o nascimento, resulta na formação da rede canalicular biliar e é essencial para a secreção biliar de bile. Membranas apical de hepatócitos formam coletivamente canaliciuli biliares, enquanto membranas basais permanecem em contato com o endotelio dos sinusoides. A perda da polarização hepatocito leva à redistribuição de transportadores biliares e resulta em processos patológicos conectados à retenção biliar no fígado (ou seja, cholestasis).
O estabelecimento e a manutenção da polarização hepatocto e o desenvolvimento de canaliculi biliares implicam mecanismos complexos. Os processos subjacentes dependem da interação coletiva entre o citoesqueleto hepatocito, contatos celulares e interações com a matriz extracelular1. O citoesqueleto hepatocito consiste em todas as três redes de filamento, o citoesqueleto actina, microtúbulos e filamentos intermediários, que fornecem suporte estrutural para a formação canalicular. O papel diferencial dos componentes citoesqueléticos na regeneração e manutenção de redes canaliculares biliares foi previamente ilustrado in vitro em culturas hepatocitos de colágeno-sanduíche 3D2.
Microfilamentos actinas e microtúbulos são importantes durante os estágios iniciais de polarização da membrana hepatócito nos locais da geração canaliculus2. O citoesqueleto de actina estabelece a estrutura e função dos canaliculi biliares, formando microfilamentos associados à membrana e o anel circumferential, apoiando assim a arquitetura canalicular e inserindo o citoesqueleto de actina em junções apertadas e aderem3. O anel de filamentos intermediários de queratina fora do citoesqueleto actina estabiliza ainda mais a estrutura canalicular3.
A importância das proteínas nos complexos juncionais de hepatócitos na organização da arquitetura de canaliculi biliar tem sido bem documentada em vários modelos de camundongos knock-out, que mostram canaliculi distorcidos em camundongos sem proteínas juncionais apertadas e/ou aderentes4,5,6. A exclusão da proteína de junção aderentes α-catenin tem sido mostrado para levar à desorganização do citoesqueleto hepatocito actina, dilatação de lúmens canaliculares biliares, junções apertadas gotejante, e efetivamente a um fenótipo cholestática4. Além disso, estudos in vitro têm mostrado a importância dos componentes de junção aderentes E-cadherin e β-catenina na remodelação do lúmen afalco hepatocelular e tráfico deproteínas 7.
Surpreendentemente, a ablação do citoesqueleto crosslinking proteína plectina, que é o principal organizador de queratina, revelou fenótipos comparáveis aos ligados à actina citoesqueleto8. Isso sugere um papel crítico dos filamentos intermediários de queratina no suporte da estrutura canalicular. Estudos in vitro utilizando sanduíches de colágeno hepatócito 3D também mostraram a importância da proteína kinase ativada por AMP e seu ativador upstream LKB1 na formação de rede canalicular biliar9. Estes resultados foram confirmados então mais por estudos in vivo subseqüentes10,11. Assim, tornou-se claro que estudos in vitro são necessários para promover a compreensão dos processos de sinalização envolvidos no estabelecimento da polarização hepatocito, formação adequada da rede canalicular e secreção biliar.
Um grande desafio no estudo de processos conectados com a formação canalicular biliar e sua resposta a situações patológicas in vitro é o uso de condições de cultura celular que se assemelham à situação in vivo12. Os hepatócitos primários recém-isolados não são polarizados; assim, perdem sua função, morfologia e canaliculi bile funcional em condições de cultura 2D (por exemplo, mudanças na regulação gênica, polarização e desdiferenciação13,14,15). Apesar deste fato, hepatócitos recém-isolados refletem mais de perto a natureza do fígado in vivo, ao contrário das linhas celulares derivadas do fígado16. Mesmo que tenham sido usados no passado, as linhas celulares imortalizadas não exercem a morfologia característica epiteliana dos hepatócitos, e os lúmens canaliculares biliares formados por essas células se assemelham a canaliculi hepáticos mal7. Recentemente, culturas 3D de hepatócitos primários, de camundongos e ratos, tornaram-se uma ferramenta útil para investigar processos envolvidos na formação de rede canalicular biliar in vitro9. Hepatócitos primários cultivados entre duas camadas de colágeno (referido como uma cultura de sanduíche de colágeno 3D) podem repolarizar em vários dias. Por causa das altas demandas técnicas necessárias ao cultivar hepatócitos de camundongos em sanduíches de colágeno 3D, aqui apresentamos um protocolo complexo para isolar, cultivar e imunorótulo hepatócitos de camundongos embutidos em sanduíches de colágeno 3D, a fim de caracterizar o envolvimento de componentes citosqueléticos durante a formação canalicular biliar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arteriotomy Cannula (1mm)</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I. from Rat tail (3mg/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (from Clostridium Hystolyticum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose monohydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Pufferan</td>
			<td>G 05104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (5000 U/mL)</td>
			<td>Zentiva</td>
			<td>8594739026131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T888.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump Minipuls Evolution</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F110701, F110705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-2124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided black</td>
			<td>Chirmax</td>
			<td>EP 0.5 &#8211; USP 7/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 2 ml</td>
			<td>Chirana</td>
			<td>CH002L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Nuve</td>
			<td>NB 9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 &#956;m, diam. 47 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA7402004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>2629-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Vibrac</td>
			<td>VET00083</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro

Hepatócitos são as células centrais do fígado responsável por sua função metabólica. Como tal, eles formam um epitélio exclusivamente polarizado, no qual dois ou mais hepatócitos contribuem com membranas apical para formar uma rede canalicular biliar através da qual a bile é secretada. A polarização hepatocito é essencial para a formação canalicular correta e depende das interações entre o citoesqueleto de hepatocito, contatos celulares e a matriz extracelular. Estudos in vitro sobre o envolvimento do citoesqueleto de hepatocito na formação de canaliculi e sua resposta a situações patológicas são prejudicados pela falta de cultura celular, que se assemelharia à estrutura da rede canaliculi in vivo. Descrito aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos do fígado de rato adulto usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também descrita é a produção de cultura em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, que é usado para imunorotulagem de componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta aos tratamentos in vitro. Mostra-se que as culturas hepatocitos de sanduíche de colágeno 3D respondem a tratamentos com toxinas (etanol) ou citoesqueleto de actina alterando drogas (por exemplo, blebbistatin) e servem como uma ferramenta valiosa para estudos in vitro de formação e função de canaliculi biliares.

Os hepatócitos primários do rato foram isolados e semeados em sanduíches de colágeno 3D. Os canaliculi da bile entre duas pilhas adjacentes começaram dar forma dentro de diversas horas após a semeadura. As células formaram aglomerados e auto-organizado em uma rede aproximadamente regular de canaliculi bile dentro de 1 dia (Figura 4). Dentro de 3-6 dias, aglomerados de 5-10 células eram geralmente observados, com hepatócitos totalmente polarizados formando uma rede canalicular (Figura 4).
Tratamento de hepatócitos de camundongos primários em sanduíches de colágeno 3D com toxina (etanol) ou drogas que alteram citoesqueleto (por exemplo, blebbistatin, ácido okadaico) resultou em mudanças no citoesqueleto hepatocito, largura canaliculi, forma e número de canalículos biliares ilustrados pela imunorotulagem com um anticorpo para queratina 8 (a queratina mais abundante em hepatócitos), faloide (visualização de F-actina) e anticorpos para a junção apertada de proteína zonula ocludens-1 (ZO-1; Figura 5).
O tratamento com etanol teve apenas um efeito leve na organização da queratina 8; no entanto, aumentou a tortuosidade (como visto a partir de manchas f-actina) e distribuição de larguras canaliculares biliais (Figura 5). A intensidade do sinal da coloração ZO-1 foi diminuída em canaliculi biliares tratados com etanol em comparação com controles não tratados, sugerindo uma perda de junções apertadas após o tratamento do etanol. A inibição da contratilidade da actomiosina com blebbistatin afetou significativamente a forma e o número de canaliculi biliares. A rede canalicular regular foi reorganizada, em comparação com hepatócitos não tratados, em canaliculi biliares desordenados com um aumento da incidência de canalículos de bile arredondados grossos em vez de finos longos (como visto no histograma das larguras canaliculares).
Além disso, o tratamento com ácido okaárico (OA) inibindo a fosfasases afetou fortemente as propriedades físicas das queratinas, como mostrado anteriormente8,17. A OA muda a solubilidade dos filamentos de queratina; assim, o tratamento resultou em profunda reorganização da malha de queratina, que entrou em colapso em grandes agregados perinucleares. Tanto o F-actin quanto a proteína de junção apertada ZO-1 não foram localizados em nenhuma estrutura específica, sugerindo o desaparecimento quase completo de canaliciulis de bile organizados e uma perda completa da polaridade hepatócito. Os restantes canaliculi biliares foram significativamente reduzidos em comparação com controles não tratados, como visto no histograma de largura canalicular (Figura 5).
Para correlacionar observações microscópicas de mudanças no citoesqueleto hepatocito com a resposta bioquímica hepatocelular ao tratamento, o protocolo também mediu os níveis de alanina aminotransferase (ALT) e transaminase de aspartato (AST) (duas enzimas hepáticas que são comumente usadas como marcadores de lesão hepatocelular) em supernatant dos sanduíches de colágeno 3D (Figura 6)18. O tratamento com etanol elevou significativamente os níveis de ALT e AST, sugerindo lesões hepatocelulares graves. O tratamento com blebbistatin não levou a mudanças consideráveis nos níveis de ALT e AST em comparação com o tratamento de ácido okaárico, o que desencadeou mudanças bioquímicas leves com aumento dos níveis de ALT, mas nenhuma mudança nos níveis de AST. Assim, marcadores bioquímicos de lesão hepatocelular medidoin vitro a partir de hepatocito sonoro correlacionante com as alterações citosqueléticas observadas pela imunomancha.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2.jpg"> Figura 1: Configuração experimental. (A)Mouse fixado em uma posição supina, é colocado um microscópio dissecando antes da cirurgia. Todos os instrumentos cirúrgicos necessários são colocados em uma bandeja. (B) A suíte de perfusão durante a perfusão do fígado de rato mostrando tubos de silicone conectando o reservatório com tampão quente e o mouse perfundido. (C)Representação esquemática de B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig2v2.jpg"> Figura 2: Abertura da cavidade abdominal e da cannulação do IVC. O abdômen é aberto com uma incisão em forma de V da área púbica para as pernas dianteiras. A pele é dobrada sobre o peito para expor e ampliar a cavidade abdominal. Para expor o IVC, os intestinos e os dois pontos são cuidadosamente movidos caudally. (A, B) Antes da cannulação do IVC, os lobos do fígado devem ser reposicionados pressionando-os para cima para o diafragma com um cotonete de algodão pbs-wetted. O IVC é então cuidadosamente separado dos tecidos circundantes, e uma sutura de seda é colocada em torno do IVC nas proximidades do fígado. O painel B representa esquemas da cavidade abdominal mostrados no painel A. Os lobos do fígado, intestino, cava de vena inferior (IVC, vermelho) e suturas são indicados. (C)Heparin é injetado na veia portal (PV, seta) com uma seringa de insulina (30 G agulha dobrada no ângulo de 45°). (D)Para acariciar o fígado, o IVC é inciquecido diretamente ao lado do fígado (abaixo da sutura). (E)A cânula é inserida e fixada com suturas amarrando dois nós cirúrgicos. (F)A veia portal é totalmente cortada para permitir a saída de buffer livre, impedindo a expansão do fígado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig2alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig3v2.jpg"> Figura 3: Imagens representativas do fígado antes e depois da perfusão. (A, B) O fígado cannulado foi ressecado e perfundido por 12 min a uma taxa de fluxo de 2,5 mL/min. Note o fígado significativamente descolorido após a perfusão (B) em comparação com o fígado recém-ressecado (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig3alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig4v2.jpg"> Figura 4: cultura de sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários. Imagens representativas de campo brilhante de hepatócitos primários de camundongos cultivados por 1, 2 e 3 dias em condições 3D. Note-se que aglomerados maiores de células altamente organizadas são formados após 3 dias na cultura. Áreas encaixotadas mostram imagens ampliadas de ~3x. Pontas de flechas indicam os canalículos biliares. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig4alarge.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig5v2.jpg"> Figura 5: Avaliação da resposta morfológica ao estresse tóxico pela microscopia imunofluorescente. Hepatócitos de camundongos primários cultivados em sanduíches de colágeno 3D foram tratados com toxinas (etanol, blebbistatin, ou ácido okadaico) no dia 3 da cultura. As células fixas foram manchadas para visualizar componentes citoesqueléticos: queratina 8 (verde), F-actina (vermelho) e zonula ocludens-1 (ZO-1, magenta) por imunofluorescência. O tratamento tóxico levou à desorganização de componentes citoesqueléticos visualizados, e reduziu o número e aumentou a tortuosidade dos canalicioses biliares. As larguras canaliculares foram medidas em hepatócitos não tratados e tratados e são descritas como histogramas de distribuição de larguras. Pontas de flechas indicam os canalículos biliares. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig5alarge.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig6v2.jpg"> Figura 6: Análise bioquímica da resposta de sanduíches de colágeno hepatócito 3D a lesões tóxicas in vitro. Alt e AST, marcadores bem estabelecidos de lesão hepatocelular, foram medidos em supernatant de sanduíches de colágeno hepatócito 3D tratados com toxinas (etanol, blebbistatin e ácido okadaico). Alt e AST foram elevados em células tratadas em comparação com as não tratadas. Os dados são relatados como meios aritméticos ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig6alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solução de estoque A (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentração final (g/litro)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>80</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>1.97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4·2H2O</td>
			<td>0.598</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH 2 PO 4 KH2PO4
</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Solução de estoque Uma receita.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solução b de ações (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Concentração final (g/litro)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH 2 PO 4 KH2PO4
</td>
			<td>1.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl 2 CaCl2
</td>
			<td>2.772</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Receita de solução B.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solução C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de estoque A (10x)</td>
			<td>5 mL 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO 3 NahCO3
</td>
			<td>0,1094 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA EGTA</td>
			<td>0,0095 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH 2 O DH2O</td>
			<td>para 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Receita de solução c de estoque.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solução D</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de ações A (10x)</td>
			<td>3 mL 3 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO 3 NahCO3
</td>
			<td>0,065 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl 2 CaCl2
</td>
			<td>0,0125 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH 2 O DH2O</td>
			<td>para 30 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Receita de solução D de estoque.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Solução E</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de ações B (10x)</td>
			<td>5 mL 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO 3 NahCO3
</td>
			<td>0,1 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicose</td>
			<td>0,045 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH 2 O DH2O</td>
			<td>para 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: Receita de solução e de estoque.

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Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Este protocolo facilita o isolamento e a cultura reprodutível de longo prazo dos hepatócitos de camundongos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D para estudar a formação de estrutura canônica e sua resposta ao tratamento in vitro. Uma vez que a técnica tenha sido dominada, é um método rápido para obter grandes volumes de população de hepatócitos de camundongos altamente viáveis e puros para estudos in vitro. Demonstrando o procedimento estará Lenka Sarnova, técnica do nosso laboratório.Um dia antes do isolamento primário do hepatocito, adicione 100 microliters de 10X DMEM, 485 microliters de água destilada e 15 microlitres de um hidróxido de sódio molar em 500 microliters ao colágeno de cauda-rato. Verifique o pH do colágeno neutralizado. Deve ser cerca de 7.5.Usando uma dica de pipeta de 200 microliteres pré-resfriada, espalhe 100 microliters da solução de colágeno neutralizado sobre cada um dos pratos plásticos de cultura de 3,5 centímetros de diâmetro no gelo e coloque os pratos em condições de cultura padrão durante a noite. Na manhã seguinte, reidratar as camadas de colágeno com um mililitro de 37 graus Celsius PBS por prato por pelo menos três horas a 37 graus Celsius. Para isolar o fígado, depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, coloque o rato anestesiado em um tapete de dissecção na posição supina e tape as extremidades inferior e superior ao tapete.Co swab o abdômen com 70% de etanol e faça uma incisão em forma de V da área púbica para cada membro dianteiro. Dobre a pele sobre o peito para descobrir a cavidade abdominal e coloque o tapete sob um microscópio dissecando. Mova o intestino delgado e o cólon na direção caudal para expor o IVC e carregue uma seringa de dois mililitros com 2,5 mililitros de solução Celsius de 37 graus C.Conecte a seringa à cânula e use um s swab de algodão encharcado PBS para pressionar o fígado até o diafragma.Coloque uma sutura encharcada ao redor do IVC logo abaixo do fígado. Em seguida, usando uma seringa de insulina equipada com uma agulha de calibre 30 dobrada para um ângulo de 45 graus, injete 10 microliters de 5.000 unidades por mililitro de heparina na veia portal. Para canonizar o fígado, use uma tesoura microcirúrgica para fazer uma pequena incisão no IVC diretamente ao lado do fígado e inserir a cânula na incisão.Fixar a cânula no lugar com suturas e dois nós cirúrgicos e cortar a veia portal para permitir que os tampões de perfusão fluam do fígado. Em seguida, deprime lentamente o êmbolo da seringa para perfundir o fígado com dois mililitros da solução durante um período de cerca de 15 segundos. Quando toda a solução tiver sido entregue, preencha uma bomba peristáltica com solução C fresca de 37 graus Celsius e verifique o aparelho de perfusão para garantir que não haja bolhas de ar no sistema.Desconecte cuidadosamente a cânula da seringa e conecte cuidadosamente o tubo da bomba peristáltica em funcionamento à cânula. Inicie imediatamente a perfusão a uma taxa de fluxo de 2,5 mililitros por minuto. Após dois minutos, mude para a solução D e continue a perfusão por mais 10 minutos.No final da perfusão, colhe cuidadosamente o fígado em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 20 mililitros de solução Celsius de 37 graus E.To isolar os hepatócitos primários, segurando o fígado pela cânula, esfregar o tecido ao redor da parede do tubo para derrubar os heptocitos no tampão. Quando todo o tecido for purê, transfira o chorume de tecido para um coador de nylon poros de 70 micrômetros para filtrar as células isoladas em um novo tubo de 50 mililitros. Sedimentar as células hepáticas por centrifugação e resuspensar a pelota em 20 mililitros de 40% percoll em DMEM.Separe as células vivas e mortas por centrifugação e resuspengue a pelota em 20 mililitros de solução E.Depois de centrifugar as células novamente, resuspensar a pelota em 10 mililitros de solução fresca E para contar. Após a contagem, ajuste a contagem primária de hepatócitos para 3,75 vezes 10 para as cinco células viáveis por mililitro do meio de cultura hepatócica. Para cultivar os hepatócitos primários isolados em sanduíches de colágeno 3D, use uma pipeta de um mililitro para distribuir uniformemente dois mililitros de células em cada prato revestido de colágeno de 3,5 centímetros de diâmetro.Coloque as células na incubadora de cultura celular por três horas. Durante a incubação, prepare 100 microliters de colágeno de cauda de rato neutralizado uma solução por prato como demonstrado. No final da incubação, substitua cuidadosamente as células médias e não-endectadas por 100 microliters de colágeno neutralizado por prato e devolva as placas à incubadora de cultura celular por uma hora.Quando o colágeno se solidificar, adicione cuidadosamente dois mililitros de cultura hepatócida fresca em cada prato e devolva as culturas à incubadora por três a oito dias verificando as culturas diariamente sob o microscópio. Para a imunolabelação dos hepatócitos primários dentro dos sanduíches de colágeno 3D, lave cada sanduíche cuidadosamente com 37 graus Celsius PBS e fixe as culturas com um mililitro de 4% de paraformaldeído em PBS por prato por 30 minutos à temperatura ambiente. Ao final da fixação, lave os pratos três vezes por 10 minutos em dois mililitros de PBS suplementados com 0,1%Tween 20 por lavagem.Após a última lavagem, permeabilize as células com um mililitro de 0,1 molar de glycina e 0,2%Triton X-100 em PBS por uma hora à temperatura ambiente seguido por três lavagens em PBS mais Tween 20 como apenas demonstrado. Em seguida, use uma ponta de carga de 10 microliter conectada a um vácuo para perturbar suavemente a camada superior do colágeno e bloquear qualquer ligação inespecífica com um mililitro de 5% de colagem de soro bovino em PBS Tween por duas horas. No final da incubação, adicione os anticorpos primários de interesse diluídos em solução de bloqueio para cada prato e incubar durante a noite a 37 graus Celsius.Na manhã seguinte, lave os pratos com três lavagens de 15 minutos em PBS Tween seguidas de rotulagem com os anticorpos secundários apropriados a 37 graus Celsius por cinco horas. No final da incubação, lave as culturas duas vezes com PBS Tween e uma vez com água destilada como demonstrado antes de montar o prato com meio de montagem anti-fade para microscopia. Um dia após a semeadura em sanduíches de colágeno 3D, os hepatócitos primários do rato formaram aglomerados e auto-organizados em uma rede aproximadamente regular de canaliculi bile.Dentro de três a seis dias, aglomerados de cinco a dez células são geralmente observados com hepatócitos totalmente polarizados formando uma rede canalicular. O tratamento com drogas que alteram o citoesqueleto ou citoesqueleto resulta em alterações no citoesqueleto hepatocitte e na largura, forma e número do canaliculi de biliócicas. Embora o tratamento do etanol apresente apenas um efeito leve na organização da queratina 8, aumenta a tortuosidade e distribuição das larguras canalizais biliais.A intensidade do sinal da coloração do ZO-1 é diminuída no canaliculi biliaz tratado com etanol em comparação com controles não tratados que sugerem perda de junções do tipo após o tratamento do etanol. A inibição da contratude da actomyosina com Blebbistatin induz a formação de canaliculi biliculi de forma desordenada, grossa e arredondada. Além disso, o tratamento com ácido okádico inibe fosfattases que afetam fortemente as propriedades físicas das queratinas e resultam em canaliculi bile que são significativamente estreitados em comparação com controles não tratados.Além disso, o tratamento do etanol eleva significativamente os níveis de alanina e aspartato amino transferases sugerindo lesões hepatocelulares graves, enquanto o tratamento blebbistatin não leva a nenhuma consideração de mudanças nos níveis transaminase e o tratamento de ácido okadaico desencadeia alterações bioquímicas leves na aminotransferase alanina, mas nenhuma mudança na expressão aminotransferase aspartate. É importante continuar trabalhando relativamente rapidamente durante a cannulação e no início da perfusão e evitar que bolhas entrem no sistema de perfusão. Os lises celulares podem ser coletados em poços duplicados para proteínas de interesse para determinar se mudanças na expressão proteica e/ou estágios de ativação ocorrem durante o tratamento.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

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Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

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Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

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The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

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